Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells at JoVE.com

Никакой.

1. Клеточная культура
<ol><li>Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе и культуре CO2 с температурой 37 ° C / 5% с помощью DMEM, дополненного 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (клетки HeLa и A431), либо RPMI, дополненной 15% FBS (клетки U266B1). Культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут 70-8...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway:+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention.">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li><li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer.">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li><li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies:+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+(WBMRS).">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).</li><li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign.">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li><li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format.">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).</li><li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors.">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li><li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation.">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling,+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format.">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li><li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+&#947;c-containing+cytokine+receptors.">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through &#947;c-containing cytokine receptors.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li><li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors.">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F:+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays.">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li><li>Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

По сравнению с традиционными методами анализа фосфопротеинов, такими как западное блоттинг и методы на основе ИФА, рабочий процесс для клеточного анализа THUNDER TR-FRET прост и быстр, использует образец малого объема (15 мкл), предназначен для HTS в формате 384 скважины и очень поддается автомати...

Сигнальный путь JAK/STAT играет ключевую роль в опосредовании клеточных реакций на различные цитокины, интерфероны, факторы роста и связанные с ними молекулы1,2. Связывание этих лигандов со специфическими рецепторами клеточной поверхности приводит к активации JAK, которые, в свою очередь, активируют белки STAT путем фосфорилирования специфических остатков тирозина. Фосфорилирование STAT приводит к их димеризации и транслокации в ядро, где они оказывают свое влияние на транскрипцию регулируемых генов-мишеней. Семейство STAT состоит из семи членов: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b и STAT6. Члены играют сложную и существенную роль в регуляции физиологических клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ангиогенез и регуляцию иммунной системы. Аномальная активация сигнальных путей STAT связана со многими заболеваниями человека, особенно раком и иммунными состояниями3,4. Таким образом, способность оценивать фосфорилирование белка STAT в нативной клеточной сигнальной среде важна как для академических исследований, так и для исследований по открытию лекарств.
На сегодняшний день традиционные методы, используемые для измерения внутриклеточных уровней фосфорилированного белка, включая STATs, основаны на антителах и включают вестерн-блоттинг, ИФА и цитометрию фосфопотока. Эти гетерогенные методы являются трудоемкими, трудоемкими, трудоемкими, подверженными ошибкам, с низкой пропускной способностью и часто ненадежными (например, вопросы специфичности) в случае западного блоттинга5. Напротив, однородные анализы требуют меньшего количества экспериментальных этапов, используют меньшие объемы образцов и поддаются HTS. Существует пять коммерчески доступных платформ иммуноанализа на основе однородных клеток, которые можно использовать для количественного мониторинга JAK-зависимого фосфорилирования STATs в клеточных лизатах: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen и Lumit. Каждая из этих платформ имеет свои преимущества и недостатки.
SureFire основан на люминесцентной технологии канала кислорода, которая использует донорские и акцепторные шарики, покрытые специальным захватом пары антител, одно из которых является биотинилированным. В присутствии фосфорилированного белка два антитела приближают донорские и акцепторные шарики, что позволяет генерировать хемилюминесцентный сигнал6. Несмотря на универсальность и чувствительность, эта технология является дорогостоящей, подвержена влиянию биотина в питательной среде, очень чувствительна к температуре окружающей среды и свету и требует специального считывателя для обнаружения. HTRF и LANCE основаны на технологии TR-FRET, которая использует люминесцентные ионные комплексы лантаноидов с длительным сроком службы (хелаты европия или тербия, или криптат европия) в качестве донорских молекул и дальние красные флуорофоры в качестве молекул-акцепторов7. Когда два белково-специфических антитела, меченные донорскими или акцепторными молекулами, находятся в непосредственной близости, происходит FRET, вызывая увеличение акцепторной флуоресценции и снижение донорской флуоресценции. Эти долгоживущие флуоресцентные сигналы могут быть измерены с временным разрешением и ратиометрическим способом, чтобы уменьшить помехи анализа и повысить качество данных. Другие преимущества TR-FRET заключаются в том, что он не светочувствительн, позволяет повторять показания и демонстрирует длительную стабильность сигнала. В то время как TR-FRET широко применяется в HTS