Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
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1. Zellkultur
<ol><li>Pflegen Sie die Zellen in einem befeuchteten 37 °C / 5% CO2-Inkubator und in Kultur mit DMEM, das entweder mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (HeLa- und A431-Zellen) oder RPMI mit 15% FBS (U266B1-Zellen) ergänzt wird. Kultivieren Sie die Zellen, bis sie 70-80% Konfluenz erreichen, dann versuchen Sie, sie zu versuchen und zu passieren oder verwenden Sie sie für die Assays. HINWEIS: Kulturmedien enthielten Phenolrot. Vor der Durchführung der Assays wurde für keine Zelllinie ein Ser...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway:+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention.">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li><li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer.">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li><li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies:+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+(WBMRS).">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).</li><li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign.">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li><li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format.">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).</li><li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors.">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li><li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation.">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling,+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format.">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li><li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+&#947;c-containing+cytokine+receptors.">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through &#947;c-containing cytokine receptors.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li><li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors.">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F:+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays.">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li><li>Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Phosphoproteinanalyse wie Western Blotting und ELISA-basierten Methoden ist der Workflow für einen zellulären THUNDER TR-FRET-Assay einfach und schnell, verwendet eine Probe mit geringem Volumen (15 μL), ist für HTS in einem 384-Well-Format konzipiert und sehr automatisierungsfähig. Das Assay-Protokoll ist flexibel und kann sowohl an Anwendungen mit mittlerem als auch an Anwendungen mit hohem Durchsatz angepasst werden. Assays können entweder mit einem Zwei-Platten-Übert...

Der JAK/STAT-Signalweg spielt eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung zellulärer Reaktionen auf verschiedene Zytokine, Interferone, Wachstumsfaktoren und verwandte Moleküle1,2. Die Bindung dieser Liganden an spezifische Zelloberflächenrezeptoren führt zur Aktivierung von JAKs, die wiederum STAT-Proteine durch Phosphorylierung spezifischer Tyrosinreste aktivieren. Die STAT-Phosphorylierung führt zu ihrer Dimerisierung und Translokation in den Zellkern, wo sie ihre Wirkung auf die Transkription regulierter Zielgene ausüben. Die STAT-Familie besteht aus sieben Mitgliedern: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6. Die Mitglieder spielen eine komplexe und wesentliche Rolle bei der Regulation physiologischer Zellprozesse, einschließlich Proliferation, Differenzierung, Apoptose, Angiogenese und Regulation des Immunsystems. Die abnormale Aktivierung von STAT-Signalwegen ist an vielen menschlichen Krankheiten beteiligt, insbesondere an Krebs und immunbedingten Erkrankungen3,4. Daher ist die Fähigkeit, die Phosphorylierung von STAT-Proteinen in der nativen Zellsignalumgebung zu bewerten, sowohl für die akademische als auch für die Wirkstoffforschung wichtig.
Bis heute sind die konventionellen Methoden zur Messung des intrazellulären phosphorylierten Proteinspiegels, einschließlich STATs, Antikörper-basiert und umfassen Western Blotting, ELISA und Phosphoflow-Zytometrie. Diese heterogenen Methoden sind arbeitsintensiv, zeitaufwendig, fehleranfällig, mit geringem Durchsatz und im Falle von Western Blotting oft unzuverlässig (z. B. Spezifitätsprobleme). Im Gegensatz dazu erfordern homogene Assays weniger experimentelle Schritte, verwenden kleinere Probenvolumina und sind für HTS zugänglich. Es gibt fünf homogene zellbasierte Immunoassay-Plattformen, die kommerziell verfügbar sind und zur quantitativen Überwachung der JAK-abhängigen Phosphorylierung von STATs in Zelllysaten verwendet werden können: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen und Lumit. Jede dieser Plattformen hat ihre Vor- und Nachteile.
