Name: imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) otorga R01NS069726 y R01NS094539 a SD. Agradecemos a Erica DeMers por la grabación de audio.

Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Missouri-Columbia.
1. Construcción de plásmidos de ADN
NOTA: Para imágenes in vitro e in vivo, se construyen plásmidos de ADN que codifican GCaMP5G/6s con promotores específicos de astrocitos y neuronas y secuencias de orientación mitocondrial.
<ol><li>Insertar la secuencia dir...

<ol>
	<li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells.">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li><li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++homeostasis:+mechanism,+role,+and+tissue+specificities.">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li><li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR/AGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons.">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li><li>Burkeen, J. 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Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2++signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction.">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+Ca2++dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G/6s:+Mitochondrial+Ca2++uptake+and+cytosolic+Ca2++availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store.">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li><li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2++signals+in+cultured+astrocytes.">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li><li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models.">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li><li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia.">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+NAMPT-mediated+NAD++salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury.">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li><li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice.">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li><li>Ding, S., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. , 545-554 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2++signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke.">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2++signaling+in+vivo.">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+astrocytic+Ca2++signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus.">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li><li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling.">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle.">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821 (2021).</li></ol>

En este artículo, proporcionamos un método y protocolo para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca2 + en astrocitos y neuronas. Implementamos estrategias específicas de mitocondrias y tipo de célula para expresar GECI GCaMP5G/6s. Para dirigirnos a GCaMP5G/6s en mitocondrias, incluimos una secuencia dirigida a mitocondrias en los plásmidos. Para expresar GCaMP5G/6s en astrocitos y neuronas in vivo,insertamos un promotor específico de astrocitos gfaABC1D y un promotor específico de ne...

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares dinámicos y se consideran como las centrales eléctricas celulares para la producción de energía. Por otro lado, las mitocondrias pueden absorber Ca2+ a la matriz en respuesta a las elevaciones locales o citosólicas de Ca2+. La absorción mitocondrial de Ca2+ afecta la función mitocondrial, incluidos los procesos metabólicos como las reacciones en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, y regula las proteínas sensibles al Ca2+en condiciones fisiológicas1,2,3,4. La sobrecarga mitocondrial de Ca2+ también es un determinante para la muerte celular, incluyendo necrosis y apoptosis en diversos trastornos cerebrales5,6,7. Provoca la apertura de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTPs) y la liberación del cofactor caspasa, que inician la muerte celular apoptótica. Por lo tanto, es importante estudiar la dinámica y el manejo del Ca2+ mitocondrial en las células vivas para comprender mejor la fisiología y la patología celular.
Las mitocondrias mantienen la homeostasis de Ca2+ de la matriz a través de un equilibrio entre la absorción de Ca2+ y el eflujo. La absorción mitocondrial de Ca2+ está mediada principalmente por uniportadores mitocondriales de Ca2+ (MCU), mientras que el eflujo mitocondrial de Ca2+ está mediado por los intercambiadores Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) y los intercambiadores H+/ Ca2 + (mHCX)8. El equilibrio puede ser perturbado a través de la estimulación de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR)9. La homeostasis mitocondrial de Ca2+ también se ve afectada por la amortiguación mitocondrial por la formación de complejos insolubles xCa2+-xPO4x-xOH8.
Los cambios intracelulares y mitocondriales en la concentración de Ca2+ ([Ca2+]) pueden evaluarse mediante indicadores fluorescentes o luminiscentes de Ca2+. La unión de Ca2+ a los indicadores provoca modificaciones espectrales, lo que permite el registro de células libres [Ca2+]en tiempo real en células vivas. Actualmente hay dos tipos de sondas disponibles para monitorear los cambios de Ca2+ en las células: indicadores químicos orgánicos e indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI). En general, diferentes variantes con diferentes afinidades de Ca2+ (basadas en Kd),propiedades espectrales (longitudes de onda de excitación y emisión), rangos dinámicos y sensibilidades están disponibles para las preguntas biológicas bajo investigación. Aunque se han utilizado muchos indicadores sintéticos orgánicos de Ca2+ para imágenes de Ca2+ citosólico, solo unos pocos pueden cargarse selectivamente en la matriz mitocondrial para imágenes mitocondriales de Ca2+, siendo Rhod-2 el más utilizado (para revisiones ver10,11). Sin embargo, Rhod-2 tiene un gran inconveniente de fuga durante los experimentos de largo plazo; además, se divide entre mitocondrias, otros orgánulos y el citosol, dificultando las mediciones absolutas en diferentes subcompartimentos. Por el contrario, mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y secuencias de orientación de compartimentos subcelulares, los GECI se pueden expresar en diferentes tipos de células y compartimentos subcelulares para imágenes de Ca2+ específicas de células y compartimentos in vitro o in vivo. Los indicadores GCaMP Ca2+ basados en la intensidad de fluorescencia de longitud de onda única han surgido recientemente como los principales GECI12,13,14,15,16. En este artículo, proporcionamos un protocolo para la orientación de las mitocondrias y la expresión específica del tipo celular de GCaMP5G y GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) en astrocitos y neuronas, y la obtención de imágenes de la absorción mitocondrial de Ca2 + en estos tipos de células. Usando este protocolo, se puede revelar la expresión de GCaMP6G/6s en mitocondrias individuales, y se puede lograr la absorción de Ca2+ en resolución mitocondrial única en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears ointment</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td>3M Vetbond Adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 2B</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps with fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>for removal of dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td>for cranial window cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed micro drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>for viral injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9793</td>
			<td>reducing movement artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal frame</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>see Fig 1</td>
			<td>for brain attachment to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3</td>
			<td>Injection speed controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotaxic device</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51725</td>
			<td>for holding mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Persfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA-VM8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-regulating heating pad</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>21061</td>
			<td>to prevent hypothermia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-359</td>
			<td>red fluorescent dye to label astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-23</td>
			<td>for clearing of material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>10 mg/kg body weight</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)

