Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells at JoVE.com

1. Cellekultur
<ol><li>Opprettholde celler i en fuktet 37 ° C / 5% CO2 inkubator og kultur med enten DMEM supplert med 10% foster bovint serum (FBS) (HeLa og A431 celler) eller RPMI supplert med 15% FBS (U266B1 celler). Kultur cellene til de når 70-80% samløp, deretter prøve å prøve dem og passasje eller bruke dem til analysene. MERK: Kulturmedier inneholdt fenolrød. Ingen serum sult ble utført for noen cellelinje før gjennomføring av analysene.</li>
</ol>2. Stimulator- ell...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway:+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention.">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li><li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer.">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li><li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies:+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+(WBMRS).">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).</li><li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign.">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li><li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format.">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).</li><li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors.">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li><li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation.">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling,+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format.">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li><li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+&#947;c-containing+cytokine+receptors.">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through &#947;c-containing cytokine receptors.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li><li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors.">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F:+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays.">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li><li>Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

Sammenlignet med konvensjonelle metoder for fosfoproteinanalyse som vestlig blotting og ELISA-baserte metoder, er arbeidsflyten for en THUNDER TR-FRET cellulær analyse enkel og rask, bruker en lavvolumprøve (15 μL), er designet for HTS i et 384-brønns format, og er svært mottagelig for automatisering. Analyseprotokollen er fleksibel og kan lett tilpasses både mellomstore og høye gjennomstrømningsapplikasjoner. Analyser kan kjøres enten ved hjelp av en to-plate overføringsprotokoll eller en en-384-brønns platep...

