Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
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कोई नहीं।

1. सेल संस्कृति
<ol><li>एक humidified 37 °C/5% CO2 इनक्यूबेटर और संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखें या तो DMEM के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (HeLa और A431 कोशिकाओं) या RPMI 15% FBS (U266B1 कोशिकाओं) के साथ पूरक के साथ पूरक। कोशिकाओं को तब तक ...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway:+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention.">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li><li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer.">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li><li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies:+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+(WBMRS).">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).</li><li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign.">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li><li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format.">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).</li><li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors.">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li><li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation.">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling,+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format.">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li><li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+&#947;c-containing+cytokine+receptors.">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through &#947;c-containing cytokine receptors.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li><li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors.">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F:+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays.">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li><li>Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

इस तरह के पश्चिमी blotting और एलिसा आधारित तरीकों के रूप में phosphoprotein विश्लेषण के लिए पारंपरिक तरीकों की तुलना में, एक थंडर TR-FRET सेलुलर परख के लिए वर्कफ़्लो सरल और तेज है, एक कम मात्रा के नमूने (15 μL) का उपयोग करता है, ?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

जेनस किनेज (जेएके)/सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन (एसटीएटी) सिग्नलिंग पाथवे के उत्प्रेरक साइटोकिन्स और विकास कारकों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। स्टेट प्रोटीन मुख्य रूप से जेएके द्वारा मध्यस्थता टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन द्वारा सक्रिय होते हैं। स्टेट सिग्नलिंग मार्गों की असामान्य सक्रियता कई मानव रोगों, विशेष रूप से कैंसर और प्रतिरक्षा से संबंधित स्थितियों में फंस गई है। इसलिए, देशी सेल सिग्नलिंग वातावरण के भीतर स्टेट प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन की निगरानी करने की क्षमता अकादमिक और दवा खोज अनुसंधान दोनों के लिए महत्वपूर्ण है। पारंपरिक परख फॉस्फोराइलेटेड STAT प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपलब्ध प्रारूपों पश्चिमी blotting और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) शामिल हैं. ये विषम तरीके श्रम-गहन, कम-थ्रूपुट हैं, और अक्सर पश्चिमी ब्लोटिंग के मामले में विश्वसनीय (विशिष्ट) नहीं होते हैं। सजातीय (नो-वॉश) विधियां उपलब्ध हैं लेकिन महंगी रहती हैं। 
यहां, विस्तृत प्रोटोकॉल संवेदनशील, मजबूत, और लागत प्रभावी माप के लिए फॉस्फोराइलेटेड STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699), और STAT6 (Y641) के अंतर्जात स्तरों के अंतर्जात स्तरों के 384-अच्छी तरह से प्रारूप में प्रदान किए जाते हैं, जो उपन्यास थंडर टाइम-हल किए गए Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (TR-FRET) प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके अनुयायी या निलंबन कोशिकाओं से सेल लिसेट में हैं। सेलुलर परख के लिए वर्कफ़्लो सरल, तेजी से है, और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए डिज़ाइन किया गया है। परख प्रोटोकॉल लचीला है, एक कम मात्रा के नमूने (15 μL) का उपयोग करता है, केवल एक अभिकर्मक इसके अलावा कदम की आवश्यकता है, और कम थ्रूपुट और उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रत्येक फॉस्फो-स्टेट सैंडविच इम्यूनोएसे को ज्ञात एगोनिस्ट और अवरोधकों के साथ अनुकूलित परिस्थितियों में मान्य किया जाता है और अपेक्षित फार्माकोलॉजी और जेड-फैक्टर मूल्यों को उत्पन्न करता है। चूंकि टीआर-फ्रेट एसेस रेशियोमेट्रिक हैं और उन्हें धोने के चरणों की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए वे पारंपरिक दृष्टिकोणों की तुलना में बहुत बेहतर पुनरुत्पादकता प्रदान करते हैं। साथ में, assays का यह सूट सेल उपचार के बाद विशिष्ट फॉस्फोराइलेटेड स्टेट प्रोटीन के अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए नए लागत प्रभावी उपकरण प्रदान करता है और JAK / STAT सिग्नलिंग मार्ग के विशिष्ट और चयनात्मक मॉड्यूलेटरों की स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन करता है।

प्रत्येक थंडर टीआर-FRET परख औषधीय रूप से अनुयायी (HeLa या A431) या निलंबन कोशिकाओं (U266B1) JAK / STAT Pathway-विशिष्ट activators या inhibitors के साथ इलाज द्वारा मान्य किया गया था और फिर विशिष्ट फॉस्फोराइलेटेड और कुल STATs के स्तर को मापने, जब ल?...

