Name: imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00
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この研究は、国立衛生研究所神経障害・脳卒中研究所(NINDS)がR01NS069726とR01NS094539をSDに付与することによって支援されました。私たちは、オーディオ録音のためにエリカDeMersに感謝します。

動物に関する手続きは、ミズーリ大学コロンビア校の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. DNAプラスミドの構築
注: インビトロ および インビボ イメージングでは、アストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターおよびミトコンドリア標的配列を有するGCaMP5G/6sをコードするDNAプラスミドが構築?...

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	<li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells.">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li><li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++homeostasis:+mechanism,+role,+and+tissue+specificities.">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li><li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR/AGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons.">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li><li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signaling+mediates+rhythmic+extracellular+ATP+accumulation+in+suprachiasmatic+nucleus+astrocytes.">Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).</li><li>Duchen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease.">Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).</li><li>Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+handling+during+ischemia-induced+cell+death+in+neurons.">Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons.</a> Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).</li><li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uniporter+Mcu+controls+excitotoxicity+and+is+transcriptionally+repressed+by+neuroprotective+nuclear+calcium+signals.">Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals.</a> Nature Communications. 4, 2034 (2013).</li><li>Filadi, R., Greotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+mitochondrial+Ca2++signaling+in+cell+physiology+and+pathology.">The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology.</a> Cell Calcium. 93, 102321 (2021).</li><li>Finkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+mitochondrial+calcium.">The ins and outs of mitochondrial calcium.</a> Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+The+calcium+connection.">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2++indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells.">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells.">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li><li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2++signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction.">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+Ca2++dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G/6s:+Mitochondrial+Ca2++uptake+and+cytosolic+Ca2++availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store.">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li><li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2++signals+in+cultured+astrocytes.">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li><li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models.">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li><li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia.">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+NAMPT-mediated+NAD++salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury.">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li><li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice.">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li><li>Ding, S., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. , 545-554 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2++signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke.">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2++signaling+in+vivo.">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+astrocytic+Ca2++signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus.">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li><li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling.">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle.">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821 (2021).</li></ol>

本稿では、アストロサイトやニューロンにおけるミトコンドリアCa2+信号をイメージングする方法とプロトコルを提供します。GECI GCaMP5G/6sを表現するために、ミトコンドリアターゲティングおよび細胞型特異的戦略を実施しました。ミトコンドリアでGCaMP5G/6sを標的にするために、プラスミドにミトコンドリアターゲティング配列を含む。生体内のアストロサイトおよびニューロ...