JAK/STAT-signalveien spiller en nøkkelrolle i å formidle cellulære responser på ulike cytokiner, interferoner, vekstfaktorer og relaterte molekyler1,2. Bindingen av disse ligandene til spesifikke celleoverflatereseptorer resulterer i aktivering av JAK-er, som igjen aktiverer STAT-proteiner ved fosforylering av spesifikke tyrosinrester. STAT fosforylering resulterer i dimerisering og translokasjon i kjernen, hvor de utøver sin effekt på transkripsjon av regulerte målgener. STAT-familien består av syv medlemmer: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b og STAT6. Medlemmene spiller en kompleks og viktig rolle i reguleringen av fysiologiske celleprosesser, inkludert spredning, differensiering, apoptose, angiogenese og immunsystemregulering. Den unormale aktiveringen av STAT-signalveier er involvert i mange menneskelige sykdommer, spesielt kreft og immunrelaterte tilstander3,4. Derfor er evnen til å vurdere STAT-proteinfosforylering i det opprinnelige cellesignaleringsmiljøet viktig for både akademisk og narkotikaoppdagelsesforskning.
Til dags dato er de konvensjonelle metodene som brukes til å måle intracellulære fosforylaterte proteinnivåer, inkludert STATs, antistoffbaserte og inkluderer vestlig blotting, ELISA og fosfoflowcytometri. Disse heterogene metodene er arbeidsintensive, tidkrevende, feilutsatte, lavgjennomstrømning og ofte upålitelige (f.eks. spesifisitetsproblemer) når det gjelder vestlig blotting5. I motsetning krever homogene analyser færre eksperimentelle trinn, bruker mindre prøvevolumer og er mottagelige for HTS. Det finnes fem homogene cellebaserte immunoassayplattformer kommersielt tilgjengelig som kan brukes til kvantitativt å overvåke JAK-avhengig fosforylering av STATs i cellelytter: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen og Lumit. Hver av disse plattformene har sine fordeler og ulemper.
SureFire er basert på luminescerende oksygenkanalteknologi, som benytter donor- og akseptorperler belagt for å spesifikt fange et par antistoffer, hvorav den ene er biotinylert. I nærvær av fosforylatert protein bringer de to antistoffene donor- og akseptorperlene i nærheten, noe som muliggjør generering av et chemiluminescent signal6. Selv om den er allsidig og følsom, er denne teknologien dyr, påvirkes av biotin i kulturmediet, er svært følsom for omgivelsestemperatur og lys, og krever en spesiell leser for deteksjon. HTRF og LANCE er begge basert på TR-FRET-teknologi som benytter lystetthetskomplekser med lang levetid (Europium eller Terbium chelater, eller Europium kryptat) som donormolekyler og fjernrøde fluoroforer som akseptormolekylene7. Når to proteinspesifikke antistoffer merket med enten donor- eller akseptormolekyler bringes i nærheten, finner FRET sted, noe som forårsaker en økning i akseptorfluorescens og en reduksjon i donorfluorescens. Disse langvarige fluorescerende signalene kan måles på en tidsavklart og forholdsmetrisk måte for å redusere analyseinterferens og øke datakvaliteten. Andre fordeler med TR-FRET er at den ikke er lysfølsom, tillater gjentatte avlesninger og viser lang signalstabilitet. Mens TR-FRET er bredt implementert i HTS på grunn av sin allsidighet, følsomhet og høye robusthet, er alle kommersielle TR-FRET-baserte analyseplattformer dyre, og dermed utelukker den brede adopsjonen i akademiske og små industrielle laboratorier. LanthaScreen-analysen bruker også en TR-FRET-basert avlesning, men er avhengig av en konstruert U2OS-cellelinje som stabilt uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP)-STAT1 fusjonsprotein kombinert med et terbium-merket fosfo-spesifikt STAT1 antistoff8. I tillegg til å være begrenset når det gjelder valg av signalproteiner, krever denne metoden å kjøpe dyre transfekterte cellelinjer, redusere anvendbarheten og øke muligheten for eksperimentelle gjenstander. Lumit er en generisk bioluminescent immunoassay plattform som benytter sekundære antistoffer (anti-mus og anti-kanin) kjemisk merket med de små og store NanoBit underenheter av NanoLuc Luciferase9. Bindingen av to primære antistoffer mot målproteinet bringer de sekundære antistoffene i nærheten for å danne et aktivt enzym som genererer et luminescenssignal. Selv om luminescens generelt er en sensitiv og robust avlesning, begrenser kravet til primære antistoffer som er reist i to forskjellige arter valgene for analysedesign. I tillegg kan bruk av sekundære antistoffer i komplekse prøvematriser være utsatt for analyseforstyrrelser.
