Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
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1. 細胞培養
<ol><li>加湿した37°C/5%CO2 インキュベーター内で細胞を維持し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM(HeLaおよびA431細胞)または15%FBSを添加したRPMI(U266B1細胞)のいずれかで培養する。70〜80%のコンフルエントに達するまで細胞を培養し、次いでそれらをトリプシン処理して継代するか、アッセイに使用する。 注:培地にはフェノールレッドが含まれていました。アッセイを実施?...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway:+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention.">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li><li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer.">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li><li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies:+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+(WBMRS).">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).</li><li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign.">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li><li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format.">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).</li><li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors.">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li><li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation.">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling,+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format.">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li><li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+&#947;c-containing+cytokine+receptors.">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through &#947;c-containing cytokine receptors.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li><li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors.">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F:+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays.">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li><li>Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

ウェスタンブロッティングやELISAベースの方法などの従来のリンタンパク質分析方法と比較して、THUNDER TR-FRET細胞アッセイのワークフローはシンプルで高速で、少量のサンプル(15 μL)を使用し、384ウェルフォーマットのHTS用に設計されており、自動化に非常に適しています。アッセイプロトコルは柔軟性があり、中スループットおよび高スループットの両方のアプリケーションに容易に適合さ...

JAK/STATシグナル伝達経路は、多様なサイトカイン、インターフェロン、成長因子、および関連分子に対する細胞応答を媒介する上で重要な役割を果たしています1,2。これらのリガンドの特異的細胞表面受容体への結合はJAKの活性化をもたらし、JAKは特定のチロシン残基のリン酸化によってSTATタンパク質を活性化する。STATリン酸化は、それらの二量体化および核への転座をもたらし、そこで調節された標的遺伝子の転写にその効果を発揮する。STAT ファミリは、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、および STAT6 の 7 つのメンバーで構成されています。メンバーは、増殖、分化、アポトーシス、血管新生、および免疫系調節を含む生理学的細胞プロセスの調節において複雑かつ不可欠な役割を果たす。STATシグナル伝達経路の異常な活性化は、多くのヒト疾患、特に癌および免疫関連状態に関与している3,4。したがって、天然細胞シグナル伝達環境におけるSTATタンパク質のリン酸化を評価する能力は、学術的および創薬的研究の両方にとって重要である。
今日まで、STATを含む細胞内リン酸化タンパク質レベルを測定するために使用される従来の方法は、抗体ベースであり、ウェスタンブロッティング、ELISA、およびホスホフローサイトメトリーを含む。これらの異種の方法は、労力がかかり、時間がかかり、エラーが発生しやすく、スループットが低く、ウェスタンブロッティングの場合、しばしば信頼性が低い(特異性の問題など)5。対照的に、均質アッセイは、より少ない実験ステップを必要とし、より少ないサンプル量を使用し、HTSに従順である。細胞溶解物中のSTATのJAK依存性リン酸化を定量的にモニタリングするために使用できる5つの均質な細胞ベースの免疫アッセイプラットフォームが市販されている:SureFire、HTRF、LANCE、LanthaScreen、およびLumit。これらのプラットフォームにはそれぞれ長所と短所があります。