SureFire basiert auf der lumineszierenden Sauerstoffkanalisierungstechnologie, die Spender- und Akzeptorperlen verwendet, die beschichtet sind, um speziell ein Paar Antikörper einzufangen, von denen einer biotinyliert ist. In Gegenwart von phosphoryliertem Protein bringen die beiden Antikörper die Spender- und Akzeptorkügelchen in die Nähe und ermöglichen so die Erzeugung eines chemilumineszenten Signals6. Obwohl vielseitig und empfindlich, ist diese Technologie teuer, wird von Biotin im Kulturmedium beeinflusst, ist sehr empfindlich gegenüber Umgebungstemperatur und Licht und erfordert ein spezielles Lesegerät zur Detektion. HTRF und LANCE basieren beide auf der TR-FRET-Technologie, die langlebige lumineszierende Lanthanid-Ionenkomplexe (Europium- oder Terbiumchelate oder Europium-Kryptonat) als Donormoleküle und fernrote Fluorophore als Akzeptormoleküle verwendet7. Wenn zwei proteinspezifische Antikörper, die entweder mit Spender- oder Akzeptormolekülen markiert sind, in die Nähe gebracht werden, findet FRET statt, was zu einer Erhöhung der Akzeptorfluoreszenz und einer Abnahme der Spenderfluoreszenz führt. Diese langlebigen fluoreszierenden Signale können zeitaufgelöst und ratiometrisch gemessen werden, um Assay-Interferenzen zu reduzieren und die Datenqualität zu erhöhen. Weitere Vorteile von TR-FRET sind, dass es nicht lichtempfindlich ist, wiederholte Messwerte ermöglicht und eine lange Signalstabilität aufweist. Während TR-FRET aufgrund seiner Vielseitigkeit, Empfindlichkeit und hohen Robustheit in HTS weit verbreitet ist, sind alle kommerziellen TR-FRET-basierten Assay-Plattformen teuer, wodurch eine breite Akzeptanz in akademischen und kleinen Industrielabors ausgeschlossen wird. Der LanthaScreen-Assay verwendet ebenfalls eine TR-FRET-basierte Auslesung, ist jedoch auf eine entwickelte U2OS-Zelllinie angewiesen, die stabil grün fluoreszierendes Protein (GFP)-STAT1 in Kombination mit einem terbiummarkierten Phospho-spezifischen STAT1-Antikörper exprimiert8. Diese Methode ist nicht nur in Bezug auf die Auswahl an Signalproteinen begrenzt, sondern erfordert auch den Kauf teurer transfizierter Zelllinien, wodurch ihre Anwendbarkeit verringert und die Möglichkeit experimenteller Artefakte erhöht wird. Lumit ist eine generische biolumineszente Immunoassay-Plattform, die sekundäre Antikörper (Anti-Maus und Anti-Kaninchen) verwendet, die chemisch mit den kleinen und großen NanoBit-Untereinheiten von NanoLuc Luciferase9 markiert sind. Die Bindung von zwei primären Antikörpern an das Zielprotein bringt die sekundären Antikörper in die Nähe, um ein aktives Enzym zu bilden, das ein Lumineszenzsignal erzeugt. Während die Lumineszenz im Allgemeinen eine empfindliche und robuste Anzeige ist, schränkt der Bedarf an primären Antikörpern, die in zwei verschiedenen Spezies erhoben werden, die Auswahl für das Assay-Design ein. Darüber hinaus kann die Verwendung von Sekundärantikörpern in komplexen Probenmatrizen anfällig für Assay-Interferenzen sein.
Daher besteht nach wie vor ein Bedarf an einer zuverlässigen, schnellen und dennoch erschwinglichen zellbasierten Assay-Plattform zur Messung einzelner phosphorylierter und totaler STAT-Proteine in einer mit HTS kompatiblen Weise. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurde eine neue zellbasierte Hochdurchsatz-Immunoassay-Plattform entwickelt, die auf einer verbesserten TR-FRET-Technologie (THUNDER) basiert und eine einfache, empfindliche, robuste und kostengünstige Messung von endogen exprimierten intrazellulären Proteinen (phosphoryliert oder vollständig) in Zelllysaten ermöglicht. Die Vorteile dieser Technologie ergeben sich aus der Kombination eines Donor/Akzeptor-FRET-Paares mit außergewöhnlicher spektraler Kompatibilität und TR-FRET-Signal, streng validierten Antikörpern und optimierten Lysepuffern. Diese Assays sind als Sandwich-Immunoassays formatiert und verwenden einen einfachen, dreistufigen Workflow (Abbildung 1). Die Zellen werden zuerst behandelt, um die Proteinphosphorylierung zu modulieren, und dann mit dem spezifischen Lysepuffer, der im Kit bereitgestellt wird, lysiert. Das phosphorylierte oder gesamte STAT-Protein im Zelllysat wird in einem einzelnen Reagenzzugabe- und Inkubationsschritt mit einem Paar fluorophormarkierter Antikörper