Dermed eksisterer det fortsatt et behov for en pålitelig, rask, men rimelig cellebasert analyseplattform for måling av individuelle fosforierte og totale STAT-proteiner på en måte som er kompatibel med HTS. For å møte dette behovet ble en ny cellebasert immunoassay-plattform med høy gjennomstrømning utviklet basert på en forbedret TR-FRET-teknologi (THUNDER) og designet for å muliggjøre enkel, sensitiv, robust og kostnadseffektiv måling av endogenede uttrykte intracellulære proteiner (fosforert eller total) i cellelytter. Fordelene med denne teknologien stammer fra kombinasjonen av et donor/akseptor FRET-par som viser eksepsjonell spektralkompatibilitet og TR-FRET-signal, strengt validerte antistoffer og optimaliserte lysisbuffere. Disse analysene er formatert som sandwichimmunoassays og bruker en enkel, tretrinns arbeidsflyt (figur 1). Celler behandles først for å modulere proteinfosforylering og deretter lyses med den spesifikke lysisbufferen som følger med i settet. Målet fosforylatert eller totalt STAT-protein i cellelysatet påvises i et enkelt reagenstilsetnings- og inkubasjonstrinn med et par fluoroformerkede antistoffer som gjenkjenner distinkte epitoper på målproteinet (figur 2). Ett antistoff er merket med en Europium chelatdonor (Eu-Ab1), mens det andre antistoffet er merket med en fjernrød akseptorfluofor (FR-Ab2). De to merkede antistoffene binder seg til proteinet i løsningen, og bringer de to etikettene i nærheten. Eksitasjon av donoren Europium chelate ved 320 eller 340 nm utløser en FRET til akseptoren, som avgir et langvarig TR-FRET-signal på 665 nm proporsjonalt med konsentrasjonen av målprotein (fosforilert eller totalt) i cellelyset.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Figur 1: Arbeidsflyt for TR-FRET-analyse. Arbeidsflyten består av tre trinn: cellebehandling, cellelys og proteindeteksjon ved hjelp av TR-FRET. I toplateanalyseprotokollen overføres lysater til en hvit 384-brønns deteksjonsplate, mens i enplateprotokollen utføres alle trinnene i samme hvite 384-brønns deteksjonsplate (alt-i-ett-brønnsprotokoll). Uavhengig av analyseprotokollen som brukes, utføres proteindeteksjon i samme totale volum (20 μL per brønn). Forkortelse: TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Figur 2: TR-FRET sandwichimmunoassay-prinsippet. Ett antistoff er merket med Europium chelate donor (Eu-Ab1) og det andre med den fjerne røde lille fluorofor akseptoren (FR-Ab2). De to merkede antistoffene binder seg spesielt til distinkte epitoper på målproteinet (fosforylatert eller totalt) i cellelysatet, og bringer de to fluoroforene i nærheten. Eksitasjon av donoren Europium chelate på 320 eller 340 nm utløser en FRET fra donoren til akseptormolekylene, som igjen avgir et signal på 665 nm. Dette signalet er proporsjonalt med konsentrasjonen av protein i cellelyset. I fravær av det spesifikke målproteinet er donor og akseptorfluoreorer for fjerne fra hverandre for at FRET skal oppstå. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; TR-FRET = tidsavklart FRET; Ab = antistoff; FR = fjernrød; Eu - Europium chelate; P = fosforylering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Her er detaljerte protokoller gitt for måling, i et 384-brønns format, intracellulære nivåer av fosforilert STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) og STAT6 (Y641), sammen med total STAT1, STAT3, STAT5 og STAT6, i cellelysater fra adherent- eller suspensjonsceller ved hjelp av THUNDER TR-FRET-plattformen. Disse protokollene definerer trinn for cellebehandling, lysis og TR-FRET-basert målproteindeteksjon ved hjelp av enten en to-plate overføringsprotokoll eller en en-plate alt-i-ett-brønns protokoll. Disse cellebaserte analysene brukes til å bestemme den farmakologiske profilen til kjente aktivatorer og hemmere av JAK / STAT-banen. Robustheten og egnetheten til utvalgte analyser for HTS er demonstrert. Til slutt diskuteres viktige eksperimenter for analyseoptimalisering, sammen med anbefalinger for analysefeilsøking.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

