Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
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1. Cultivo celular
<ol><li>Mantener las células en una incubadora humidificada de 37 °C/5% de CO2 y cultivarlas con DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (células HeLa y A431) o RPMI suplementado con 15% de FBS (células U266B1). Cultive las células hasta que alcancen el 70-80% de confluencia, luego tripsinícelas y páselas o utilícelas para los ensayos. NOTA: Los medios de cultivo contenían rojo fenol. No se realizó inanición sérica para ninguna línea celular antes de realizar ...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. 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W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

En comparación con los métodos convencionales para el análisis de fosfoproteínas, como el western blotting y los métodos basados en ELISA, el flujo de trabajo para un ensayo celular THUNDER TR-FRET es simple y rápido, utiliza una muestra de bajo volumen (15 μL), está diseñado para HTS en un formato de 384 pocillos y es altamente susceptible de automatización. El protocolo de ensayo es flexible y se puede adaptar fácilmente a aplicaciones de rendimiento medio y alto. Los ensayos se pueden ejecutar utilizando un...

La vía de señalización JAK/STAT juega un papel clave en la mediación de las respuestas celulares a diversas citoquinas, interferones, factores de crecimiento y moléculas relacionadas1,2. La unión de estos ligandos a receptores específicos de la superficie celular da como resultado la activación de los JAK, que a su vez activan las proteínas STAT por fosforilación de residuos específicos de tirosina. La fosforilación STAT da como resultado su dimerización y translocación en el núcleo, donde ejercen su efecto sobre la transcripción de genes diana regulados. La familia STAT consta de siete miembros: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b y STAT6. Los miembros desempeñan un papel complejo y esencial en la regulación de los procesos celulares fisiológicos, incluida la proliferación, la diferenciación, la apoptosis, la angiogénesis y la regulación del sistema inmunológico. La activación anormal de las vías de señalización STAT está implicada en muchas enfermedades humanas, especialmente el cáncer y las afecciones relacionadas con el sistema inmunológico3,4. Por lo tanto, la capacidad de evaluar la fosforilación de la proteína STAT dentro del entorno de señalización celular nativa es importante tanto para la investigación académica como para la investigación de descubrimiento de fármacos.
Hasta la fecha, los métodos convencionales utilizados para medir los niveles de proteínas fosforiladas intracelulares, incluidos los STAT, se basan en anticuerpos e incluyen western blotting, ELISA y citometría de flujo de fósforo. Estos métodos heterogéneos requieren mucha mano de obra, consumen mucho tiempo, son propensos a errores, de bajo rendimiento y, a menudo, poco confiables (por ejemplo, problemas de especificidad) en el caso de Western Blotting5. Por el contrario, los ensayos homogéneos requieren menos pasos experimentales, utilizan volúmenes de muestra más pequeños y son susceptibles a HTS. Hay cinco plataformas homogéneas de inmunoensayo basadas en células disponibles comercialmente que se pueden usar para monitorear cuantitativamente la fosforilación dependiente de JAK de STATs en lisados celulares: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen y Lumit. Cada una de estas plataformas tiene sus ventajas y desventajas.
SureFire se basa en la tecnología de canalización de oxígeno luminiscente, que utiliza perlas de donantes y aceptores recubiertas para capturar específicamente un par de anticuerpos, uno de los cuales es biotinilado. En presencia de proteína fosforilada, los dos anticuerpos acercan las perlas donante y aceptora, lo que permite la generación de una señal quimioluminiscente6. Si bien es versátil y sensible, esta tecnología es costosa, se ve afectada por la biotina en el medio de cultivo, es muy sensible a la temperatura ambiente y la luz, y requiere un lector especial para la detección. HTRF y LANCE se basan en la tecnología TR-FRET que utiliza complejos de iones lantánidos luminiscentes de larga duración (quelatos de europio o terbio, o criptoto de europio) como moléculas donantes y fluoróforos de color rojo lejano como moléculas aceptoras7. Cuando dos anticuerpos específicos de proteínas marcados con moléculas donantes o aceptoras se acercan mucho, se produce FRET, causando un aumento en la fluorescencia del aceptor y una disminución en la fluorescencia del donante. Estas señales fluorescentes de larga duración se pueden medir de una manera termal y resuelta en el tiempo para reducir la interferencia del ensayo y aumentar la calidad de los datos. Otras ventajas de TR-FRET son que no es sensible a la luz, permite lecturas repetidas y exhibe una estabilidad de señal larga. Si bien TR-FRET está ampliamente implementado en HTS debido a su versatilidad, sensibilidad y alta robustez, todas las plataformas comerciales de ensayo basadas en TR-FRET son costosas, lo que impide su amplia adopción en laboratorios académicos y pequeños laboratorios industriales. El ensayo LanthaScreen también utiliza una lectura basada en TR-FRET, pero depende de una línea celular U2OS diseñada que expresa de manera estable la proteína de fusión verde fluorescente (GFP)-STAT1 combinada con un anticuerpo STAT1 fosfoespecífico marcado con terbio8. Además de