nachgewiesen, die unterschiedliche Epitope auf dem Zielprotein erkennen (Abbildung 2). Ein Antikörper ist mit einem Europium-Chelat-Donor (Eu-Ab1) markiert, während der zweite Antikörper mit einem weit roten Akzeptorfluorophor (FR-Ab2) markiert ist. Die beiden markierten Antikörper binden an das Protein in Lösung und bringen die beiden Markierungen in die Nähe. Die Anregung des Spenders Europiumchelat bei 320 oder 340 nm löst einen FRET zum Akzeptor aus, der bei 665 nm ein langlebiges TR-FRET-Signal aussendet, das proportional zur Konzentration des Zielproteins (phosphoryliert oder vollständig) im Zelllysat ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Abbildung 1: TR-FRET-Assay-Workflow. Der Workflow besteht aus drei Schritten: Zellbehandlung, Zelllyse und Proteindetektion mit TR-FRET. Beim Zwei-Platten-Assay-Protokoll werden Lysate auf eine weiße 384-Well-Detektionsplatte übertragen, während im One-Plate-Protokoll alle Schritte in derselben weißen 384-Well-Detektionsplatte (All-in-One-Well-Protokoll) durchgeführt werden. Unabhängig vom verwendeten Assay-Protokoll wird der Proteinnachweis im gleichen Gesamtvolumen (20 μL pro Well) durchgeführt. Abkürzung: TR-FRET = zeitaufgelöste Förster-Resonanzenergieübertragung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Abbildung 2: TR-FRET-Sandwich-Immunoassay-Prinzip. Ein Antikörper ist mit dem Europium-Chelat-Donor (Eu-Ab1) und der zweite mit dem tiefroten kleinen Fluorophor-Akzeptor (FR-Ab2) markiert. Die beiden markierten Antikörper binden spezifisch an unterschiedliche Epitope auf dem Zielprotein (phosphoryliert oder vollständig) im Zelllysat, wodurch die beiden Fluorophore nahe beieinander liegen. Die Anregung des Spender-Europiumchelats bei 320 oder 340 nm löst einen FRET vom Donor zu den Akzeptormolekülen aus, die wiederum ein Signal bei 665 nm aussenden. Dieses Signal ist proportional zur Proteinkonzentration im Zelllysat. In Ermangelung des spezifischen Zielproteins sind die Spender- und Akzeptorfluorophore zu weit voneinander entfernt, als dass FRET auftreten könnte. Abkürzungen: FRET = Förster-Resonanzenergieübertragung; TR-FRET = zeitaufgelöster FRET; Ab = Antikörper; FR = far-red; EU - Europiumchelat; P = Phosphorylierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Hier werden detaillierte Protokolle bereitgestellt, um in einem 384-Well-Format die intrazellulären Spiegel von phosphoryliertem STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) und STAT6 (Y641) zusammen mit Gesamt-STAT1, STAT3, STAT5 und STAT6 in Zelllysaten aus adhärenten oder Suspensionszellen mit der THUNDER TR-FRET-Plattform zu messen. Diese Protokolle definieren Schritte für die Zellbehandlung, Lyse und TR-FRET-basierte Zielproteindetektion unter Verwendung eines Zwei-Platten-Transferprotokolls oder eines Ein-Platten-All-in-One-Well-Protokolls. Diese zellbasierten Assays werden zur Bestimmung des pharmakologischen Profils bekannter Aktivatoren und Inhibitoren des JAK/STAT-Signalwegs eingesetzt. Die Robustheit und Eignung ausgewählter Assays für HTS wird nachgewiesen. Schließlich werden Schlüsselexperimente zur Assay-Optimierung sowie Empfehlungen für die Assay-Fehlerbehebung diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

Der Signalweg Januskinase (JAK)/Signalwandler und Aktivator der Transkription (STAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung zellulärer Reaktionen auf Zytokine und Wachstumsfaktoren. STAT-Proteine werden durch Tyrosinphosphorylierung aktiviert, die hauptsächlich durch JAKs vermittelt wird. Die abnormale Aktivierung von STAT-Signalwegen ist an vielen menschlichen Krankheiten beteiligt, insbesondere an Krebs und immunbedingten Erkrankungen. Daher ist die Fähigkeit, die Phosphorylierung von STAT-Proteinen innerhalb der nativen Zellsignalumgebung zu überwachen, sowohl für die akademische als auch für die Arzneimittelforschung wichtig. Zu den traditionellen Assay-Formaten, die zur Quantifizierung phosphorylierter STAT-Proteine zur Verfügung stehen, gehören Western Blotting und der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Diese heterogenen Methoden sind arbeitsintensiv, mit geringem Durchsatz und im Falle von Western Blotting oft nicht zuverlässig (spezifisch). Homogene (no-wash) Methoden sind verfügbar, bleiben aber teuer. 