из-за его универсальности, чувствительности и высокой надежности, все коммерческие платформы анализа на основе TR-FRET являются дорогостоящими, что исключает его широкое внедрение в академических и небольших промышленных лабораториях. Анализ LanthaScreen также использует считывание на основе TR-FRET, но зависит от инженерной клеточной линии U2OS, которая стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок (GFP)-STAT1 в сочетании с меченым тербием фосфо-специфическим антителом STAT18. Помимо того, что этот метод ограничен с точки зрения выбора сигнальных белков, он требует покупки дорогостоящих трансфектированных клеточных линий, снижения его применимости и увеличения возможности экспериментальных артефактов. Lumit - это универсальная платформа для биолюминесцентного иммуноанализа, которая использует вторичные антитела (против мышей и кроликов), химически меченые малыми и большими субъединицами NanoBit Люциферазы NanoLuc9. Связывание двух первичных антител с целевым белком приводит вторичные антитела в близость, образуя активный фермент, который генерирует сигнал люминесценции. В то время как люминесценция, как правило, является чувствительным и надежным считыванием, потребность в первичных антителах, выращенных у двух разных видов, ограничивает выбор конструкции анализа. Кроме того, использование вторичных антител в сложных матрицах образцов может быть склонно к анализу интерференции.
Таким образом, по-прежнему существует потребность в надежной, быстрой, но доступной клеточной аналитической платформе для измерения отдельных фосфорилированных и общих белков STAT способом, совместимым с HTS. Для удовлетворения этой потребности была разработана новая высокопроизводительная клеточная иммунологическая платформа, основанная на усовершенствованной технологии TR-FRET (THUNDER) и предназначенная для обеспечения простого, чувствительного, надежного и экономически эффективного измерения эндогенно экспрессированных внутриклеточных белков (фосфорилированных или общих) в клеточных лизатах. Преимущества этой технологии связаны с комбинацией пары донор/акцептор FRET, демонстрирующей исключительную спектральную совместимость и сигнал TR-FRET, строго проверенные антитела и оптимизированные буферы лизиса. Эти анализы форматируются как сэндвич-иммуноанализы и используют простой трехэтапный рабочий процесс (рисунок 1). Клетки сначала обрабатывают для модуляции фосфорилирования белка, а затем лизируют специфическим буфером лизиса, предусмотренным в наборе. Целевой фосфорилированный или общий белок STAT в клеточном лизате обнаруживается на стадии добавления и инкубации реагента с парой флуорофор-меченых антител, которые распознают различные эпитопы на белке-мишени (рисунок 2). Одно антитело маркируется донором хелата европия (Eu-Ab1), в то время как второе антитело маркируется дальним красным акцепторным флуорофором (FR-Ab2). Два меченых антитела связываются с белком в растворе, в результате чего две метки находятся в непосредственной близости. Возбуждение донорского хелата европия при 320 или 340 нм запускает FRET к акцептору, который излучает долгоживущий сигнал TR-FRET на 665 нм, пропорциональный концентрации белка-мишени (фосфорилированного или общего) в клеточном лизате.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс анализа TR-FRET. Рабочий процесс состоит из трех этапов: обработка клеток, лизис клеток и обнаружение белка с использованием TR-FRET. В протоколе двухпластинчатого анализа лизаты переносятся на белую 384-луночную детектирующую пластину, тогда как в протоколе с одной пластиной все этапы проводятся в одной и той же белой 384-луночной детектирующей пластине (протокол «все в одной скважине»). Независимо от используемого протокола анализа, обнаружение белка выполняется в одном и том же общем объеме (20 мкл на лунку). Аббревиатура: TR-FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера с временным разрешением. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Рисунок 2: Принцип иммунологического анализа сэндвича TR-FRET. Одно антитело маркируется донором хелата европия (Eu-Ab1), а второе — дальнокрасым малым флуорофорным акцептором (FR-Ab2). Два меченых антитела связываются специфически с различными эпитопами на белке-мишени (фосфорилированном или общем) в клеточном лизате, в результате чего два флуорофора находятся в непосредственной близости. Возбуждение донора хелата европия при 320 или 340 нм запускает FRET от донора к молекулам-акцепторам, которые в свою очередь излучают сигнал на 665 нм. Этот сигнал пропорционален концентрации белка в клеточном лизате. При отсутствии специфического белка-мишени донорский и акцепторный флуорофоры находятся слишком далеко друг от друга для возникновения FRET. Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; TR-FRET = фрет с временным разрешением; Ab = антитело; FR = дальний красный; Eu - хелат европия; P = фосфорилирование. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Здесь представлены подробные протоколы для измерения в формате 384 лунки внутриклеточных уровней фосфорилированных STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) и STAT6 (Y641) вместе с общим количеством STAT1, STAT3, STAT5 и STAT6 в лизатах клеток из адгезивных или суспензионных ячеек с использованием платформы THUNDER TR-FRET. Эти протоколы определяют этапы обработки клеток, лизиса и обнаружения целевого белка на основе TR-FRET с использованием либо протокола передачи двух пластин, либо протокола «все в одной скважине». Эти клеточные анализы применяются для определения фармакологического профиля известных активаторов и ингибиторов пути JAK/STAT. Продемонстрирована надежность и пригодность выбранных анализов для ХТШ. Наконец, обсуждаются ключевые эксперименты по оптимизации анализа, а также рекомендации по устранению неполадок анализа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