ser limitado en términos de elección de proteínas de señalización, este método requiere la compra de costosas líneas celulares transfectadas, reduciendo su aplicabilidad y aumentando la posibilidad de artefactos experimentales. Lumit es una plataforma genérica de inmunoensayo bioluminiscente que utiliza anticuerpos secundarios (anti-ratón y anti-conejo) marcados químicamente con las subunidades nanobit pequeñas y grandes de NanoLuc Luciferase9. La unión de dos anticuerpos primarios a la proteína diana acerca a los anticuerpos secundarios para formar una enzima activa que genera una señal de luminiscencia. Si bien la luminiscencia es generalmente una lectura sensible y robusta, el requisito de anticuerpos primarios criados en dos especies diferentes limita las opciones para el diseño del ensayo. Además, el uso de anticuerpos secundarios en matrices de muestras complejas puede ser propenso a la interferencia del ensayo.
Por lo tanto, todavía existe la necesidad de una plataforma de ensayo basada en células confiable, rápida pero asequible para medir proteínas STAT fosforiladas y totales individuales de una manera compatible con HTS. Para abordar esta necesidad, se desarrolló una nueva plataforma de inmunoensayo basado en células de alto rendimiento basada en una tecnología TR-FRET mejorada (THUNDER) y diseñada para permitir una medición simple, sensible, robusta y rentable de proteínas intracelulares expresadas endógenamente (fosforiladas o totales) en lisados celulares. Las ventajas de esta tecnología se derivan de la combinación de un par FRET donante/aceptor que exhibe una compatibilidad espectral excepcional y una señal TR-FRET, anticuerpos rigurosamente validados y tampones de lisis optimizados. Estos ensayos se formatean como inmunoensayos sándwich y utilizan un flujo de trabajo sencillo de tres pasos (Figura 1). Las células se tratan primero para modular la fosforilación de proteínas y luego se lisan con el tampón de lisis específico proporcionado en el kit. La proteína STAT fosforilada o total objetivo en el lisado celular se detecta en una sola etapa de adición e incubación de reactivos con un par de anticuerpos marcados con fluoróforos que reconocen epítopos distintos en la proteína objetivo (Figura 2). Un anticuerpo está marcado con un donante de quelato de europio (Eu-Ab1), mientras que el segundo anticuerpo está marcado con un fluoróforo aceptor de color rojo lejano (FR-Ab2). Los dos anticuerpos marcados se unen a la proteína en solución, acercando las dos etiquetas. La excitación del quelato de europio del donante a 320 o 340 nm desencadena un FRET al aceptor, que emite una señal TR-FRET de larga duración a 665 nm proporcional a la concentración de proteína objetivo (fosforilada o total) en el lisado celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo de ensayo TR-FRET. El flujo de trabajo consta de tres pasos: tratamiento celular, lisis celular y detección de proteínas mediante TR-FRET. En el protocolo de ensayo de dos placas, los lisados se transfieren a una placa de detección blanca de 384 pocillos, mientras que en el protocolo de una placa, todos los pasos se llevan a cabo en la misma placa de detección blanca de 384 pocillos (protocolo todo en un pozo). Independientemente del protocolo de ensayo utilizado, la detección de proteínas se realiza en el mismo volumen total (20 μL por pocillo). Abreviatura: TR-FRET = transferencia de energía de resonancia de Förster resuelta en el tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Figura 2: Principio de inmunoensayo sándwich TR-FRET. Un anticuerpo está marcado con el donante de quelato de europio (Eu-Ab1) y el segundo con el aceptor de fluoróforo pequeño de color rojo lejano (FR-Ab2). Los dos anticuerpos marcados se unen específicamente a epítopos distintos en la proteína objetivo (fosforilada o total) en el lisado celular, acercando los dos fluoróforos. La excitación del quelato de europio del donante a 320 o 340 nm desencadena un FRET del donante a las moléculas aceptoras, que a su vez emiten una señal a 665 nm. Esta señal es proporcional a la concentración de proteína en el lisado celular. En ausencia de la proteína diana específica, los fluoróforos donante y aceptor están demasiado distantes entre sí para que ocurra FRET. Abreviaturas: FRET = transferencia de energía de resonancia de Förster; TR-FRET = FRET resuelto en el tiempo; Ab = anticuerpo; FR = rojo lejano; Eu - quelato de europio; P = fosforilación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aquí, se proporcionan protocolos detallados para medir, en un formato de 384 pocillos, los niveles intracelulares de STAT1 fosforilado (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) y STAT6 (Y641), junto con STAT1, STAT3, STAT5 y STAT6 totales, en lisados celulares de celdas adherentes o de suspensión utilizando la plataforma THUNDER TR-FRET. Estos protocolos definen los pasos para el tratamiento celular, la lisis y la detección de proteínas diana basadas en TR-FRET utilizando un protocolo de transferencia de dos placas o un protocolo todo en un pocillo de una placa. Estos ensayos basados en células se aplican para determinar el perfil farmacológico de los activadores e inhibidores conocidos de la vía JAK/STAT. Se demuestra la robustez e idoneidad de los ensayos seleccionados para HTS. Por último, se discuten los experimentos clave para la optimización de ensayos, junto con recomendaciones para la solución de problemas de ensayos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