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Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

समय हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण सेल आधारित परख प्रोटोकॉल सरल, विशिष्ट, संवेदनशील, और अंतर्जात फॉस्फोराइलेटेड सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन (STAT) के उत्प्रेरक के मजबूत परिमाणीकरण के लिए वर्णित कर रहे हैं 1/3/4/5/6 एक 384 अच्छी तरह से प्रारूप में सेल lysates में प्रोटीन.

मानव कोशिकाओं में अंतर्जात फॉस्फोराइलेटेड स्टेट प्रोटीन के मापन के लिए समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण Assays

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

TR-FRET आधारित assays JAK / STAT सिग्नलिंग मार्गों के विशिष्ट और चयनात्मक मॉड्यूलेटरों की स्क्रीनिंग और औषधीय लक्षण वर्णन के लिए नए लागत प्रभावी उपकरण प्रदान करते हैं। यह तकनीक पश्चिमी धब्बा और एलिसा जैसे पारंपरिक तरीकों की तुलना में बहुत आसान, तेजी से, पुन: प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत है। कोई धोने के चरणों की आवश्यकता नहीं है और अभिकर्मकों को एक ही चरण में जोड़ा जाता है।इस immunoassay मंच आसानी से अन्य सेल सिग्नलिंग प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है बशर्ते विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हों। पुन: प्रस्तुत करने योग्य assays डिजाइन करने के लिए, आप अच्छी सेल संस्कृति प्रथाओं का उपयोग करें और मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं की स्थापना करनी चाहिए। इसके अलावा, आपको सेल संस्कृति और उपचार की स्थिति को सावधानीपूर्वक अनुकूलित करना चाहिए।प्रक्रिया का प्रदर्शन Genevieve Chatel, हमारी प्रयोगशाला से एक वैज्ञानिक होगा. शुरू करने के लिए, संस्कृति हेला और A431 कोशिकाओं में एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में DMEM का उपयोग कर 10% FBS के साथ पूरक. जब कोशिकाएं 70 से 80% संगम तक पहुंचती हैं, तो उन्हें ट्रिप्सिनाइज़ करें और या तो पारित करें या उन्हें assays के लिए उपयोग करें।परख प्रदर्शन करने के लिए, उचित संस्कृति माध्यम में 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेट में पूर्व-अनुकूलित घनत्व पर कोशिकाओं के 50 माइक्रोलीटर वितरित करें, फिर उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में रातभर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, एक पॉलीप्रोपाइलीन 96-वेल प्लेट के 12 कुओं में सीरम-मुक्त माध्यम में यौगिक को क्रमिक रूप से पतला करके परीक्षण यौगिकों की मध्यवर्ती दो गुना और चार गुना कमजोर पड़ने की श्रृंखला तैयार करें। सेल उत्तेजना के लिए, सीरम-मुक्त माध्यम के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें 2X एकाग्रता पर सिम्युलेटर होता है और कमरे के तापमान या 37 डिग्री पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।सेल निषेध के लिए, सीरम-मुक्त माध्यम के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें 4एक्स एकाग्रता पर अवरोधक होता है और कमरे के तापमान या 37 डिग्री पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, फिर सीरम-मुक्त माध्यम के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें 4एक्स एकाग्रता पर उत्तेजक होता है और पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट होता है। अगला, कोशिकाओं को लाइस करने के लिए, 1X पूरक लाइसिस बफर तैयार करें और इसमें फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल जोड़ें। सेल कल्चर माध्यम को सावधानीपूर्वक हटाने और छोड़ने के बाद, तुरंत तैयार किए गए 1X पूरक लाइसिस बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और मध्यम आंदोलन के साथ मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।