Name: imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health unterstützt Das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) gewährt R01NS069726 und R01NS094539 an SD. Wir danken Erica DeMers für die Audioaufnahme.

Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Missouri-Columbia genehmigt.
1. Aufbau von DNA-Plasmiden
HINWEIS: Für die In-vitro- und In-vivo-Bildgebung werden DNA-Plasmide konstruiert, die für GCaMP5G/6s mit Astrozyten- und Neuronen-spezifischen Promotoren und mitochondrialen Targeting-Sequenzen kodieren.
<ol><li>Einfügen der mitochondrialen Matrix (MM)-Targeting-Sequ...

<ol>
	<li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells.">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li><li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++homeostasis:+mechanism,+role,+and+tissue+specificities.">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li><li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR/AGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons.">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li><li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. 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M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+The+calcium+connection.">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2++indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells.">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells.">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li><li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2++signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction.">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+Ca2++dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G/6s:+Mitochondrial+Ca2++uptake+and+cytosolic+Ca2++availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store.">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li><li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2++signals+in+cultured+astrocytes.">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li><li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models.">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li><li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia.">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+NAMPT-mediated+NAD++salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury.">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li><li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice.">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li><li>Ding, S., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. , 545-554 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2++signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke.">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2++signaling+in+vivo.">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+astrocytic+Ca2++signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus.">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li><li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling.">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle.">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821 (2021).</li></ol>

In diesem Artikel stellen wir eine Methode und ein Protokoll zur Abbildung mitochondrialer Ca2+-Signale in Astrozyten und Neuronen zur Verfügung. Wir implementierten Mitochondria-Targeting- und zelltypspezifische Strategien, um GECI GCaMP5G/6s zu exprimieren. Um GCaMP5G/6s in Mitochondrien anzugreifen, haben wir eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz in die Plasmide aufgenommen. Um GCaMP5G/6s in Astrozyten und Neuronen in vivo zu exprimieren,haben wir einen Astrozyten-spezifischen Promotor gfaABC1D und...