ミトコンドリアは、細胞内の動的な小器官であり、エネルギー生産のための細胞大国と考えられています。一方、ミトコンドリアは、局所的または細胞質Ca2+上昇に応答して、母体にCa2+を取ることができます。ミトコンドリアCa2+取り込みは、三カルボン酸(TCA)サイクルおよび酸化リン酸化における反応などの代謝過程を含むミトコンドリア機能に影響を及ぼし、生理学的条件下でCa2+感受性タンパク質を調節する1、2、3、4。ミトコンドリアCa2+過負荷はまた、細胞死の決定要因であり、様々な脳障害における壊死およびアポトーシスを含む5、6、7。これは、ミトコンドリア透過性遷移細孔(mpPPs)の開口部とアポトーシス細胞死を開始するカスパーゼ補因子の放出を引き起こす。したがって、細胞生理学と病理をよりよく理解するために、生きている細胞におけるミトコンドリアCa2+のダイナミクスと取り扱いを研究することが重要です。
ミトコンドリアは、Ca2+取り込みと流出のバランスをとってマトリックスCa2+ホメオスタシスを維持します。ミトコンドリアCa2+取り込みは主にミトコンドリアCa2+ユニポーター(MCUs)によって媒介され、ミトコンドリアCa2+流出はNa+-Ca2+-Li+交換器(NCLX)とH+/Ca2+交換器(mHCXs)8によって媒介される。バランスは、Gタンパク質共役受容体(GPDR)9の刺激を通じて摂動することができる。ミトコンドリアCa2+ホメオスタシスも、不溶性xCa 2+-xPO4 x-xOH複合体8の形成によるミトコンドリア緩衝の影響を受ける。
細胞内およびミトコンドリア濃度の変化([Ca2+])は、蛍光または発光Ca2+指標によって評価することができる。標識へのCa2+結合はスペクトル修飾を引き起こし、生細胞でのリアルタイムでの自由な細胞[Ca2+]の記録を可能にする。現在、細胞内のCa2+の変化を監視するために、有機化学指標と遺伝的にコード化されたCa2+指標(GECI)の2種類のプローブが利用可能です。一般的に、異なるCa2+親和性(Kdに基づく)、スペクトル特性(励起および発光波長)、動的範囲、および感度が調査中の生物学的問題に対して利用可能である異なる変異体が利用可能である。多くの合成有機Ca2+指標が細胞質Ca2+イメージングに使用されていますが、ミトコンドリアCa2+イメージング用のミトコンドリアマトリックスに選択的にロードできるのはごくわずかですが、Rhod-2が最も広く使用されています(レビューでは10,11を参照)。しかし、Rhod-2 は、長い時間経過実験の間に漏れの大きな欠点があります。さらに、ミトコンドリア、他のオルガネラ、サイトゾルの間で分割され、異なるサブコンパートメントでの絶対測定が困難になります。対照的に、細胞型プロモーターおよび細胞内区画ターゲティング配列を用いることによって、GECIは、インビトロまたはインビボで細胞およびコンパートメント特異的なCa2+イメージング用の異なる細胞タイプおよび細胞下コンパートメントで発現することができる。単一波長蛍光強度ベースのGCaMP Ca2+指標は、最近、主要なGEIS12、13、14、15、16として登場しました。本稿では、アストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5GおよびGCaMP6s(GCaMP5G/6s)のミトコンドリア標的化および細胞型特異的発現のプロトコルと、これらの細胞タイプにおけるミトコンドリアCa2+の取り込みについて説明する。このプロトコルを用いて、個々のミトコンドリアにおけるGCaMP6G/6sの発現が明らかにでき、そして単一ミトコンドリア分解能におけるCa2+取り込みは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおいて達成することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears ointment</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td>3M Vetbond Adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 2B</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps with fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>for removal of dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td>for cranial window cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed micro drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>for viral injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9793</td>
			<td>reducing movement artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal frame</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>see Fig 1</td>
			<td>for brain attachment to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3</td>
			<td>Injection speed controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotaxic device</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51725</td>
			<td>for holding mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Persfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA-VM8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-regulating heating pad</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>21061</td>
			<td>to prevent hypothermia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-359</td>
			<td>red fluorescent dye to label astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-23</td>
			<td>for clearing of material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>10 mg/kg body weight</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)

ミトコンドリアCa2+は、細胞質Ca2+緩衝、エネルギー代謝、細胞シグナル伝達を制御する上で重要な役割を果たしています。ミトコンドリアCa2+の過負荷は、神経変性および神経疾患におけるアポトーシス細胞死を含む様々な病理学的状態に寄与する。ここでは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリアCa2+イメージングに対する細胞型特異的およびミトコンドリア標的分子アプローチを提示する。ミトコンドリア標的化遺伝子組み換えCa2+指標(GECIs)GCaMP5GまたはGCaMP6s(GCaMP5G/6s)をコードするDNAプラスミドをアストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターgfaABC1DおよびCaMKIIおよびミトコンドリアターゲティング配列(ミトコンドリア標的配列)で構築した。インビトロミトコンドリアCa2+イメージングでは、PMIDを培養したアストロサイトおよびニューロンにトランスフェクトしてGCaMP5G/6sを発現させた。インビボミトコンドリアCa2+イメージングでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を調製し、マウス脳に注入し、アストロサイトおよびニューロンのミトコンドリアでGCaMP5G/6sを発現させた。我々のアプローチは、細胞質とミトコンドリアCa2+シグナル伝達の関係を研究するために、アストロサイトとニューロンにおけるミトコンドリアCa2+ダイナミクスを画像化する有用な手段を提供する。

