Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells at JoVE.com

1. Coltura cellulare
<ol><li>Mantenere le cellule in un incubatore e coltura a CO2 umidificata a 37 °C / 5% con DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) (cellule HeLa e A431) o RPMI integrato con il 15% fbS (cellule U266B1). Coltiva le cellule fino a quando non raggiungono il 70-80% di confluenza, quindi tripsinilizzale e passale o usale per i test. NOTA: i terreni di coltura contenevano rosso fenolo. Nessuna fame sierica è stata condotta per nessuna linea cellulare prima di condurre i test.<...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway:+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention.">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li><li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer.">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li><li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies:+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+(WBMRS).">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).</li><li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign.">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li><li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format.">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).</li><li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors.">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li><li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation.">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling,+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format.">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li><li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+&#947;c-containing+cytokine+receptors.">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through &#947;c-containing cytokine receptors.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li><li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors.">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F:+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays.">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li><li>Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

Rispetto ai metodi convenzionali per l'analisi delle fosfoproteine come il western blotting e i metodi basati su ELISA, il flusso di lavoro per un test cellulare THUNDER TR-FRET è semplice e veloce, utilizza un campione a basso volume (15 μL), è progettato per HTS in un formato a 384 pozzetti ed è altamente suscettibile all'automazione. Il protocollo di analisi è flessibile e può essere facilmente adattato ad applicazioni a throughput medio e alto. I saggi possono essere eseguiti utilizzando un protocollo di trasfe...