Mitochondrien sind dynamische subzelluläre Organellen und gelten als Zellkraftwerke für die Energieproduktion. Auf der anderen Seite können MitochondrienCa2+ in die Matrix aufnehmen, als Reaktion auf lokale oder zytosolischeCa2+ Anstiege. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme beeinflusst die mitochondriale Funktion, einschließlich Stoffwechselprozesse wie Reaktionen im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidative Phosphorylierung, und reguliertCa2+-empfindlicheProteine unter physiologischenBedingungen 1,2,3,4. Mitochondriale Ca2+ Überlastung ist auch eine Determinante für den Zelltod, einschließlich Nekrose und Apoptose bei verschiedenen Hirnerkrankungen5,6,7. Es verursacht die Öffnung von mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTPs) und die Freisetzung von Caspase-Cofaktor, die den apoptotischen Zelltod einleiten. Daher ist es wichtig, die mitochondrialeCa2+-Dynamik und -Handhabung in lebenden Zellen zu untersuchen, um die zelluläre Physiologie und Pathologie besser zu verstehen.
Mitochondrien erhalten die MatrixCa2+ Homöostase durch ein Gleichgewicht zwischen Ca2+ Aufnahme und Efflux. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme wird hauptsächlich durch mitochondrialeCa2+-Uniporter (MCUs) vermittelt, während der mitochondrialeCa2+-Efflux durch die Na+-Ca2+-Li+-Austauscher (NCLXs) und dieH+/Ca2+-Austauscher(mHCXs)8vermittelt wird. Das Gleichgewicht kann durch die Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gestört werden9. MitochondrialeCa2+ Homöostase wird auch durch mitochondriale Pufferung durch die Bildung von unlöslichenxCa2+-xPO4x-xOH-Komplexenbeeinflusst 8.
Intrazelluläre und mitochondriale Veränderungen derCa2+-Konzentration ([Ca2+])können durch fluoreszierende oder lumineszierendeCa2+-Indikatoren bewertet werden. Die Bindung von Ca2+ an Indikatoren verursacht spektrale Modifikationen, die es ermöglichen, freie zelluläre [Ca2+] in Echtzeit in lebenden Zellen aufzuzeichnen. Derzeit stehen zwei Arten von Sonden zur Verfügung, um Ca2+-Veränderungen in Zellen zu überwachen: organisch-chemische Indikatoren und genetisch kodierteCa2+-Indikatoren (GECIs). Im Allgemeinen stehen für die untersuchten biologischen Fragestellungen unterschiedliche Varianten mit unterschiedlichenCa2+-Affinitäten (basierend auf Kd),spektralen Eigenschaften (Anregungs- und Emissionswellenlängen), Dynamikbereichen und Sensitivitäten zur Verfügung. Obwohl viele synthetische organische Ca2+-Indikatoren für die zytosolischeCa2+-Bildgebung verwendet wurden, können nur wenige selektiv in die mitochondriale Matrix für die mitochondrialeCa2+-Bildgebung geladen werden, wobei Rhod-2 am weitesten verbreitet ist (für Reviews siehe10,11). Rhod-2 hat jedoch einen großen Nachteil der Leckage bei langen Zeitverlaufsexperimenten; Darüber hinaus ist es zwischen Mitochondrien, anderen Organellen und dem Zytosol aufgeteilt, was absolute Messungen in verschiedenen Unterkompartimenten erschwert. Im Gegensatz dazu können GECIs durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren und subzellulären Kompartiment-Targeting-Sequenzen in verschiedenen Zelltypen und subzellulären Kompartimenten für die zell- und kompartimentspezifischeCa2+-Bildgebung in vitro oder in vivoexprimiert werden. Einwellenlängen-Fluoreszenzintensitäts-basierte GCaMP Ca2+ Indikatoren haben sich kürzlich als Haupt-GECIs12,13,14,15,16herausgestellt. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Mitochondria-Targeting und die zelltypspezifische Expression von GCaMP5G und GCaMP6s (GCaMP5G/6s) in Astrozyten und Neuronen sowie die Abbildung der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme in diesen Zelltypen zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die Expression von GCaMP6G/6s in einzelnen Mitochondrien aufgedeckt werden, und ca2+ Aufnahme in einzelner mitochondrialer Auflösung kann in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivoerreicht werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears ointment</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td>3M Vetbond Adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 2B</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps with fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>for removal of dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td>for cranial window cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed micro drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>for viral injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9793</td>
			<td>reducing movement artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal frame</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>see Fig 1</td>
			<td>for brain attachment to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3</td>
			<td>Injection speed controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotaxic device</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51725</td>
			<td>for holding mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Persfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA-VM8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-regulating heating pad</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>21061</td>
			<td>to prevent hypothermia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-359</td>
			<td>red fluorescent dye to label astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-23</td>
			<td>for clearing of material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>10 mg/kg body weight</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)

MitochondrialesCa2+ spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zytosolischenCa2+-Pufferung, des Energiestoffwechsels und der zellulären Signaltransduktion. Die Überlastung des mitochondrialen Ca2+ trägt zu verschiedenen pathologischen Zuständen bei, einschließlich Neurodegeneration und apoptotischem Zelltod bei neurologischen Erkrankungen. Hier stellen wir einen zelltypspezifischen und auf Mitochondrien abzielenden molekularen Ansatz für die mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivovor. Wir konstruierten DNA-Plasmide, die für Mitochondrien kodieren, die auf genetisch kodierte Ca2+ Indikatoren (GECIs) GCaMP5G oder GCaMP6s (GCaMP5G/6s) mit astrozyten- und neuronenspezifischen Promotoren gfaABC1D und CaMKII und mitochondrien-Targeting-Sequenz (mito-) abzielen. Für die in vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden die Plasmide in kultivierten Astrozyten und Neuronen transfiziert, um GCaMP5G/6s zu exprimieren. Für die in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) hergestellt und in das Gehirn der Maus injiziert, um GCaMP5G/6s in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen zu exprimieren. Unser Ansatz bietet ein nützliches Mittel, um die mitochondrialeCa2+-Dynamik in Astrozyten und Neuronen abzubilden, um die Beziehung zwischen zytosolischer und mitochondrialerCa2+-Signalgebung sowie Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen.

Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zur Abbildung mitochondrialer Ca2+-Signale unter Verwendung von GECIs in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivo bereitzustellen. Ergebnisse der in vitro und in vivo mitochondrialen Ca2+ Bildgebung werden hier vorgestellt.
In vitro mitochondriale Ca2+ Signalisierung in kultivierten Astrozyten und Neuronen</stron...