Hier werden detaillierte Protokolle für die sensitive, robuste und kostengünstige Messung in einem 384-Well-Format von endogenen Konzentrationen von phosphoryliertem STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) und STAT6 (Y641) in Zelllysaten aus adhärenten oder Suspensionszellen unter Verwendung der neuartigen THUNDER zeitaufgelösten Förster-Resonanzenergietransferplattform (TR-FRET) bereitgestellt. Der Workflow für den zellulären Assay ist einfach, schnell und für das Hochdurchsatz-Screening (HTS) ausgelegt. Das Assay-Protokoll ist flexibel, verwendet eine Probe mit geringem Volumen (15 μL), erfordert nur einen Reagenzzugabeschritt und kann an Anwendungen mit niedrigem Durchsatz und hohem Durchsatz angepasst werden. Jeder Phospho-STAT-Sandwich-Immunoassay wird unter optimierten Bedingungen mit bekannten Agonisten und Inhibitoren validiert und generiert die erwarteten pharmakologischen und Z'-Faktor-Werte. Da TR-FRET-Assays ratiometrisch sind und keine Waschschritte erfordern, bieten sie eine viel bessere Reproduzierbarkeit als herkömmliche Ansätze. Zusammen bietet diese Suite von Assays neue kostengünstige Werkzeuge für eine umfassendere Analyse spezifischer phosphorylierter STAT-Proteine nach der Zellbehandlung und das Screening und die Charakterisierung spezifischer und selektiver Modulatoren des JAK/STAT-Signalwegs.

Jeder THUNDER TR-FRET-Assay wurde pharmakologisch validiert, indem adhärente (HeLa oder A431) oder Suspensionszellen (U266B1) mit JAK/STAT-Signalweg-spezifischen Aktivatoren oder Inhibitoren behandelt und dann gegebenenfalls die Konzentrationen spezifischer phosphorylierter und Gesamt-STATs gemessen wurden. Die Assays wurden im 384-Well-Format unter Verwendung des Zwei-Platten-Transferprotokolls und voroptimierter Assay-Bedingungen durchgeführt. Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, <stro...

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Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Zeitaufgelöste Förster-Resonanzenergietransfer-Zell-basierte Assay-Protokolle werden für die einfache, spezifische, sensitive und robuste Quantifizierung von endogenen phosphorylierten Signalwandlern und Aktivatoren der Transkription (STAT) 1/3/4/5/6-Proteinen in Zelllysaten im 384-Well-Format beschrieben.

Zeitaufgelöste Förster-Resonanz-Energietransfer-Assays zur Messung von endogenen phosphorylierten STAT-Proteinen in menschlichen Zellen

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Die TR-FRET-basierten Assays bieten neue kostengünstige Werkzeuge für das Screening und die pharmakologische Charakterisierung spezifischer und selektiver Modulatoren der JAK/STAT-Signalwege. Diese Technik ist viel einfacher, schneller, reproduzierbar und robust als herkömmliche Methoden wie Western Blot und ELISA. Es sind keine Waschschritte erforderlich und Reagenzien werden in einem einzigen Schritt zugegeben.Diese Immunoassay-Plattform kann leicht auf andere Zellsignalproteine angewendet werden, sofern spezifische Antikörper verfügbar sind. Um reproduzierbare Assays zu entwerfen, müssen Sie gute Zellkulturpraktiken anwenden und Standardarbeitsanweisungen festlegen. Darüber hinaus müssen Sie die Zellkultur- und Behandlungsbedingungen sorgfältig optimieren.Das Verfahren wird von Genevieve Chatel, einer Wissenschaftlerin aus unserem Labor, demonstriert. Zu Beginn kultivieren HeLa- und A431-Zellen in einem befeuchteten 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator mit DMEM, ergänzt mit 10% FBS. Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, trypsinisieren Sie sie und entweder passieren oder verwenden Sie sie für Assays.Um den Assay durchzuführen, dosieren Sie 50 Mikroliter Zellen in der voroptimierten Dichte in eine 96-Well-Gewebekultur-behandelte Platte im entsprechenden Kulturmedium und inkubieren Sie sie dann über Nacht in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator. Bereiten Sie am folgenden Tag eine zweifache und vierfache Verdünnungsreihe der Testverbindungen vor, indem Sie die Verbindung in einem serumfreien Medium über 12 Vertiefungen einer Polypropylen-96-Well-Platte seriell verdünnen. Für die Zellstimulation fügen Sie 50 Mikroliter serumfreies Medium