El Ca2+ mitocondrial desempeña un papel fundamental en el control de la amortiguación citosólica del Ca2+, el metabolismo energético y la transducción de señales celulares. La sobrecarga de Ca2+ mitocondrial contribuye a diversas afecciones patológicas, incluida la neurodegeneración y la muerte celular apoptótica en enfermedades neurológicas. Aquí presentamos un enfoque molecular específico de tipo celular y dirigido a mitocondrias para imágenes mitocondriales de Ca2+ en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Construimos plásmidos de ADN que codifican indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dirigidos a mitocondrias con promotores específicos de astrocitos y neuronas gfaABC1D y CaMKII y secuencia dirigida a mitocondrias (mito-). Para las imágenes mitocondriales in vitro de Ca2+, los plásmidos se transfectaron en astrocitos y neuronas cultivados para expresar GCaMP5G/6s. Para las imágenes mitocondriales in vivo de Ca2+, se prepararon vectores virales adenoasociados (AVA) e inyectaron en los cerebros de los ratones para expresar GCaMP5G/6s en mitocondrias en astrocitos y neuronas. Nuestro enfoque proporciona un medio útil para obtener imágenes de la dinámica mitocondrial de Ca2 + en astrocitos y neuronas para estudiar la relación entre la señalización citosólica y mitocondrial de Ca2 +, así como las interacciones astrocito-neurona.

El objetivo de este estudio fue proporcionar una metodología para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca2+ utilizando GECI en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Aquí se presentan los resultados de las imágenes mitocondriales de Ca2+ in vitro e in vivo.
Señalización in vitro mitocondrial de Ca2+ en astrocitos y neuronas cultivadas</st...