Janus kinase (JAK)/signaltransduser og aktivator for transkripsjon (STAT) signalvei spiller en avgjørende rolle i å formidle cellulære responser på cytokiner og vekstfaktorer. STAT-proteiner aktiveres av tyrosinfosforylering som hovedsakelig formidles av JAKs. Den unormale aktiveringen av STAT-signalveier er involvert i mange menneskelige sykdommer, spesielt kreft og immunrelaterte forhold. Derfor er evnen til å overvåke STAT-proteinfosforylering i det opprinnelige cellesignaleringsmiljøet viktig for både akademisk og narkotikaoppdagelsesforskning. De tradisjonelle analyseformatene som er tilgjengelige for å kvantifisere fosforylaterte STAT-proteiner inkluderer vestlig blotting og den enzymbundne immunosorbente analysen (ELISA). Disse heterogene metodene er arbeidsintensive, lavgjennomstrømning, og ofte ikke pålitelige (spesifikke) i tilfelle vestlig blotting. Homogene (no-wash) metoder er tilgjengelige, men forblir dyre. 
Her er det gitt detaljerte protokoller for de sensitive, robuste, og kostnadseffektiv måling i et 384-brønns format av endogene nivåer av fosforilert STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (7Y694/Y699) og STAT6 (Y641) i cellelysater fra adherent- eller suspensjonsceller ved hjelp av den nye THUNDER-plattformen for tidsavklart Förster-resonansenergioverføring (TR-FRET). Arbeidsflyten for mobilanalysen er enkel, rask og utformet for screening med høy gjennomstrømning (HTS). Analyseprotokollen er fleksibel, bruker en prøve med lavt volum (15 μL), krever bare ett reagenstilleggstrinn, og kan tilpasses applikasjoner med lav gjennomstrømning og høy gjennomstrømning. Hver fosfo-STAT sandwich immunoassay er validert under optimaliserte forhold med kjente agonister og inhibitorer og genererer forventede farmakologi- og Z-faktorverdier. Siden TR-FRET-analysene er rasjonsmetriske og ikke krever vasketrinn, gir de mye bedre reproduserbarhet enn tradisjonelle tilnærminger. Sammen gir denne pakken med analyser nye kostnadseffektive verktøy for en mer omfattende analyse av spesifikke fosforaterte STAT-proteiner etter cellebehandling og screening og karakterisering av spesifikke og selektive modulatorer av JAK / STAT-signalveien.