La via di segnalazione JAK/STAT svolge un ruolo chiave nel mediare le risposte cellulari a diverse citochine, interferoni, fattori di crescita e molecole correlate1,2. Il legame di questi ligandi a specifici recettori della superficie cellulare provoca l'attivazione di JAK, che a loro volta attivano le proteine STAT mediante fosforilazione di specifici residui di tirosina. La fosforilazione STAT provoca la loro dimerizzazione e traslocazione nel nucleo, dove esercitano il loro effetto sulla trascrizione dei geni bersaglio regolati. La famiglia STAT è composta da sette membri: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b e STAT6. I membri svolgono un ruolo complesso ed essenziale nella regolazione dei processi cellulari fisiologici, tra cui proliferazione, differenziazione, apoptosi, angiogenesi e regolazione del sistema immunitario. L'attivazione anomala delle vie di segnalazione STAT è implicata in molte malattie umane, in particolare il cancro e le condizioni immuno-correlate3,4. Pertanto, la capacità di valutare la fosforilazione della proteina STAT all'interno dell'ambiente di segnalazione cellulare nativo è importante sia per la ricerca accademica che per la scoperta di farmaci.
Ad oggi, i metodi convenzionali utilizzati per misurare i livelli di proteine fosforilate intracellulari, compresi gli ST, sono basati su anticorpi e includono western blotting, ELISA e citometria a fosfoflusso. Questi metodi eterogenei sono laboriosi, dispendiosi in termini di tempo, soggetti a errori, a bassa produttività e spesso inaffidabili (ad esempio, problemi di specificità) nel caso del western blotting5. Al contrario, i saggi omogenei richiedono meno passaggi sperimentali, utilizzano volumi di campione più piccoli e sono suscettibili di HTS. Esistono cinque piattaforme di immunodosaggio omogenee basate su cellule disponibili in commercio che possono essere utilizzate per monitorare quantitativamente la fosforilazione JAK-dipendente degli ST nei lisati cellulari: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen e Lumit. Ognuna di queste piattaforme ha i suoi vantaggi e svantaggi.
SureFire si basa sulla tecnologia di canalizzazione dell'ossigeno luminescente, che utilizza perline di donatore e accettore rivestite per catturare specificamente un paio di anticorpi, uno dei quali è biotinilato. In presenza di proteine fosforilate, i due anticorpi portano le perle del donatore e dell'accettore nelle immediate vicinanze, consentendo la generazione di un segnale chemiluminescente6. Sebbene versatile e sensibile, questa tecnologia è costosa, è influenzata dalla biotina nel terreno di coltura, è molto sensibile alla temperatura ambiente e alla luce e richiede un lettore speciale per il rilevamento. HTRF e LANCE sono entrambi basati sulla tecnologia TR-FRET che utilizza complessi ioni di lantanidi luminescenti di lunga durata (chelati di europio o terbio o criptato di europio) come molecole donatrici e fluorofori rosso lontano come molecole accettori7. Quando due anticorpi protein-specifici etichettati con molecole donatori o accettori vengono portati nelle immediate vicinanze, si verifica FRET, causando un aumento della fluorescenza dell'accettore e una diminuzione della fluorescenza del donatore. Questi segnali fluorescenti di lunga durata possono essere misurati in modo tempo e raziometrico per ridurre le interferenze del test e aumentare la qualità dei dati. Altri vantaggi di TR-FRET sono che non è sensibile alla luce, consente letture ripetute e presenta una lunga stabilità del segnale. Mentre TR-FRET è ampiamente implementato in HTS grazie alla sua versatilità, sensibilità e elevata robustezza, tutte le piattaforme di analisi commerciali basate su TR-FRET sono costose, precludendo così la sua ampia adozione in laboratori accademici e piccoli laboratori industriali. Il test LanthaScreen utilizza anche una lettura basata su TR-FRET, ma si basa su una linea cellulare U2OS ingegnerizzata che esprime stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP)-STAT1 combinata con un anticorpo STAT1 fosfo-specifico marcato con terbio8. Oltre ad essere limitato in termini di scelta delle proteine di segnalazione, questo metodo richiede l'acquisto di costose linee cellulari trasfettate, riducendone l'applicabilità e aumentando la possibilità di artefatti sperimentali. Lumit è una piattaforma di immunodosaggio bioluminescente generico che utilizza anticorpi secondari (anti-topo e anti-coniglio) chimicamente etichettati con le piccole e grandi subunità NanoBit di NanoLuc Luciferase9. Il legame di due anticorpi primari alla proteina bersaglio porta gli anticorpi secondari in prossimità per formare un enzima attivo che genera un segnale di luminescenza. Mentre la luminescenza è generalmente una lettura sensibile e robusta, il requisito di anticorpi primari allevati in due specie diverse limita le scelte per la progettazione del saggio. Inoltre, l'uso di anticorpi secondari in matrici di campioni complessi può essere soggetto a interferenze di analisi.