टीआर-फ्रेट डिटेक्शन के लिए, 1एक्स डिटेक्शन बफर में 4एक्स एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स तैयार करें, फिर EUAB1 और FRAB2 एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, साथ ही साथ 1X डिटेक्शन बफर में EUAB3 और FRAB4 एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। अंत में, कुल प्रोटीन का पता लगाने के लिए फॉस्फोप्रोटीन और पूर्व-पतला EUAB3 और पूर्व-पतला FRAB4 का पता लगाने के लिए पूर्व-पतला FRAB2 के साथ पूर्व-पतला EUAB1 मिश्रण करें। फिर ध्यान से सेल लिसेट के 15 माइक्रोलीटर को 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट से एक सफेद कम मात्रा वाले 384-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कुएं में पिपेट करें।अगला, सकारात्मक नियंत्रण lysate के 15 microliters और परख कुओं को अलग करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1X lysis बफर के 15 microliters जोड़ें. लिसेट के 15 माइक्रोलीटर वाले कुओं के लिए, फॉस्फोप्रोटीन या कुल प्रोटीन का पता लगाने के लिए संबंधित 4एक्स एंटीबॉडी डिटेक्शन मिश्रण के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। एक प्लेट सीलर के साथ प्लेट को कवर करने के बाद, परख किट के आधार पर रात भर के लिए एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इसे इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, चिपकने वाली प्लेट सीलर को हटा दें और एक टीआर-फ्रेट संगत माइक्रोप्लेट रीडर पर प्लेट पढ़ें। TR-FRET assays का पता लगाने और कुल STAT1 के साथ फॉस्फो-STAT1 के परिमाणीकरण के लिए परिणाम और U266B1 कोशिकाओं में फॉस्फो-STAT4 के साथ-साथ A431 कोशिकाओं में कुल STAT5 के साथ फॉस्फो-STAT5 एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता का उपयोग करके प्रतिनिधित्व किया जाता है। इसी तरह, TR-FRET assays का पता लगाने और फॉस्फो-STAT3 और कुल STAT3 और फॉस्फो-STAT6 और HeLa कोशिकाओं में कुल STAT6 का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता का उपयोग करके प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।कुल मिलाकर, सभी assays मजबूत TR-FRET संकेतों, व्यापक गतिशील श्रेणियों, कम अंतर अच्छी तरह से गुणांक भिन्नता, और स्वीकार्य संकेत-से-पृष्ठभूमि अनुपात दिखाया. जेएके एक्टिवेटर, इंटरफेरॉन अल्फा -2 बी और आईएल -4 और ईजीएफ के साथ कोशिकाओं के उपचार ने विशिष्ट टायरोसिन अवशेषों पर स्टेट फॉस्फोराइलेशन में प्रत्याशित एकाग्रता-निर्भर वृद्धि दिखाई, जबकि संबंधित कुल स्टेट प्रोटीन स्थिर रहे। JAK अवरोधक और erlotinib दोनों ने एकाग्रता-निर्भर तरीके से संबंधित फॉस्फो-स्टेट स्तरों को बाधित किया।एक निलंबन सेल लाइन में इंटरफेरॉन अल्फा -2 बी या एक-प्लेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक अनुपालन सेल लाइन में फॉस्फो-स्टेट 6 उत्तेजना द्वारा फॉस्फो-एसटीएटी 4 उत्तेजना के परिणाम दो-प्लेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किए गए लोगों के अनुरूप थे, इस प्रकार एक-प्लेट ऑल-इन-वन वेल प्रोटोकॉल के लिए दो-प्लेट ट्रांसफर प्रोटोकॉल की सफल अनुकूलन क्षमता दिखा रहे थे। एक निलंबन सेल लाइन का उपयोग कर phospho-STAT1 परख के लिए इंट्रा-प्लेट परिवर्तनशीलता अध्ययन के परिणाम और एक पालन सेल लाइन का उपयोग कर फॉस्फो-STAT3 परख एचटीएस अनुप्रयोगों के लिए इन फॉस्फो-STAT assays की मजबूती का प्रदर्शन करते हैं। पूरे सेल निकालने में मौजूद सक्रिय फॉस्फेट से फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन के डिफॉस्फोराइलेशन को रोकने के लिए फॉस्फेट इनहिबिटर कॉकटेल के साथ लाइसिस बफर को पूरक करना आवश्यक है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

आंतरिक रूप से बेक़ायदा प्रोटीन के एकाधिक Phosphorylations की पहचान के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी

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अभिव्यक्ति, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण, और फ्जाइम परख के Fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

लिपिड-बाउंड प्रोटीन और एलर्जेंस से एंडोजेनस लिगांड को हटाना और प्रतिस्थापन

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...