La vía de señalización de la quinasa Janus (JAK)/transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) desempeña un papel crucial en la mediación de las respuestas celulares a las citoquinas y los factores de crecimiento. Las proteínas STAT son activadas por fosforilación de tirosina mediada principalmente por JAK. La activación anormal de las vías de señalización STAT está implicada en muchas enfermedades humanas, especialmente el cáncer y las afecciones relacionadas con el sistema inmunológico. Por lo tanto, la capacidad de monitorear la fosforilación de la proteína STAT dentro del entorno de señalización celular nativa es importante tanto para la investigación académica como para la investigación de descubrimiento de fármacos. Los formatos de ensayo tradicionales disponibles para cuantificar las proteínas STAT fosforiladas incluyen western blotting y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Estos métodos heterogéneos son intensivos en mano de obra, de bajo rendimiento y, a menudo, no confiables (específicos) en el caso de Western Blotting. Los métodos homogéneos (sin lavado) están disponibles, pero siguen siendo caros. 
Aquí, se proporcionan protocolos detallados para la medición sensible, robusta y rentable en un formato de 384 pocillos de niveles endógenos de STAT1 fosforilado (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) y STAT6 (Y641) en lisados celulares de células adherentes o de suspensión utilizando la nueva plataforma de transferencia de energía de resonancia de Förster resuelta en el tiempo (TR-FRET) THUNDER. El flujo de trabajo para el ensayo celular es simple, rápido y está diseñado para el cribado de alto rendimiento (HTS). El protocolo de ensayo es flexible, utiliza una muestra de bajo volumen (15 μL), requiere solo un paso de adición de reactivos y se puede adaptar a aplicaciones de bajo rendimiento y alto rendimiento. Cada inmunoensayo sándwich fosfo-STAT se valida en condiciones optimizadas con agonistas e inhibidores conocidos y genera los valores esperados de farmacología y factor Z'. Como los ensayos TR-FRET son ratiométricos y no requieren pasos de lavado, proporcionan una reproducibilidad mucho mejor que los enfoques tradicionales. Juntos, este conjunto de ensayos proporciona nuevas herramientas rentables para un análisis más completo de proteínas STAT fosforiladas específicas después del tratamiento celular y la detección y caracterización de moduladores específicos y selectivos de la vía de señalización JAK / STAT.

Cada ensayo THUNDER TR-FRET se validó farmacológicamente mediante el tratamiento de células adherentes (HeLa o A431) o de suspensión (U266B1) con activadores o inhibidores específicos de la vía JAK/STAT y luego midiendo los niveles de STATs fosforilados y totales específicos, cuando corresponda. Los ensayos se realizaron en formato de 384 pocillos utilizando el protocolo de transferencia de dos placas y las condiciones de ensayo preoptimizadas. La Figura 3, la Fig...

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Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Los protocolos de ensayo basados en células de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo se describen para la cuantificación simple, específica, sensible y robusta del transductor de señal fosforilada endógena y el activador de la transcripción (STAT) 1/3/4/5/6 proteínas en lisados celulares en un formato de 384 pocillos.

Ensayos de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo para la medición de proteínas STAT fosforiladas endógenas en células humanas