Сигнальный путь Janus kinase (JAK)/сигнальный преобразователь и активатор транскрипции (STAT) играет решающую роль в опосредовании клеточных реакций на цитокины и факторы роста. Белки STAT активируются фосфорилированием тирозина, опосредованным главным образом JAK. Аномальная активация сигнальных путей STAT связана со многими заболеваниями человека, особенно раком и иммунными состояниями. Поэтому возможность мониторинга фосфорилирования белка STAT в нативной клеточной сигнальной среде важна как для академических исследований, так и для исследований по открытию лекарств. Традиционные форматы анализа, доступные для количественной оценки фосфорилированных белков STAT, включают вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ (ИФА). Эти гетерогенные методы являются трудоемкими, малопроизводительными и часто ненадежными (специфическими) в случае западного блоттинга. Однородные (без стирки) методы доступны, но остаются дорогими. 
Здесь представлены подробные протоколы для чувствительного, надежного и экономически эффективного измерения в формате 384 скважин эндогенных уровней фосфорилированных STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) и STAT6 (Y641) в лизатах клеток из адгезивных или суспензионных ячеек с использованием новой платформы резонансного переноса энергии Förster (TR-FRET) с временным разрешением THUNDER. Рабочий процесс для анализа сотовой связи прост, быстр и предназначен для высокопроизводительного скрининга (HTS). Протокол анализа является гибким, использует малообъемный образец (15 мкл), требует только одного этапа добавления реагента и может быть адаптирован к приложениям с низкой и высокой пропускной способностью. Каждый фосфо-STAT сэндвич иммуноанализ проверяется в оптимизированных условиях с известными агонистами и ингибиторами и генерирует ожидаемые значения фармакологии и Z'-фактора. Поскольку анализы TR-FRET являются ратиометрическими и не требуют этапов промывки, они обеспечивают гораздо лучшую воспроизводимость, чем традиционные подходы. Вместе этот набор анализов предоставляет новые экономически эффективные инструменты для более полного анализа специфических фосфорилированных белков STAT после обработки клеток, а также скрининга и характеристики специфических и селективных модуляторов сигнального пути JAK / STAT.

Каждый анализ THUNDER TR-FRET был фармакологически подтвержден путем лечения адгезивных (HeLa или A431) или суспензионных клеток (U266B1) активаторами или ингибиторами, специфичными для пути JAK / STAT, а затем измерением уровней конкретных фосфорилированных и общих STATs, когда это применимо. Анализы пров...

Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells at JoVE.com

Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Описаны протоколы клеточного анализа резонансного переноса энергии Фёрстера с временным разрешением для простой, специфической, чувствительной и надежной количественной оценки эндогенного фосфорилированного преобразователя сигнала и активатора транскрипции (STAT) 1/3/4/5/6 белков в клеточных лизатах в формате 384 лунки.

Резонансные анализы переноса энергии Фёрстера с временным разрешением для измерения эндогенных фосфорилированных белков STAT в клетках человека