Hver THUNDER TR-FRET-analyse ble farmakologisk validert ved å behandle tilhenger (HeLa eller A431) eller suspensjonsceller (U266B1) med JAK/STAT-banespesifikke aktivatorer eller hemmere og deretter måle nivåene av spesifikke fosforylerte og totale STATs, når det er aktuelt. Analysene ble utført i 384-brønnsformat ved hjelp av to-plate overføringsprotokollen og forhåndsoptimaliserte analyseforhold. Figur 3, figur 4, figur 5, ...

Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells at JoVE.com

Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Tidsavklarte Förster-resonansenergioverføringscellebaserte analyseprotokoller er beskrevet for enkel, spesifikk, sensitiv og robust kvantifisering av endogen fosforylater og aktivator for transkripsjon (STAT) 1/3/4/5/6 proteiner i cellelysater i et 384-brønns format.

Tidsavklarte Förster Resonance Energy Transfer Assays for måling av endogene fosforylaterte STAT-proteiner i humane celler

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

De TR-FRET-baserte analysene gir nye kostnadseffektive verktøy for screening og farmakologisk karakterisering av spesifikke og selektive modulatorer av JAK/STAT-signalveiene. Denne teknikken er mye enklere, rask, reproduserbar og robust enn konvensjonelle metoder som Vestlig blot og ELISA. Ingen vasketrinn er nødvendig, og reagenser legges i et enkelt trinn.Denne immunoassay plattformen kan enkelt brukes på andre cellesignalerende proteiner forutsatt at spesifikke antistoffer er tilgjengelige. For å designe reproduserbare analyser må du bruke god cellekulturpraksis og etablere standard driftsprosedyrer. I tillegg må du nøye optimalisere cellekulturen og behandlingsforholdene.Demonstrere prosedyren vil være Genevieve Chatel, en forsker fra vårt laboratorium. Til å begynne med, kultur HeLa og A431 celler i en fuktet 37 grader Celsius og 5% karbondioksid inkubator ved hjelp av DMEM supplert med 10%FBS. Når cellene når 70 til 80% samløp, kan du prøve å inspisere dem og enten passere eller bruke dem til analyser.For å utføre analysen, dispenser 50 mikroliter celler ved den forhåndsoptimaliserte tettheten til en 96-brønns vevskulturbehandlet plate i riktig kulturmedium, og inkuber dem deretter over natten i en 37 grader Celsius og 5% karbondioksidinkubator. Neste dag, forberede mellomliggende tofoldige og firefoldige fortynningsserier av testforbindelsene ved å serielt fortynne forbindelsen i et serumfritt medium over 12 brønner av en polypropylen 96-brønnsplate. For cellestimulering, tilsett 50 mikroliter serumfritt medium som inneholder simulatoren ved en 2X konsentrasjon og inkuber cellene for forhåndsoptimalisert tid ved enten romtemperatur eller 37 grader.For celleinhibering, tilsett 25 mikroliter serumfritt medium som inneholder inhibitoren ved en 4X konsentrasjon og inkuber cellene for forhåndsoptimalisert tid ved enten romtemperatur eller 37 grader, og tilsett deretter 25 mikroliter serumfritt medium som inneholder stimulatoren ved en 4X konsentrasjon og inkuberer for den forhåndsoptimaliserte tiden. Deretter, for å lyse cellene, forberede 1X supplert lysisbuffer og tilsett fosfatasehemmercocktail til den. Etter forsiktig fjerning og kassering av cellekulturmediet, tilsett umiddelbart 50 mikroliter av den tilberedte 1X-supplerte lysisbufferen og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur under risting med moderat agitasjon.For TR-FRET-deteksjon klargjør du 4X antistoffdeteksjonsblandingen i 1X-deteksjonsbufferen, og klargjør deretter EUAB1- og FRAB2-antistoffløsningene, samt EUAB3- og FRAB4-antistoffløsningene i 1X-deteksjonsbufferen. Til slutt blander du prefortynnet EUAB1 med forvannet FRAB2 for påvisning av fosfoprotein og prefortynnet EUAB3 og prefortynnet FRAB4 for påvisning av totalt protein. Rør deretter forsiktig 15 mikroliter av cellelyset fra 96-brønns kulturplaten til en brønn med en hvit lavvolum 384-brønns mikroplate.Deretter tilsetter du 15 mikroliter av den positive kontrolllyset og 15 mikroliter 1X lysisbuffer som en negativ kontroll for å skille analysebrønner. Til brønner som inneholder 15 mikroliter av lysatet, tilsett fem mikroliter av den tilsvarende 4X antistoffdeteksjonsblandingen for å oppdage fosfoproteinet eller det totale proteinet. Etter å ha dekket platen med en plateforsegler, inkuber den ved romtemperatur i en time til over natten, avhengig av analysesettet.Når inkubasjonen er fullført, fjerner du klebeplatetetningen og leser platen på en TR-FRET-kompatibel mikroplateleser. Resultater av TR-FRET-analyser for deteksjon og kvantifisering av fosfo-STAT1 med total STAT1 og fosfo-STAT4 i U266B1-celler sammen med fosfo-STAT5 med total STAT5 i A431-celler er representert ved hjelp av konsentrasjonsresponskurver. På samme måte er TR-FRET-analyser for deteksjon og kvantifisering av fosfo-STAT3 og total STAT3 og fosfo-STAT6 og total STAT6 i HeLa-celler representert ved hjelp av konsentrasjonsresponskurver.Samlet sett viste alle analyser robuste TR-FRET-signaler, brede dynamiske områder, lav koeffisientvariasjon mellom brønner og akseptable signal-til-bakgrunn-forhold. Behandling av celler med JAK-aktivatorer, interferon alfa-2B og IL-4 og EGF viste den forventede konsentrasjonsavhengige økningen i STAT fosforylering ved spesifikke tyrosinrester, mens de tilsvarende totale STAT-proteinene forble stabile. Både JAK-hemmere og erlotinib hemmet de tilsvarende fosfo-STAT-nivåene på en konsentrasjonsavhengig måte.Resultater av fosfo-STAT4 stimulering ved interferon alfa-2B i en suspensjon cellelinje eller fosfo-STAT6 stimulering av IL-4 i en tilslutning celle linje ved hjelp av en-plate protokollen var i samsvar med de som er oppnådd ved hjelp av to-plate protokollen, og dermed viser vellykket tilpasningsevne av en to-plate overføring protokoll til en en-plate alt-i-ett brønnprotokoll. Resultatene av intraplatevariabilitetsstudien for fosfo-STAT1-analysen ved hjelp av en suspensjonscellelinje og fosfo-STAT3-analysen ved hjelp av en tilslutningscellelinje viser robustheten til disse fosfo-STAT-analysene for HTS-applikasjoner. Det er viktig å supplere lysisbufferen med fosfatasehemmercocktailen for å forhindre defosforylering av fosforylerte proteiner fra aktiv fosfatase tilstede i hele celleekstraktet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi for identifisering av flere Phosphorylations med egen Uordnede Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bruker en omfattende Immunoprecipitation berikelse System for å identifisere en endogen post-translasjonell modifikasjon profil for målet proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjerning og utskifting av endogene ligander fra Lipidbundne proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...