Pertanto, esiste ancora la necessità di una piattaforma di analisi basata su cellule affidabile, rapida ma conveniente per misurare le singole proteine STAT fosforilate e totali in modo compatibile con HTS. Per rispondere a questa esigenza, è stata sviluppata una nuova piattaforma di analisi immunologica basata su cellule ad alto rendimento basata su una tecnologia TR-FRET avanzata (THUNDER) e progettata per consentire una misurazione semplice, sensibile, robusta ed economica delle proteine intracellulari espresse endogenamente (fosforilate o totali) nei lisati cellulari. I vantaggi di questa tecnologia derivano dalla combinazione di una coppia FRET donatore/accettore che presenta un'eccezionale compatibilità spettrale e un segnale TR-FRET, anticorpi rigorosamente convalidati e tamponi di lisi ottimizzati. Questi test sono formattati come test immunologici sandwich e utilizzano un flusso di lavoro semplice in tre fasi (Figura 1). Le cellule vengono prima trattate per modulare la fosforilazione proteica e poi lisate con lo specifico tampone di lisi fornito nel kit. La proteina STAT fosforilata target o totale nel lisato cellulare viene rilevata in una singola fase di aggiunta e incubazione del reagente con una coppia di anticorpi marcati con fluoroforo che riconoscono epitopi distinti sulla proteina bersaglio (Figura 2). Un anticorpo è etichettato con un donatore di chelato di europio (Eu-Ab1), mentre il secondo anticorpo è etichettato con un fluoroforo accettore rosso lontano (FR-Ab2). I due anticorpi marcati si legano alla proteina in soluzione, portando le due etichette nelle immediate vicinanze. L'eccitazione del donatore chelato di europio a 320 o 340 nm innesca un FRET all'accettore, che emette un segnale TR-FRET di lunga durata a 665 nm proporzionale alla concentrazione di proteina bersaglio (fosforilata o totale) nel lisato cellulare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro del saggio TR-FRET. Il flusso di lavoro consiste in tre fasi: trattamento cellulare, lisi cellulare e rilevamento delle proteine utilizzando TR-FRET. Nel protocollo di analisi a due piastre, i lisati vengono trasferiti su una piastra di rilevamento bianca a 384 pozzetti, mentre nel protocollo a una piastra, tutti i passaggi sono condotti nella stessa piastra di rilevamento bianca a 384 pozzetti (protocollo all-in-one-well). Indipendentemente dal protocollo di analisi utilizzato, il rilevamento delle proteine viene eseguito nello stesso volume totale (20 μL per pozzetto). Abbreviazione: TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Figura 2: Principio del test immunologico sandwich TR-FRET. Un anticorpo è etichettato con il donatore di chelato di europio (Eu-Ab1) e il secondo con l'accettore di fluoroforo piccolo rosso lontano (FR-Ab2). I due anticorpi marcati si legano specificamente a epitopi distinti sulla proteina bersaglio (fosforilata o totale) nel lisato cellulare, portando i due fluorofori nelle immediate vicinanze. L'eccitazione del donatore chelato di europio a 320 o 340 nm innesca un FRET dal donatore alle molecole accettori, che a loro volta emettono un segnale a 665 nm. Questo segnale è proporzionale alla concentrazione di proteine nel lisato cellulare. In assenza della proteina bersaglio specifica, i fluorofori donatore e accettore sono troppo distanti l'uno dall'altro perché si verifichi FRET. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; TR-FRET = FRET risolto nel tempo; Ab = anticorpo; FR = rosso lontano; Eu - Chelato di europio; P = fosforilazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Qui vengono forniti protocolli dettagliati per misurare, in un formato a 384 pozzetti, i livelli intracellulari di STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641), insieme a STAT1, STAT3, STAT5 e STAT6 totali, in lisati cellulari da cellule aderenti o in sospensione utilizzando la piattaforma THUNDER TR-FRET. Questi protocolli definiscono i passaggi per il trattamento cellulare, la lisi e il rilevamento di proteine bersaglio basate su TR-FRET utilizzando un protocollo di trasferimento a due piastre o un protocollo all-in-one-well a una piastra. Questi saggi basati su cellule sono applicati per determinare il profilo farmacologico di attivatori e inibitori noti della via JAK/STAT. La robustezza e l'idoneità dei saggi selezionati per HTS sono dimostrate. Infine, vengono discussi esperimenti chiave per l'ottimizzazione del test, insieme a raccomandazioni per la risoluzione dei problemi del test.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