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Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Das Verfahren werden der Doktorand Zhe Zhang, der Forschungsspezialist Nannan Zhang, die Professoren Illker Ozden und Shinghua Ding demonstrieren. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung von zelltypspezifischen Astrozytenpaaren und neuronen sowie der mitochondrialen Targeting-Methode für in vitro und in vivo mitochondriale Bildgebungszählungen unter Verwendung des genetisch kodierten Kalziumindikators GCaMP5G und 6s. Für die In-vitro- oder In-vivo-Bildgebung werden wir DNA-Plasmide konstruieren, die Astrozyten- oder Neuronen-spezifische Promotoren gfaABC1D oder CaMKII und genetisch kodierte Kalziumindikatoren, GCaMP5G/6s mit mitochondrialen Targeting-Sequenzen enthalten.Für die in vitro mitochondriale Calciumbildgebung transfizierten wir Astrozytenneuronen, die auf Glasabdeckungsrutschen kultiviert wurden, mit den oben genannten DNA-Plasmiden unter Verwendung der Lipofectamin-Methode. Die Bildgebung kann ein bis zwei Tage nach der Transfektion begonnen werden, indem die Glasabdeckungsrutschen unter einem Epifluoreszenz- oder Zwei-Photonen-Mikroskop in die Profusionskammer übertragen werden. Hier sind Beispiele für fluoreszierende Signale von Mitochondrien und einem Astrozyten, der GCaMP6s auf der linken Seite exprimiert, und für Mitochondrien in einem Neuron, die GCaMP5G auf der rechten Seite exprimieren.Für die In-vivo-Bildgebung haben wir das Serotyp-5-assoziierte Adenovirus für die Expression von Mito-GCaMP5G in Astrozyten und das Serotyp-9-assoziierte Adenovirus für die Expression von Mito-GCaMP6s in Neuronen hergestellt. Für stereotaktische Virusinjektionsoperationen haben wir die Maus zunächst mit 3% Isofluran betäubt. Später während der Operation wird der Isofluranspiegel auf 2% reduziert Nachdem das richtige Anästhesieniveau erreicht ist, werden die Haare über der Kopfhaut rasiert und die Maus auf einem stereosteuerlichen chirurgischen Instrument positioniert.Eine Augensalbe wird auf die Augen aufgetragen, um sie während der Operation zu schützen. Die Injektionsoperationen werden mit aseptischen Verfahren durchgeführt, einschließlich steriler Instrumente und aseptischer Techniken. Die chirurgischen Instrumente werden entweder durch Autoklavieren oder durch einen Heißperlensterilisator sterilisiert.Nachdem die Maus auf der Stereotax montiert ist, wird die Kopfhaut dreimal mit Betadin und 70% Ethanol gereinigt. Dann wird die Haut entlang der Bregma Lambda-Achse aufgeschnitten und die Vertikale wird durch einen Hochgeschwindigkeitsbohrer über die Zielposition gemacht. In dieser Arbeit zielten wir entweder auf den motorischen Kortex oder den Paracortex ab.Eine Hamilton-Spritze mit 33 Messgeräten, die einen assoziierten Adenovirus-Vektor trägt, wird durch das Loch in das Gehirn eingeführt und Vektoren werden im Zielbereich injiziert. Für die kortikale Verabreichung injizieren wir die Viruslösung in zwei Tiefen in mehreren Schritten. Zuerst führen wir die Nadel einen Millimeter tief in den Kortex ein.Nachdem wir dem Gehirn fünf Minuten Zeit gegeben haben, um sich zu erholen, bewegen wir die Nadel bis zu 700 Mikrometer tief und injizieren 500 Nanoliter Viruslösung. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten wir fünf Minuten, damit das Virus im Gehirn diffundieren kann. Und dann bewegen wir die Nadel bis zur zweiten Injektionsstelle in 300 Mikrometer Tiefe.Hier injizieren wir weitere 500 Nanoliter Viruslösung. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten wir 10 Minuten, um das Virus diffundieren zu lassen, und dann entfernen wir die Nadel aus dem Gehirn und schließen das Gratloch mit Knochenwachs oder Kwik-Sil. Schließlich wird die Haut mit Vetbond vernäht und die Maus wird auf einem Heizkissen geborgen, bevor sie in die Tiereinrichtung zurückgeschickt wird.Die Maus wird in mindestens drei Wochen für die In-vivo-Bildgebung bereit sein, was dem Zeitrahmen entspricht, in dem die GCaMP-Expression reift. Schädelfensterimplantationsoperationen werden auch unter Verwendung aseptischer Bedingungen durchgeführt, wie für Injektionsoperationen beschrieben. Die chirurgischen Verfahren des Schädelfensters sind identisch