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Анализы на основе TR-FRET предоставляют новые экономически эффективные инструменты для скрининга и фармакологической характеристики специфических и селективных модуляторов сигнальных путей JAK/STAT. Этот метод намного проще, быстрее, воспроизводим и надежнее, чем обычные методы, такие как вестерн-блоттинг и ИФА. Никаких этапов промывки не требуется, и реагенты добавляются за один шаг.Эта платформа иммуноанализа может быть легко применена к другим клеточным сигнальным белкам при условии наличия специфических антител. Для разработки воспроизводимых анализов необходимо использовать надлежащую практику культивирования клеток и установить стандартные рабочие процедуры. Кроме того, необходимо тщательно оптимизировать культуру клеток и условия лечения.Продемонстрировать процедуру продемонстрирует Женевьева Шатель, ученый из нашей лаборатории. Для начала культивируйте клетки HeLa и A431 в увлажненном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа с использованием DMEM, дополненного 10% FBS. Когда клетки достигнут слияния от 70 до 80%, попробуйте их и либо пройдите, либо используйте для анализов.Чтобы выполнить анализ, дозируйте 50 микролитров клеток с предварительно оптимизированной плотностью в 96-луночную пластину, обработанную культурой тканей в соответствующей питательной среде, затем инкубируйте их на ночь в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день готовят промежуточные двухкратные и четырехкратные серии разбавления исследуемых соединений путем последовательного разбавления соединения в безсыворочной среде через 12 лунок полипропиленовой 96-луночной пластины. Для стимуляции клеток добавьте 50 микролитров безсыворочной среды, содержащей тренажер в концентрации 2X, и инкубируйте клетки в течение предварительно оптимизированного времени либо при комнатной температуре, либо при 37 градусах.Для ингибирования клеток добавляют 25 микролитров свободной от сыворотки среды, содержащей ингибитор в концентрации 4X, и инкубируют клетки в течение предварительно оптимизированного времени либо при комнатной температуре, либо при 37 градусах, затем добавляют 25 микролитров безмятежной среды, содержащей стимулятор в концентрации 4X, и инкубируют в течение предварительно оптимизированного времени. Затем, чтобы лизировать клетки, подготовьте 1X дополненный буфер лизиса и добавьте к нему коктейль ингибитора фосфатазы. После тщательного удаления и выбрасывания клеточной культуральной среды сразу добавляют 50 микролитров приготовленного 1X дополненного лизисного буфера и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре при встряхивании с умеренным перемешиванием.Для обнаружения TR-FRET подготовьте смесь 4X для обнаружения антител в буфере обнаружения 1X, затем подготовьте растворы антител EUAB1 и FRAB2, а также растворы антител EUAB3 и FRAB4 в буфере обнаружения 1X. Наконец, смешайте предварительно разбавленный EUAB1 с предварительно разбавленным FRAB2 для обнаружения фосфопротеина и предварительно разбавленный EUAB3 и предварительно разбавленный FRAB4 для обнаружения общего белка. Затем аккуратно пипетку 15 микролитров клетки лизата с 96-луночной культуральной пластины в лунку из белой малообъемной 384-луночной микропластины.Затем добавьте 15 микролитров положительного контрольного лизата и 15 микролитров буфера лизиса 1X в качестве отрицательного контроля для разделения пробирных скважин. К скважинам, содержащим 15 микролитров лизата, добавляют пять микролитров соответствующей смеси для обнаружения антител 4X для обнаружения фосфопротеина или общего белка. После покрытия пластины герметиком, высиживайте ее при комнатной температуре в течение одного часа до ночи в зависимости от набора для анализа.После завершения инкубации снимите герметик клейкой пластины и считайте пластину на считывателе микропластин, совместимом с TR-FRET. Результаты анализов TR-FRET для обнаружения и количественной оценки фосфо-STAT1 с общим STAT1 и фосфо-STAT4 в клетках U266B1 вместе с фосфо-STAT5 с общим STAT5 в ячейках A431 представлены с использованием кривых реакции концентрации. Аналогичным образом, анализы TR-FRET для обнаружения и количественной оценки фосфо-STAT3 и общего STAT3 и фосфо-STAT6 и общего STAT6 в клетках HeLa представлены с использованием кривых реакции концентрации.В целом, все анализы показали надежные сигналы TR-FRET, широкие динамические диапазоны, низкое изменение коэффициента между скважинами и приемлемое отношение сигнала к фону. Лечение клеток активаторами JAK, интерфероном альфа-2B и IL-4 и EGF показало ожидаемое концентрационно-зависимое увеличение фосфорилирования STAT при специфических остатках тирозина, в то время как соответствующие общие белки STAT оставались стабильными. Как ингибитор JAK, так и эрлотиниб ингибировали соответствующие уровни фосфо-СТАТ в зависимости от концентрации.Результаты стимуляции фосфо-STAT4 интерфероном альфа-2B в клеточной линии суспензии или стимуляции фосфо-STAT6 IL-4 в клеточной линии адгезии с использованием протокола одной пластины соответствовали результатам, полученным с использованием протокола двух пластин, что свидетельствует об успешной адаптации протокола переноса двух пластин к протоколу однопластинки «все в одной скважине». Результаты исследования внутрипластинчатой изменчивости для анализа фосфо-STAT1 с использованием клеточной линии суспензии и анализа фосфо-STAT3 с использованием клеточной линии адгезии демонстрируют надежность этих анализов фосфо-STAT для применений HTS. Важно дополнить буфер лизиса коктейлем ингибитора фосфатазы, чтобы предотвратить дефосфорилирование фосфорилированных белков из активной фосфатазы, присутствующей во всем клеточном экстракте.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...