La via di segnalazione Janus chinasi (JAK)/trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione (STAT) svolge un ruolo cruciale nel mediare le risposte cellulari alle citochine e ai fattori di crescita. Le proteine STAT sono attivate dalla fosforilazione tirosina mediata principalmente dai JAB. L'attivazione anomala delle vie di segnalazione STAT è implicata in molte malattie umane, in particolare il cancro e le condizioni immuno-correlate. Pertanto, la capacità di monitorare la fosforilazione della proteina STAT all'interno dell'ambiente di segnalazione cellulare nativo è importante sia per la ricerca accademica che per la scoperta di farmaci. I formati di analisi tradizionali disponibili per quantificare le proteine STAT fosforilate includono il western blotting e il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA). Questi metodi eterogenei sono laboriosi, a bassa produttività e spesso non affidabili (specifici) nel caso del western blotting. Sono disponibili metodi omogenei (senza lavaggio) ma rimangono costosi. 
Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la misurazione sensibile, robusta ed economica in un formato a 384 pozzetti di livelli endogeni di STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641) in lisati cellulari da cellule aderenti o in sospensione utilizzando la nuova piattaforma THUNDER time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET). Il flusso di lavoro per il test cellulare è semplice, veloce e progettato per lo screening ad alto rendimento (HTS). Il protocollo di analisi è flessibile, utilizza un campione a basso volume (15 μL), richiede una sola fase di aggiunta del reagente e può essere adattato ad applicazioni a bassa produttività e ad alta produttività. Ogni test immunologico sandwich fosfo-STAT viene convalidato in condizioni ottimizzate con agonisti e inibitori noti e genera i valori attesi di farmacologia e fattore Z. Poiché i saggi TR-FRET sono raziometrici e non richiedono passaggi di lavaggio, forniscono una riproducibilità molto migliore rispetto agli approcci tradizionali. Insieme, questa suite di saggi fornisce nuovi strumenti economici per un'analisi più completa di specifiche proteine STAT fosforilate dopo il trattamento cellulare e lo screening e la caratterizzazione di modulatori specifici e selettivi della via di segnalazione JAK / STAT.