hinzu, das den Simulator in einer 2-fachen Konzentration enthält, und inkubieren Sie die Zellen für die voroptimierte Zeit entweder bei Raumtemperatur oder 37 Grad.Für die Zellinhibition 25 Mikroliter serumfreies Medium, das den Inhibitor in einer 4-fachen Konzentration enthält, hinzufügen und die Zellen für die voroptimierte Zeit entweder bei Raumtemperatur oder 37 Grad inkubieren, dann 25 Mikroliter serumfreies Medium, das den Stimulator in einer 4-fachen Konzentration enthält, hinzufügen und für die voroptimierte Zeit inkubieren. Als nächstes, um die Zellen zu lysieren, bereiten Sie den 1X ergänzten Lysepuffer vor und fügen Sie ihm einen Phosphatase-Inhibitor-Cocktail hinzu. Nach vorsichtigem Entfernen und Entsorgen des Zellkulturmediums sofort 50 Mikroliter des vorbereiteten 1X ergänzten Lysepuffers zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln mit mäßigem Rühren inkubieren.Für den TR-FRET-Nachweis bereiten Sie die 4X-Antikörper-Detektionsmischung im 1X-Nachweispuffer vor, dann die EUAB1- und FRAB2-Antikörperlösungen sowie die EUAB3- und FRAB4-Antikörperlösungen im 1X-Nachweispuffer. Mischen Sie schließlich vorverdünntes EUAB1 mit vorverdünntem FRAB2 zum Nachweis von Phosphoprotein und vorverdünntem EUAB3 und vorverdünntem FRAB4 zum Nachweis von Gesamtprotein. Dann pipettieren Sie vorsichtig 15 Mikroliter des Zelllysats von der 96-Well-Kulturplatte zu einer Vertiefung einer weißen, 384-Well-Mikroplatte mit geringem Volumen.Als nächstes fügen Sie 15 Mikroliter des Positivkontrolllysats und 15 Mikroliter 1X Lysepuffer als Negativkontrolle hinzu, um die Assay-Bohrlöcher zu trennen. Zu Vertiefungen, die 15 Mikroliter des Lysats enthalten, fügen Sie fünf Mikroliter der entsprechenden 4X-Antikörper-Detektionsmischung hinzu, um das Phosphoprotein oder das Gesamtprotein nachzuweisen. Nachdem Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler bedeckt haben, inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde bis über Nacht, abhängig vom Assay-Kit.Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie den selbstklebenden Plattenversiegeler und lesen Sie die Platte auf einem TR-FRET-kompatiblen Mikroplattenleser. Die Ergebnisse von TR-FRET-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung von Phospho-STAT1 mit Gesamt-STAT1 und Phospho-STAT4 in U266B1-Zellen zusammen mit Phospho-STAT5 mit Gesamt-STAT5 in A431-Zellen werden mithilfe von Konzentrations-Response-Kurven dargestellt. In ähnlicher Weise werden TR-FRET-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung von Phospho-STAT3 und Gesamt-STAT3 und Phospho-STAT6 und Gesamt-STAT6 in HeLa-Zellen mithilfe von Konzentrationsantwortkurven dargestellt.Insgesamt zeigten alle Assays robuste TR-FRET-Signale, große Dynamikbereiche, geringe Schwankungen des Inter-Well-Koeffizienten und akzeptable Signal-Hintergrund-Verhältnisse. Die Behandlung von Zellen mit JAK-Aktivatoren, Interferon alfa-2B und IL-4 und EGF zeigte den erwarteten konzentrationsabhängigen Anstieg der STAT-Phosphorylierung bei spezifischen Tyrosinresten, während die entsprechenden Gesamt-STAT-Proteine stabil blieben. Sowohl JAK-Inhibitor als auch Erlotinib hemmten die entsprechenden Phospho-STAT-Spiegel konzentrationsabhängig.Die Ergebnisse der Phospho-STAT4-Stimulation durch Interferon alfa-2B in einer Suspensionszelllinie oder der Phospho-STAT6-Stimulation durch IL-4 in einer Adhärenzzelllinie unter Verwendung des Ein-Platten-Protokolls stimmten mit denen überein, die mit dem Zwei-Platten-Protokoll erzielt wurden, und zeigten somit eine erfolgreiche Anpassungsfähigkeit eines Zwei-Platten-Transferprotokolls an ein Ein-Platten-All-in-One-Well-Protokoll. Die Ergebnisse der Intraplattenvariabilitätsstudie für den Phospho-STAT1-Assay unter Verwendung einer Suspensionszelllinie und den Phospho-STAT3-Assay unter Verwendung einer Adhärenzzelllinie zeigen die Robustheit dieser Phospho-STAT-Assays für HTS-Anwendungen. Es ist wichtig, den Lysepuffer mit dem Phosphatase-Inhibitor-Cocktail zu ergänzen, um eine Dephosphorylierung der phosphorylierten Proteine aus aktiver Phosphatase zu verhindern, die im Ganzzellextrakt vorhanden ist.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...