SureFireは発光酸素チャネリング技術に基づいており、ドナービーズとアクセプタービーズを使用して、一対の抗体を特異的に捕捉し、そのうちの1つはビオチン化されています。リン酸化タンパク質の存在下で、2つの抗体はドナービーズとアクセプタービーズを近接させ、化学発光シグナルの生成を可能にします6。汎用性と感度は高いものの、この技術は高価であり、培養液中のビオチンの影響を受け、周囲温度や光に非常に敏感であり、検出には特別なリーダーが必要です。HTRFとLANCEはどちらもTR-FRET技術に基づいており、ドナー分子として長寿命発光ランタノイドイオン錯体(ユウロピウムまたはテルビウムキレート、またはユウロピウムクリプテート)を使用し、アクセプター分子として遠赤色蛍光団7。ドナー分子またはアクセプター分子のいずれかで標識された2つのタンパク質特異的抗体が近接すると、FRETが発生し、アクセプター蛍光の増加およびドナー蛍光の減少を引き起こす。これらの長寿命蛍光シグナルは、時間分解およびレシオメトリック方式で測定できるため、アッセイ干渉を低減し、データ品質を向上させることができます。TR-FRETの他の利点は、光に敏感ではなく、繰り返し読み取りが可能で、長い信号安定性を示すことです。TR-FRETは、その汎用性、感度、および高い堅牢性のためにHTSに広く実装されていますが、すべての市販のTR-FRETベースのアッセイプラットフォームは高価であるため、学術的および小規模な産業研究所での幅広い採用を妨げています。LanthaScreenアッセイもTR-FRETベースの読み出しを使用しますが、緑色蛍光タンパク質(GFP)-STAT1融合タンパク質とテルビウム標識ホスホ特異的STAT1抗体を組み合わせた安定発現する操作されたU2OS細胞株に依存しています8。シグナル伝達タンパク質の選択が限られていることに加えて、この方法は高価なトランスフェクト細胞株を購入し、その適用性を低下させ、実験的アーチファクトの可能性を高める必要がある。Lumitは、NanoLuc Luciferase9の大小のNanoBitサブユニットで化学的に標識された二次抗体(抗マウスおよび抗ウサギ)を利用する一般的な生物発光免疫測定プラットフォームです。2つの一次抗体の標的タンパク質への結合は、二次抗体を近接させ、発光シグナルを生成する活性酵素を形成する。発光は一般に高感度で堅牢な読み出しですが、2つの異なる種で産生される一次抗体の要件により、アッセイ設計の選択肢が制限されます。さらに、複雑なサンプルマトリックスに二次抗体を使用すると、アッセイ干渉を受けやすくなる可能性があります。
したがって、HTSと互換性のある方法で個々のリン酸化タンパク質および総STATタンパク質を測定するための、信頼性が高く、迅速で、かつ手頃な価格の細胞ベースのアッセイプラットフォームの必要性が依然として存在する。このニーズに対応するために、強化されたTR-FRET技術(THUNDER)に基づいて新しいハイスループット細胞ベースのイムノアッセイプラットフォームが開発され、細胞ライセート中の内因的に発現された細胞内タンパク質(リン酸化または合計)のシンプルで高感度、堅牢で費用対効果の高い測定を可能にするように設計されています。この技術の利点は、優れたスペクトル適合性とTR-FRETシグナルを示すドナー/アクセプターFRETペア、厳密に検証された抗体、および最適化された溶解バッファーの組み合わせに由来します。これらのアッセイはサンドイッチイムノアッセイとしてフォーマットされ、簡単な3段階のワークフローを使用します(図1)。細胞は、まずタンパク質リン酸化を調節するように処理され、次いでキットに提供される特定の溶解緩衝液で溶解される。細胞溶解物中の標的リン酸化または総STATタンパク質は、標的タンパク質上の別個のエピトープを認識する一対のフルオロフォア標識抗体との単一の試薬添加およびインキュベーション工程で検出される(図2)。1つの抗体はユウロピウムキレートドナー(Eu-Ab1)で標識され、2番目の抗体は遠赤色アクセプターフルオロフォア(FR-Ab2)で標識されています。2つの標識抗体は溶液中のタンパク質に結合し、2つの標識を近接させる。ドナーのユウロピウムキレートを320または340nmで励起すると、アクセプターにFRETがトリガーされ、細胞溶解物中の標的タンパク質(リン酸化または合計)の濃度に比例した665nmで長寿命のTR-FRETシグナルを放出する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> 図1:TR-FRETアッセイワークフロー ワークフローは、細胞処理、細胞溶解、TR-FRETを使用したタンパク質検出の3つのステップで構成されています。2プレートアッセイプロトコルでは、溶解液は白色384ウェル検出プレートに移されますが、1プレートプロトコルでは、すべてのステップが同じ白色384ウェル検出プレート(オールインワンウェルプロトコル)で行われます。使用されるアッセイプロトコルにかかわらず、タンパク質検出は同じ総容量(ウェルあたり20 μL)で行われます。略語: TR-FRET = 時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> 図2:TR-FRETサンドイッチ免疫測定法原理。 1つの抗体はユウロピウムキレートドナー(Eu-Ab1)で標識され、もう1つは遠赤色の小蛍光色素受容体(FR-Ab2)で標識されています。2つの標識抗体は、細胞ライセート中の標的タンパク質(リン酸化または全)上の異なるエピトープに特異的に結合し、2つの蛍光色素を近接させます。320または340nmでのドナーユーロピウムキレートの励起は、ドナーからアクセプター分子へのFRETを誘発し、次いで665nmでシグナルを放出する。このシグナルは、細胞溶解物中のタンパク質の濃度に比例する。特定の標的タンパク質がない場合、ドナーとアクセプターの蛍光色素は互いに離れすぎているため、FRETは発生しません。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー移動;TR-FRET = 時間分解フレット;Ab = 抗体;FR = 極赤色。Eu - ユウロピウムキレート;P = リン酸化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここでは、THUNDER TR-FRETプラットフォームを使用する付着細胞または浮遊細胞からの細胞溶解物中のリン酸化STAT1(Y701)、STAT3(Y705)、STAT4(Y693)、STAT5(Y694/Y699)、およびSTAT6(Y641)の細胞内レベルを、合計STAT1、STAT3、STAT5、およびSTAT6とともに測定するための詳細なプロトコルが、384ウェルフォーマットで提供されています。これらのプロトコルは、2 プレート転写プロトコルまたは 1 プレートオールインワンウェルプロトコルのいずれかを使用した細胞処理、溶解、および TR-FRET ベースの標的タンパク質検出の手順を定義します。これらの細胞ベースのアッセイは、JAK/STAT経路の既知の活性化剤および阻害剤の薬理学的プロファイルを決定するために適用される。HTSのための選択されたアッセイの堅牢性と適合性が実証されています。最後に、アッセイ最適化のための主要な実験と、アッセイのトラブルシューティングに関する推奨事項について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