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Los ensayos basados en TR-FRET proporcionan nuevas herramientas rentables para el cribado y la caracterización farmacológica de moduladores específicos y selectivos de las vías de señalización JAK/STAT. Esta técnica es mucho más fácil, rápida, reproducible y robusta que los métodos convencionales como Western blot y ELISA. No se requieren pasos de lavado y los reactivos se agregan en un solo paso.Esta plataforma de inmunoensayo se puede aplicar fácilmente a otras proteínas de señalización celular siempre que se disponga de anticuerpos específicos. Para diseñar ensayos reproducibles, debe utilizar buenas prácticas de cultivo celular y establecer procedimientos operativos estándar. Además, debe optimizar cuidadosamente las condiciones de cultivo y tratamiento celular.Demostrando el procedimiento estará Genevieve Chatel, una científica de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive células HeLa y A431 en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono utilizando DMEM complementado con 10% FBS. Cuando las células alcancen el 70 a 80% de confluencia, tripsinícelas y páselas o úselas para ensayos.Para realizar el ensayo, dispense 50 microlitros de células a la densidad preoptimizada en una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos en el medio de cultivo apropiado, luego incube durante la noche en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, prepare series intermedias de dilución doble y cuádruple de los compuestos de prueba diluyendo en serie el compuesto en un medio libre de suero en 12 pocillos de una placa de polipropileno de 96 pocillos. Para la estimulación celular, agregue 50 microlitros de medio libre de suero que contenga el simulador a una concentración de 2X e incube las células durante el tiempo preoptimizado a temperatura ambiente o 37 grados.Para la inhibición celular, agregue 25 microlitros de medio libre de suero que contenga el inhibidor a una concentración de 4X e incube las células durante el tiempo preoptimizado a temperatura ambiente o 37 grados, luego agregue 25 microlitros de medio libre de suero que contenga el estimulador a una concentración de 4X e incube durante el tiempo preoptimizado. A continuación, para lisar las células, prepare el tampón de lisis suplementado 1X y agréguele un cóctel inhibidor de la fosfatasa. Después de retirar y desechar cuidadosamente el medio de cultivo celular, agregue inmediatamente 50 microlitros del tampón de lisis suplementado 1X preparado e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo agitación con agitación moderada.Para la detección TR-FRET, prepare la mezcla de detección de anticuerpos 4X en el tampón de detección 1X, luego prepare las soluciones de anticuerpos EUAB1 y FRAB2, así como las soluciones de anticuerpos EUAB3 y FRAB4 en el tampón de detección 1X. Finalmente, mezcle EUAB1 prediluido con FRAB2 prediluido para la detección de fosfoproteína y EUAB3 prediluido y FRAB4 prediluido para la detección de proteína total. Luego, pipetee cuidadosamente 15 microlitros del lisado celular de la placa de cultivo de 96 pocillos a un pozo de una microplaca blanca de bajo volumen de 384 pocillos.A continuación, agregue 15 microlitros del lisado de control positivo y 15 microlitros de tampón de lisis 1X como control negativo para separar los pozos de ensayo. A los pocillos que contienen 15 microlitros del lisado, agregue cinco microlitros de la mezcla de detección de anticuerpos 4X correspondiente para detectar la fosfoproteína o la proteína total. Después de cubrir la placa con un sellador de placas, incube a temperatura ambiente durante una hora o durante la noche, dependiendo del kit de ensayo.Una vez completada la incubación, retire el sellador de placas adhesivas y lea la placa en un lector de microplacas compatible con TR-FRET. Los resultados de los ensayos TR-FRET para la detección y cuantificación de fosfo-STAT1 con STAT1 total y fosfo-STAT4 en células U266B1 junto con fosfo-STAT5 con STAT5 total en células A431 se representan utilizando curvas de respuesta de concentración. Del mismo modo, los ensayos TR-FRET para la detección y cuantificación de fosfo-STAT3 y STAT3 total y fosfo-STAT6 y STAT6 total en células HeLa se representan utilizando curvas de respuesta de concentración.En general, todos los ensayos mostraron señales TR-FRET robustas, amplios rangos dinámicos, baja variación del coeficiente entre pozos y relaciones aceptables de señal a fondo. El tratamiento de células con activadores de JAK, interferón alfa-2B e IL-4 y EGF mostró el aumento anticipado dependiente de la concentración en la fosforilación de STAT en residuos específicos de tirosina, mientras que las proteínas STAT totales correspondientes se mantuvieron estables. Tanto el inhibidor de JAK como el erlotinib inhibieron los niveles correspondientes de fosfo-STAT de una manera dependiente de la concentración.Los resultados de la estimulación fosfo-STAT4 por interferón alfa-2B en una línea celular de suspensión o la estimulación fosfo-STAT6 por IL-4 en una línea celular de adherencia utilizando el protocolo de una placa fueron consistentes con los obtenidos utilizando el protocolo de dos placas, mostrando así una adaptabilidad exitosa de un protocolo de transferencia de dos placas a un protocolo de pozo todo en uno de una placa. Los resultados del estudio de variabilidad intraplaca para el ensayo fosfo-STAT1 utilizando una línea celular en suspensión y el ensayo fosfo-STAT3 utilizando una línea celular de adherencia demuestran la robustez de estos ensayos fosfo-STAT para aplicaciones HTS. Es esencial complementar el tampón de lisis con el cóctel inhibidor de la fosfatasa para evitar la desfosforilación de las proteínas fosforiladas de la fosfatasa activa presente en todo el extracto celular.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Investigación

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Eliminación Y Reemplazo De Ligandos Endógenos De Proteínas Ligadas A Lípidos Y Alérgenos

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...