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Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Demostrando el procedimiento estarán el estudiante graduado Zhe Zhang, el especialista en investigación Nannan Zhang, los profesores Illker Ozden y Shinghua Ding. El objetivo general de este procedimiento es desarrollar astrocitos de pares específicos de tipo celular y las neuronas y el método de orientación mitocondrial para recuentos mitocondriales in vitro e in vivo de imágenes utilizando el indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP5G y 6s. Para la obtención de imágenes in vitro o in vivo, construiremos plásmidos de ADN que contengan promotores específicos de astrocitos o neuronas gfaABC1D o CaMKII e indicadores de calcio codificados genéticamente, GCaMP5G/6s con secuencias de orientación mitocondrial.Para la obtención de imágenes de calcio mitocondrial in vitro se transfectaron astrocitos de neuronas cultivados en trozos de cubierta de vidrio con los plásmidos de ADN antes mencionados utilizando el método lipofectamine. Las imágenes se pueden iniciar uno o dos días después de la transfección transfiriendo los resbalones de la cubierta de vidrio a la cámara de profusión bajo un microscopio de epifluorescencia o de dos fotones. Aquí hay ejemplos de señales fluorescentes de mitocondrias y un astrocito que expresa GCaMP6s a la izquierda, y para mitocondrias en una neurona, expresando GCaMP5G a la derecha.Para la obtención de imágenes in vivo, preparamos adenovirus asociados al serotipo 5 para la expresión de mito-GCaMP5G en astrocitos y adenovirus asociado al serotipo 9 para la expresión de mito-GCaMP6 en neuronas. Para las cirugías de inyección de virus estereotáxicos, primero anestesiamos al ratón con 3% de isoflurano. Más tarde, durante la cirugía, los niveles de isoflurano se reducen al 2% Después de que se alcanza el nivel adecuado de anestesia, el cabello sobre el cuero cabelludo se afeita y el ratón se coloca en un instrumento quirúrgico estereotax.Se aplica un ungüento oftálmico a los ojos para protegerlos durante la cirugía. Las cirugías de inyección se realizan mediante procedimientos asépticos, incluidos instrumentos estériles y técnicas asépticas. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave o mediante un esterilizador de cuentas calientes.Después de montar el ratón en el estereotax, el cuero cabelludo se limpia con betadina y etanol al 70% tres veces. Luego, la piel se corta a lo largo del eje Bregma Lambda y la vertical se hace mediante un taladro de alta velocidad sobre la ubicación objetivo. En este trabajo, nos dirigimos a la corteza motora o al paracórtex.Una jeringa Hamilton de calibre 33 que transporta un vector de adenovirus asociado se inserta a través del orificio en el cerebro y los vectores se inyectan en el área objetivo. Para la administración cortical, inyectamos la solución de virus a dos profundidades en múltiples pasos. Primero, insertamos la aguja un milímetro de profundidad en la corteza.Después de dejar cinco minutos para que el cerebro se recupere, movemos la aguja hasta 700 micrómetros de profundidad, inyectamos 500 nano litros de solución de virus. Después de completar la inyección, esperamos cinco minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro. Y luego movemos la aguja hasta la segunda ubicación de inyección a 300 micrómetros de profundidad.Aquí, inyectamos otros 500 nano litros de solución de virus. Después de completar la inyección, esperamos 10 minutos para permitir que el virus se difunda y luego retiramos la aguja del cerebro y cerramos el orificio de rebaba con cera ósea o Kwik-Sil. Finalmente, la piel se sutura con Vetbond y el ratón se recupera en una almohadilla térmica antes de ser enviado de vuelta a la instalación de animales.El ratón estará listo para su uso para imágenes in vivo en un mínimo de tres semanas, que es el período de tiempo en el que madura la expresión de GCaMP. Las cirugías de implantación de ventanas craneales también se realizan mediante el uso de condiciones asépticas como se describe para las cirugías de inyección. Los procedimientos quirúrgicos de la ventana craneal son idénticos a los procedimientos quirúrgicos de inyección hasta el punto de exposición del cráneo.Una vez que el cráneo está expuesto, los cuartos de una craneotomía de 2-3 mm de diámetro sobre el área inyectada por el virus están marcados con cuatro agujeros poco profundos hechos por un taladro de alta velocidad conectado a un manipulador. Luego, la sección del cráneo, en las gargantas de la craneotomía, se adelgaza perforando cuidadosa y lentamente el hueso en un círculo, conectando estos cuatro agujeros. Una vez que el cráneo en los bordes es lo suficientemente delgado, entonces el hueso se levanta con pinzas afiladas y se retira.La duramadre expuesta se puede quitar o mantener intacta para la implantación de la ventana craneal. Nuestra ventana craneal consiste en una cubierta de vidrio deslizante de 3-5 milímetros de diámetro, creando un disco de silicona de aproximadamente 300 micras de espesor en el centro. El montaje de la ventana craneal se logra colocándola sobre la craneotomía.Un trozo de palillo de dientes unido a un manipulador se utiliza para empujar la ventana craneal suavemente sobre la superficie del cerebro. Luego, el borde de la ventana craneal se sella con una pequeña cantidad de adhesivo de silicona Kwik-Sil. Finalmente, la ventana craneal se fija en los bordes del cráneo con acrílico dental.Se debe tener cuidado al aplicar el acrílico dental ligeramente sobre los bordes de la ventana craneal para una unión fuerte. Como muchos otros grupos de investigación han implementado en el pasado, se puede usar un gel de agarosa al 1.2% entre el vidrio de la cubierta y el cerebro como una alternativa al disco de silicona. Después de que la ventana craneal se instala de forma segura, se adhiere una placa de metal al cráneo.Esta placa de cabeza se utilizará para fijar la cabeza del ratón en el escenario de un microscopio de dos fotones durante las sesiones de imágenes. La absorción de calcio mitocondrial en los astrocitos puede ser provocada por la aplicación de ATD, mientras que la absorción de calcio mitocondrial en las neuronas puede ser provocada por la aplicación de glicina de glutamato en el líquido cefalorraquídeo artificial, con gravedad a través de un sistema de perfusión. La absorción de calcio en las mitocondrias individuales en los astrocitos y las neuronas se puede observar.Las siguientes películas muestran la absorción de calcio mitocondrial en un astrocito provocado por ATP a la izquierda y en una neurona provocada por el glutamato y la glicina a la derecha. La obtención de imágenes se realiza mediante la recopilación de imágenes de dos fotones in vivo con lapso de tiempo de señales fluorescentes mitocondriales en astrocitos y neuronas con un sistema de microscopía de dos fotones Ultima de Prairie Technologies, que está equipado con un millón de lásers Ti Sapphire Ultra one de Coherent. Utilizamos las longitudes de onda de excitación de 880 a 910 nanómetros, que son óptimas para imágenes in vivo con GCaMP5G y 6s.Astrocitos y expresión específica de neuronas de mito-GCaMP5G y 6s y reconfirmada por co-localización del marcado específico de astrocitos de SR101 o marcador específico de neurona NeuN. La absorción espontánea de calcio mitocondrial en astrocitos y neuronas in vivo se puede observar mediante imágenes de lapso de tiempo utilizando microscopía de dos fotones. Las imágenes muestran aumentos espontáneos de calcio en las mitocondrias individuales en un astrocito a la izquierda y una neurona a la derecha.Nuestros enfoques son útiles para imágenes de calcio mitocondrial específicas del tipo celular in vitro e in vivo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de la absorción de calcio mitocondrial en los astrocitos y en las neuronas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Investigación

Neurociencias

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Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

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