Ogni test THUNDER TR-FRET è stato validato farmacologicamente trattando cellule aderenti (HeLa o A431) o in sospensione (U266B1) con attivatori o inibitori specifici della via JAK/STAT e quindi misurando i livelli di specifiche ST fosforilate e totali, se applicabile. I saggi sono stati condotti in formato 384 pozzetti utilizzando il protocollo di trasferimento a due piastre e condizioni di analisi pre-ottimizzate. La Figura 3, la Figura 4, <strong class="xfig"...

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Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

I protocolli di analisi basati su cellule di trasferimento di energia di risonanza di Förster risolti nel tempo sono descritti per la quantificazione semplice, specifica, sensibile e robusta del trasduttore di segnale fosforilato endogeno e dell'attivatore della trascrizione (STAT) 1/3/4/5/6 proteine in lisati cellulari in un formato a 384 pozzetti.

Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

I saggi basati su TR-FRET forniscono nuovi strumenti economicamente vantaggiosi per lo screening e la caratterizzazione farmacologica di modulatori specifici e selettivi delle vie di segnalazione JAK/STAT. Questa tecnica è molto più semplice, rapida, riproducibile e robusta rispetto ai metodi convenzionali come Western blot ed ELISA. Non sono necessarie fasi di lavaggio e i reagenti vengono aggiunti in un unico passaggio.Questa piattaforma di immunodosaggio può essere facilmente applicata ad altre proteine di segnalazione cellulare a condizione che siano disponibili anticorpi specifici. Per progettare saggi riproducibili, è necessario utilizzare buone pratiche di coltura cellulare e stabilire procedure operative standard. Inoltre, è necessario ottimizzare attentamente le condizioni di coltura e trattamento cellulare.A dimostrare la procedura sarà Genevieve Chatel, una scienziata del nostro laboratorio. Per iniziare, coltiva le cellule HeLa e A431 in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica utilizzando DMEM integrato con 10% FBS. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, tripsilizzarle e passarle o usarle per i test.Per eseguire il test, erogare 50 microlitri di cellule alla densità pre-ottimizzata in una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti nel terreno di coltura appropriato, quindi incubarli durante la notte in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius e al 5%. Il giorno seguente, preparare serie intermedie di diluizione doppie e quadruple dei composti in esame diluendo in serie il composto in un mezzo privo di siero su 12 pozzetti di una piastra di polipropilene a 96 pozzetti. Per la stimolazione cellulare, aggiungere 50 microlitri di mezzo privo di siero contenente il simulatore a una concentrazione 2X e incubare le cellule per il tempo pre-ottimizzato a temperatura ambiente o 37 gradi.Per l'inibizione cellulare, aggiungere 25 microlitri di mezzo privo di siero contenente l'inibitore a una concentrazione 4X e incubare le cellule per il tempo pre-ottimizzato a temperatura ambiente o 37 gradi, quindi aggiungere 25 microlitri di mezzo privo di siero contenente lo stimolatore a una concentrazione 4X e incubare per il tempo pre-ottimizzato. Successivamente, per lisare le cellule, preparare il tampone di lisi integrato 1X e aggiungere cocktail di inibitori della fosfatasi ad esso. Dopo aver accuratamente rimosso e scartato il terreno di coltura cellulare, aggiungere immediatamente 50 microlitri del tampone di lisi integrato 1X preparato e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione con agitazione moderata.Per il rilevamento TR-FRET, preparare la miscela di rilevamento degli anticorpi 4X nel tampone di rilevamento 1X, quindi preparare le soluzioni anticorpali EUAB1 e FRAB2, nonché le soluzioni anticorpali EUAB3 e FRAB4 nel tampone di rilevamento 1X. Infine, mescolare EUAB1 pre-diluito con FRAB2 pre-diluito per il rilevamento di fosfoproteine e EUAB3 pre-diluito e FRAB4 pre-diluito per il rilevamento di proteine totali. Quindi pipettare con cura 15 microlitri del lisato cellulare dalla piastra di coltura a 96 pozzetti a un pozzo di una micropiastra bianca a basso volume da 384 pozzetti.Quindi, aggiungere 15 microlitri del lisato di controllo positivo e 15 microlitri del tampone di lisi 1X come controllo negativo per separare i pozzetti di analisi. Ai pozzetti contenenti 15 microlitri del lisato, aggiungere cinque microlitri della corrispondente miscela di rilevamento degli anticorpi 4X per rilevare la fosfoproteina o la proteina totale. Dopo aver coperto la piastra con un sigillante a piastre, incubarla a temperatura ambiente per un'ora o durante la notte a seconda del kit di analisi.Al termine dell'incubazione, rimuovere il sigillante per piastre adesive e leggere la piastra su un lettore di micropiastre compatibile TR-FRET. I risultati dei saggi TR-FRET per il rilevamento e la quantificazione del fosfo-STAT1 con STAT1 totale e fosfo-STAT4 nelle cellule U266B1 insieme al fosfo-STAT5 con STAT5 totale nelle cellule A431 sono rappresentati utilizzando curve di risposta alla concentrazione. Allo stesso modo, i saggi TR-FRET per il rilevamento e la quantificazione di fosfo-STAT3 e STAT3 totale e fosfo-STAT6 e STAT6 totale nelle cellule HeLa sono rappresentati utilizzando curve di risposta alla concentrazione.Nel complesso, tutti i saggi hanno mostrato robusti segnali TR-FRET, ampie gamme dinamiche, bassa variazione del coefficiente inter-pozzo e rapporti segnale-sfondo accettabili. Il trattamento delle cellule con attivatori JAK, interferone alfa-2B e IL-4 ed EGF ha mostrato l'aumento dipendente dalla concentrazione previsto della fosforilazione STAT a specifici residui di tirosina, mentre le corrispondenti proteine STAT totali sono rimaste stabili. Sia l'inibitore JAK che erlotinib hanno inibito i corrispondenti livelli di fosfo-STAT in modo dipendente dalla concentrazione.I risultati della stimolazione fosfo-STAT4 da parte dell'interferone alfa-2B in una linea cellulare in sospensione o della stimolazione fosfo-STAT6 da parte di IL-4 in una linea cellulare di aderenza utilizzando il protocollo a una piastra erano coerenti con quelli ottenuti utilizzando il protocollo a due piastre, mostrando così la riuscita adattabilità di un protocollo di trasferimento a due piastre a un protocollo all-in-one a un pozzo all-in-one a una piastra. I risultati dello studio di variabilità intra-piastra per il saggio fosfo-STAT1 utilizzando una linea cellulare in sospensione e il saggio fosfo-STAT3 utilizzando una linea cellulare di aderenza dimostrano la robustezza di questi saggi fosfo-STAT per applicazioni HTS. È essenziale integrare il tampone di lisi con il cocktail inibitore della fosfatasi per prevenire la defosforilazione delle proteine fosforilate dalla fosfatasi attiva presente nell'intero estratto cellulare.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...