mit den chirurgischen Injektionsverfahren bis zur Schädelexposition.Sobald der Schädel freigelegt ist, werden Viertel einer Kraniotomie mit einem Durchmesser von 2-3 mm über dem vom Virus injizierten Bereich mit vier flachen Löchern markiert, die von einem Hochgeschwindigkeitsbohrer hergestellt werden, der an einem Manipulator befestigt ist. Dann wird der Abschnitt des Schädels an den Schluchten der Kraniotomie verdünnt, indem der Knochen vorsichtig und langsam in einem Kreis herumgebohrt wird, der diese vier Löcher verbindet. Sobald der Schädel an den Rändern dünn genug ist, wird der Knochen mit einer scharfen Pinzette angehoben und entfernt.Die freiliegende Dura mater kann für die Implantation des Schädelfensters entfernt oder intakt gehalten werden. Unser Schädelfenster besteht aus einem Glasabdeckungsschlupf mit einem Durchmesser von 3-5 Millimetern, wodurch in der Mitte eine etwa 300 Mikrometer dicke Silikonscheibe entsteht. Die Montage des Schädelfensters erfolgt, indem es über die Kraniotomie gelegt wird.Ein Stück Zahnstocher, das an einem Manipulator befestigt ist, wird verwendet, um das Schädelfenster sanft auf die Oberfläche des Gehirns zu drücken. Dann wird die Kante des Schädelfensters mit einer kleinen Menge Silikonkleber Kwik-Sil versiegelt. Schließlich wird das Schädelfenster in den Schädelrändern mit Dentalacryl fixiert.Es sollte darauf geachtet werden, dass das Dentalacryl leicht über die Kanten des Schädelfensters aufgetragen wird, um eine starke Verklebung zu gewährleisten. Wie viele andere Forschungsgruppen in der Vergangenheit implementiert haben, kann ein 1,2% Agarosegel zwischen dem Deckglas und dem Gehirn als Alternative zur Silikonscheibe verwendet werden. Nachdem das Schädelfenster sicher installiert ist, wird eine Metallplatte am Schädel befestigt.Diese Kopfplatte wird verwendet, um den Kopf der Maus auf der Bühne eines Zwei-Photonen-Mikroskops während der Bildgebungssitzungen zu fixieren. Mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten kann durch ATD-Anwendung ausgelöst werden, während mitochondriale Kalziumaufnahme in Neuronen durch Glutamat-Glycin-Anwendung in künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit mit Schwerkraft durch ein Perfusionssystem ausgelöst werden kann. Die Kalziumaufnahme in einzelnen Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen kann dann beobachtet werden.Die folgenden Filme zeigen die mitochondriale Kalziumaufnahme in einem Astrozyten, der links durch ATP und rechts durch Glutamat und Glycin hervorgerufen wird. Die Bildgebung erfolgt durch das Sammeln von zeitrafften In-vivo-Zwei-Photonen-Bildern von mitochondrialen Fluoreszenzsignalen in Astrozyten und Neuronen mit einem Ultima-Zwei-Photonen-Mikroskopiesystem von Prairie Technologies, das mit einer Million Ti Sapphire Ultra einem Laser von Coherent ausgestattet ist. Wir nutzen die Anregungswellenlängen von 880 bis 910 Nanometern, die für die In-vivo-Bildgebung mit GCaMP5G und 6s optimal sind.Astrozyten und neuronenspezifische Expression von Mito-GCaMP5G und 6s und durch Kolokalisation der Astrozyten-spezifischen Markierung von SR101 oder neuronenspezifischem Marker NeuN erneut bestätigt. Die spontane mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten und Neuronen in vivo kann durch Zeitrafferbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet werden. Bilder zeigen spontane Kalziumerhöhungen in einzelnen Mitochondrien in einem Astrozyten auf der linken Seite und einem Neuron auf der rechten Seite.Unsere Ansätze sind nützlich für die zelltypspezifische mitochondriale Calciumbildgebung in vitro und in vivo. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mitochondriale Kalziumaufnahme in Astrozyten und in Neuronen abbilden können.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

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In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

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Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

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Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

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Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...