ヤヌスキナーゼ(JAK)/シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化因子(STAT)シグナル伝達経路は、サイトカインおよび成長因子に対する細胞応答を媒介する上で重要な役割を果たしている。STATタンパク質は、主にJAKによって媒介されるチロシンリン酸化によって活性化される。STATシグナル伝達経路の異常な活性化は、多くのヒト疾患、特に癌および免疫関連状態に関与している。したがって、天然細胞シグナル伝達環境内でのSTATタンパク質のリン酸化をモニターする能力は、学術的および創薬的研究の両方にとって重要である。リン酸化STATタンパク質を定量するために利用可能な従来のアッセイ形式には、ウェスタンブロッティングおよび酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が含まれる。これらの異種の方法は、労働集約的でスループットが低く、ウェスタンブロッティングの場合、信頼性が低い(特異的な)ことがよくあります。均質な(洗浄なしの)方法が利用可能であるが、依然として高価である。 
ここでは、新規サンダー時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動(TR-FRET)プラットフォームを使用して、接着細胞または浮遊細胞からの細胞溶解物中のリン酸化STAT1(Y701)、STAT3(Y705)、STAT4(Y693)、STAT5(Y694/Y699)、およびSTAT6(Y641)の内因性レベルの384ウェルフォーマットで、高感度で堅牢で費用対効果の高い測定のための詳細なプロトコルが提供されています。細胞アッセイのワークフローはシンプルで高速で、ハイスループットスクリーニング(HTS)用に設計されています。アッセイプロトコルは柔軟で、少量サンプル(15 μL)を使用し、1つの試薬添加ステップのみを必要とし、低スループットおよびハイスループットのアプリケーションに適合させることができます。各ホスホ-STATサンドイッチイムノアッセイは、既知のアゴニストおよび阻害剤を用いて最適化された条件下で検証され、予想される薬理学およびZ'因子値を生成する。TR-FRETアッセイはレシオメトリックであり、洗浄ステップを必要としないため、従来のアプローチよりもはるかに優れた再現性を提供します。この一連のアッセイは、細胞処理後の特異的リン酸化STATタンパク質のより包括的な分析、およびJAK/STATシグナル伝達経路の特異的および選択的モジュレーターのスクリーニングおよび特性評価のための新しい費用対効果の高いツールを提供します。

各 THUNDER TR-FRET アッセイは、付着細胞 (HeLa または A431) または浮遊細胞 (U266B1) を JAK/STAT経路特異的アクチベーターまたはインヒビターで処理し、該当する場合は特定のリン酸化 STAT および総 STAT のレベルを測定することによって薬理学的に検証されました。アッセイは、2プレート転写プロトコルおよび事前に最適化されたアッセイ条件を使用して、384ウェルフォーマットで実施しました。図3...

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Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動細胞ベースのアッセイプロトコルは、384ウェルフォーマットの細胞溶解物中の内因性リン酸化シグナルトランスデューサおよび転写活性化剤(STAT)1/3/4/5/6タンパク質の単純、特異的、高感度、および堅牢な定量のために記載されています。

ヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

TR-FRETベースのアッセイは、JAK/STATシグナル伝達経路の特異的および選択的モジュレーターのスクリーニングおよび薬理学的特徴付けのための新しい費用対効果の高いツールを提供します。この技術は、ウェスタンブロットやELISAなどの従来の方法よりもはるかに簡単で、迅速で、再現性があり、堅牢です。洗浄工程は不要で、試薬は1回の工程で添加されます。このイムノアッセイプラットフォームは、特異的抗体が利用可能であれば、他の細胞シグナル伝達タンパク質に容易に適用することができる。再現性のあるアッセイを設計するには、適切な細胞培養方法を使用し、標準的な操作手順を確立する必要があります。さらに、細胞培養および処理条件を慎重に最適化する必要があります。手順を実証するのは、私たちの研究室の科学者であるジュヌヴィエーヴ・シャテルです。まず、HeLaおよびA431細胞を、10%FBSを添加したDMEMを用いて、加湿された摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーター内で培養する。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、それらをトリプシン処理し、継代するか、アッセイに使用する。アッセイを実行するには、事前に最適化された密度で50マイクロリットルの細胞を適切な培養培地中の96ウェル組織培養処理プレートに分注し、次いでそれらを摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーター内で一晩インキュベートする。翌日、ポリプロピレン製96ウェルプレートの12ウェルにわたって無血清培地で化合物を段階的に希釈することによって、試験化合物の中間2倍および4倍希釈系列を調製する。細胞刺激のために、シミュレータを含む無血清培地を2倍の濃度で50マイクロリットル加え、室温または37度で予め最適化された時間の間、細胞をインキュベートする。細胞阻害のために、阻害剤を含む無血清培地を4倍濃度で25マイクロリットル加え、室温または37度のいずれかで予め最適化された時間の間細胞をインキュベートし、次いで、刺激剤を含む無血清培地を4倍濃度で25マイクロリットル加え、予め最適化された時間にわたってインキュベートする。次に、細胞を溶解するために、1X補充溶解緩衝液を調製し、それにホスファターゼ阻害剤カクテルを加える。細胞培養培地を慎重に除去して廃棄した後、直ちに調製した1X添加溶解緩衝液50マイクロリットルを加え、適度な攪拌で振とう下で室温で30分間インキュベートする。TR-FRET検出のために、1X検出バッファー中に4X抗体検出ミックスを調製し、次いでEUAB1およびFRAB2抗体溶液、ならびにEUAB3およびFRAB4抗体溶液を1X検出緩衝液に調製する。最後に、予め希釈されたEUAB1を、リンタンパク質の検出のために予め希釈されたFRAB2と、総タンパク質の検出のために予め希釈されたEUAB3および予め希釈されたFRAB4とを混合する。次いで、15マイクロリットルの細胞溶解液を96ウェル培養プレートから白色の低容量384ウェルマイクロプレートのウェルに慎重にピペットする。次に、陽性対照溶解液15マイクロリットルおよび陰性対照として15マイクロリットルの1X溶解緩衝液を加えてアッセイウェルを分離する。15マイクロリットルの溶解物を含むウェルに、対応する4倍抗体検出ミックスを5マイクロリットル加えて、リンタンパク質または総タンパク質を検出する。プレートをプレートシーラーで覆った後、アッセイキットに応じて室温で1時間~一晩インキュベートする。インキュベーションが完了したら、接着プレートシーラーを取り外し、TR-FRET互換マイクロプレートリーダーでプレートを読み取る。U266B1細胞における総STAT1およびホスホ-STAT4を有するホスホ-STAT1およびA431細胞における合計STAT5を有するホスホ-STAT5の検出および定量のためのTR-FRETアッセイの結果は、濃度応答曲線を用いて表される。同様に、HeLa細胞におけるホスホ−STAT3および総STAT3ならびにホスホ−STAT6ならびに総STAT6の検出および定量のためのTR−FRETアッセイは、濃度応答曲線を用いて表される。全体として、すべてのアッセイは、堅牢なTR-FRETシグナル、広いダイナミックレンジ、低いウェル間係数変動、および許容可能なシグナル対バックグラウンド比を示しました。JAK活性化剤、インターフェロンアルファ-2BおよびIL-4およびEGFによる細胞の処理は、特定のチロシン残基におけるSTATリン酸化の予想される濃度依存的増加を示したが、対応する総STATタンパク質は安定していた。JAK阻害剤およびエルロチニブの両方が、対応するホスホ−STATレベルを濃度依存的に阻害した。浮遊細胞株におけるインターフェロンα−2Bによるホスホ−STAT4刺激、またはワンプレートプロトコルを用いた接着細胞株におけるIL−4によるホスホ−STAT6刺激の結果は、2プレートプロトコルを用いて得られたものと一致し、したがって、ワンプレートオールインワンウェルプロトコルへの2プレート転写プロトコルの成功した適応性を示した。浮遊細胞株を用いたホスホ-STAT1アッセイおよび付着細胞株を用いたホスホ-STAT3アッセイのプレート内変動性試験の結果は、HTSアプリケーションに対するこれらのホスホ-STATアッセイの堅牢性を実証しています。全細胞抽出物中に存在する活性ホスファターゼからのリン酸化タンパク質の脱リン酸化を防ぐために、溶解緩衝液をホスファターゼ阻害剤カクテルで補うことが不可欠である。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

脂質結合タンパク質およびアレルゲンからの内因性リガンドの除去と置換

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

時間分解型クライオ電子顕微鏡のための高速グリッド調製

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...