Name: imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) bidrag R01NS069726 och R01NS094539 till SD. Vi tackar Erica DeMers för ljudinspelningen.

Djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Missouri-Columbia.
1. Konstruktion av DNA-plasmider
OBS: För in vitro- och in vivo-avbildning konstrueras DNA-plasmider som kodar GCaMP5G/6s med astrocyt- och neuronspecifika promotorer och mitokondriella målsekvenser.
<ol><li>Sätt in mitokondriell matris (MM)-målsekvens (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC ...

<ol>
	<li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells.">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li><li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++homeostasis:+mechanism,+role,+and+tissue+specificities.">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li><li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR/AGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons.">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li><li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signaling+mediates+rhythmic+extracellular+ATP+accumulation+in+suprachiasmatic+nucleus+astrocytes.">Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).</li><li>Duchen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease.">Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).</li><li>Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+handling+during+ischemia-induced+cell+death+in+neurons.">Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons.</a> Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).</li><li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uniporter+Mcu+controls+excitotoxicity+and+is+transcriptionally+repressed+by+neuroprotective+nuclear+calcium+signals.">Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals.</a> Nature Communications. 4, 2034 (2013).</li><li>Filadi, R., Greotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+mitochondrial+Ca2++signaling+in+cell+physiology+and+pathology.">The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology.</a> Cell Calcium. 93, 102321 (2021).</li><li>Finkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+mitochondrial+calcium.">The ins and outs of mitochondrial calcium.</a> Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+The+calcium+connection.">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2++indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells.">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells.">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li><li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2++signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction.">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+Ca2++dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G/6s:+Mitochondrial+Ca2++uptake+and+cytosolic+Ca2++availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store.">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li><li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2++signals+in+cultured+astrocytes.">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li><li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models.">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li><li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia.">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+NAMPT-mediated+NAD++salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury.">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li><li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice.">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li><li>Ding, S., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. , 545-554 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2++signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke.">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2++signaling+in+vivo.">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+astrocytic+Ca2++signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus.">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li><li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling.">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle.">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821 (2021).</li></ol>

I den här artikeln tillhandahåller vi en metod och protokoll för avbildning mitokondriell Ca2 + signaler i astrocyter och nervceller. Vi implementerade mitokondrier-inriktning och celltypspecifika strategier för att uttrycka GECI GCaMP5G/6s. För att rikta in sig på GCaMP5G/6s i mitokondrier inkluderade vi en mitokondrier-målsekvens i plasmiderna. För att uttrycka GCaMP5G/6s i astrocyter och nervceller in vivo, satte vi in en astrocytspecifik promotor gfaABC1D och neuron-specifika promotorn CaM...