本研究の目的は、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるGECを用いたミトコンドリアCa2+シグナルを画像化する方法論を提供することであった。インビトロおよびインビボミトコンドリアCa2+イメージングの結果をここに提示する。
培養されたアストロサイトおよびニューロンにおける...

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Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+ イメージングの方法を提供することを目的としています。

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

この手順のデモンストレーションは、大学院生のZhe Zhang、研究スペシャリストの南南張、イルカー・オズデン教授、シンフア・ディンです。この手順の全体的な目標は、遺伝子組み換えカルシウム指標、GCaMP5Gおよび6sを使用してイメージングのインビトロおよびインビボミトコンドリアカウントのための細胞型特異的な対アストロサイトとニューロンおよびミトコンドリアターゲティング方法を開発することです。インビトロまたはインビボイメージングでは、アストロサイトまたはニューロン特異的プロモーターgfaABC1DまたはCaMKIIおよび遺伝子組み換えカルシウム指標であるGCaMP5G/6sをミトコンドリア標的配列で含むDNAプラスミドを構築します。インビトロミトコンドリアカルシウムイメージングでは、リポフェクタミン法を用いて前述のDNAプラスミドを用いてガラスカバースリップで培養したアストロサイトニューロンをトランスフェクトしました。画像化は、蛍光または2光子顕微鏡下でガラスカバースリップを拡散室に移すことによって、トランスフェクションの1〜2日後に開始することができる。左側にGCaMP6sを発現するミトコンドリアやアストロサイトからの蛍光シグナルの例を、右側にGCaMP5Gを発現するニューロンのミトコンドリアについて紹介します。インビボイメージングでは、細胞内のミト-GCaMP6s発現に対する細胞-GCaMP5Gおよび血清型9の発現に関連するアデノウイルスに関連する血清型5を用意した。立体ウイルス注射手術では、まず3%イオブルランでマウスを麻酔しました。手術の後、イオブルランレベルは、麻酔の適切なレベルに達した後に2%に減少し、頭皮の上の毛髪を剃り、マウスは立体性外科手術器具に配置されます。眼科軟膏は、手術中にそれらを保護するために目に適用されます。注射手術は無菌の器械および無菌の技術を含む無菌のプロシージャを使用して行われる。手術器具は、オートクレーブまたはホットビーズ滅菌装置によって滅菌されます。マウスを立体税に取り付けた後、頭皮をベタジンと70%エタノールで3回洗浄します。その後、皮膚はブレグマラムダ軸に沿って切り開き、垂直はターゲットの位置上の高速ドリルによって行われます。本研究では、運動皮質またはパラコルテックスのいずれかを対象とした。関連するアデノウイルスベクターを運ぶ33ゲージのハミルトン注射器が脳に穴を通して挿入され、標的領域にベクターが注入される。皮質分娩のために、我々は複数のステップで2つの深さでウイルス溶液を注入する。まず、針を1ミリメートル深く皮質に挿入します。脳が回復するまで5分を許した後、針を700マイクロメートルの深さまで動かし、500ナノリットルのウイルス溶液を注入します。注射が完了した後、ウイルスが脳内で拡散できるように5分待ちます。そして、針を深さ300マイクロメートルの2番目の注射位置まで移動します。ここでは、さらに500ナノリットルのウイルス溶液を注入します。注射が完了した後、ウイルスが拡散するのを10分間待ってから、脳から針を取り除き、骨ワックスまたはKwik-Silでバリ穴を閉じます。最後に、皮膚はVetbondで縫合され、マウスは動物施設に送り返される前に加熱パッドで回収される。マウスは、GCaMP発現が成熟する期間である、最低3週間でインビボイメージングに使用する準備が整います。頭蓋窓の注入の外科は注入の外科のために記述されるように無菌条件を使用してまた行われる。頭蓋窓の外科的処置は、頭蓋骨暴露の時点まで注射外科手術と同一である。頭蓋骨が露出すると、ウイルス注入領域上の直径2〜3mmの開頭術の四分の一は、マニピュレータに取り付けられた高速ドリルによって作られた4つの浅い穴でマークされます。その後、頭蓋骨のセクションは、頭蓋骨切開術の峡谷で、これらの4つの穴を結び、円の中で骨を慎重かつゆっくりと掘削することによって薄くなる。国境の頭蓋骨が十分に薄い場合、骨は鋭いピンセットで持ち上げられ、取り除かれます。露出した硬膜は頭蓋窓の注入のために取除くか、またはそのまま保つことができる。頭蓋窓は直径3~5ミリのガラスカバースリップで構成され、中心に約300ミクロンの厚さのシリコーンディスクが作成されています。頭蓋窓の取り付けは、頭蓋骨の上に置くことによって達成される。マニピュレータに取り付けられた爪楊枝の一部は、頭蓋窓を脳の表面にそっと押し込むために使用されます。次いで、頭蓋窓の縁部を少量のシリコーン接着剤Kwik-Silで密封する。最後に、頭蓋の窓は、歯科アクリルで頭蓋骨の縁に固定されています。強い結合のために頭蓋窓の端にわずかに歯科用アクリルを適用するためのケアを与える必要があります。他の多くの研究グループが過去に実施したように、1.2%のアガロースゲルをシリコンディスクの代替としてカバーガラスと脳の間で使用することができます。頭蓋窓がしっかりと取り付けられた後、頭蓋骨に金属板が取り付けられます。このヘッドプレートは、イメージングセッション中に2光子顕微鏡のステージ上でマウスの頭部を固定するために使用されます。アストロサイトにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みはATDの適用によって引き出され、ニューロンのミトコンドリアカルシウム取り込みは、灌流系を介した重力を伴う人工脳脊髄液中のグルタミン酸グリシン用途によって引き出すことができる。その後、アストロサイトおよびニューロンにおける個々のミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みは観察され得る。以下の映画は、左のATPによって引き出されるアストロサイトと、右のグルタミン酸とグリシンによって引き出されるニューロンにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みについて示しています。イメージングは、コヒーレントから100万台のTiサファイアウルトラレーザーを搭載したプレーリーテクノロジーズのウルティマ2光子顕微鏡システムを備えたアストロサイトおよびニューロンのミトコンドリア蛍光シグナルの時間経過2光子画像を収集することによって行われます。880~910ナノメートルの励起波長を使用しており、GCaMP5Gや6sでのインビボイメージングに最適です。有限体細胞およびマイト-GCaMP5Gおよび6sのニューロン特異的発現と、SR101またはニューロン特異的マーカーNeuNのアストロサイト特異的標識の共局在化により再確認した。生体内のアストロサイトおよびニューロンにおける自発的なミトコンドリアカルシウム取り込みは、2光子顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングによって観察することができる。画像は、左のアストロサイトと右側のニューロンの個々のミトコンドリアで自発的なカルシウムの増加を示しています。我々のアプローチは、細胞型特異的ミトコンドリアカルシウムイメージングインビトロおよびインビボに有用である。このビデオを見た後, あなたは、アストロサイトとニューロンでミトコンドリアカルシウムの取り込みを画像化する方法をよく理解している必要があります。.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

イメージング細胞内Ca<sup&gt; 2+</sup遺伝的にエンコードされたカルシウム指標を用いて成体マウスからの線条体アスト​​ロサイト&gt;シグナル

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

腸神経系のその場のCa 2+イメージングに

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...