Mitokondrier är dynamiska subcellulära organeller och anses vara cellkraftverk för energiproduktion. Å andra sidan kan mitokondrier ta upp Ca2+ till matrisen som svar på lokala eller cytosoliska Ca2 + ökningar. Mitokondriell Ca2+ upptag påverkar mitokondriell funktion, inklusive metaboliska processer såsom reaktioner i trikarboxylsyra (TCA) cykeln och oxidativ fosforylering, och reglerar Ca2+känsliga proteiner under fysiologiska förhållanden1,2,3,4. Mitokondriell Ca2 + överbelastning är också en avgörande faktor för celldöd, inklusive nekros och apoptos i olika hjärnsjukdomar5,6,7. Det orsakar öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergång pores (mPTPs) och frisättningen av caspase cofactor, som initierar apoptotic cell död. Därför är det viktigt att studera mitokondriell Ca2 + dynamik och hantering i levande celler för att bättre förstå cellulär fysiologi och patologi.
Mitokondrier upprätthåller matris ca2+ homeostas genom en balans mellan Ca2+ upptag och efflux. Mitokondriell Ca2+ upptaget förmedlas huvudsakligen av mitokondriella Ca2+ uniporters (MCUs), medan mitokondriell Ca2 + efflux förmedlas av Na+-Ca2 +-Li+ växlare (NCLXs) och H+/ Ca2 + växlare (mHCXs)8. Balansen kan störas genom stimulering av G-proteinkopplade receptorer (GPCRs)9. Mitokondriell Ca2 + homeostas påverkas också av mitokondriell buffring genom bildandet av olösliga xCa2+-xPO4x-xOH-komplex8.
Intracellulära och mitokondriella förändringar i Ca2+ koncentration ([Ca2+]) kan utvärderas med fluorescerande eller självlysande Ca2+ indikatorer. Ca2+ bindning till indikatorer orsakar spektraländringar, vilket gör det möjligt att registrera gratis cellulära [Ca2 +] i realtid i levande celler. Två typer av sonder finns för närvarande tillgängliga för att övervaka Ca2+ förändringar i celler: organiska kemiska indikatorer och genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs). I allmänhet finns olika varianter med olika Ca2 + affiniteter (baserat på Kd), spektralegenskaper (excitation och emissionsvåglängder), dynamiska intervall och känsligheter tillgängliga för de biologiska frågor som undersöks. Även om många syntetiska organiska Ca2 + indikatorer har använts för cytosolisk Ca2 + imaging, kan endast ett fåtal selektivt laddas i mitokondriell matris för mitokondriell Ca2 + imaging, med Rhod-2 är den mest använda (för recensioner se10,11). Rhod-2 har dock en stor nackdel med läckage under långa tidsvägsexperiment; Dessutom är det delat mellan mitokondrier, andra organeller och cytosol, vilket gör absoluta mätningar i olika underparter svåra. Genom att använda celltypsspecifika promotorer och subcellulära fackinriktningssekvenser kan GECIs uttryckas i olika celltyper och subcellulära fack för cell- och fackspecifika Ca2+ imaging in vitro eller in vivo. Envågiga fluorescensintensitetsbaserade GCaMP Ca2+-indikatorer har nyligen dykt upp som stora GECIs12,13,14,15,16. I den här artikeln tillhandahåller vi ett protokoll för mitokondrier-inriktning och celltyp specifika uttryck för GCaMP5G och GCaMP6s (GCaMP5G/6s) i astrocyter och nervceller, och imaging mitokondriell Ca2 + upptag i dessa celltyper. Med hjälp av detta protokoll kan uttrycket av GCaMP6G/6s i enskilda mitokondrier avslöjas, och Ca2 + upptag i en enda mitokondriell upplösning kan uppnås i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears ointment</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td>3M Vetbond Adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 2B</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps with fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>for removal of dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td>for cranial window cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed micro drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>for viral injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9793</td>
			<td>reducing movement artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal frame</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>see Fig 1</td>
			<td>for brain attachment to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3</td>
			<td>Injection speed controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotaxic device</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51725</td>
			<td>for holding mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Persfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA-VM8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-regulating heating pad</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>21061</td>
			<td>to prevent hypothermia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-359</td>
			<td>red fluorescent dye to label astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-23</td>
			<td>for clearing of material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>10 mg/kg body weight</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)

Mitokondriell Ca2+ spelar en avgörande roll för att kontrollera cytosolisk Ca2 + buffring, energimetabolism och cellulär signaltransduktion. Överbelastning av mitokondriell Ca2+ bidrar till olika patologiska tillstånd, inklusive neurodegeneration och apoptotisk celldöd vid neurologiska sjukdomar. Här presenterar vi en celltypspecifik och mitokondrier inriktad på molekylär metod för mitokondriell Ca2 + avbildning i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo. Vi konstruerade DNA-plasmider som kodar mitokondrier-inriktning genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) GCaMP5G eller GCaMP6s (GCaMP5G/6s) med astrocyt- och neuronspecifika promotorer gfaABC1D och CaMKII och mitokondrier-målsekvens (mito-). För in vitro mitokondriell Ca2 + imaging, var plasmiderna transfected i odlade astrocyter och nervceller att uttrycka GCaMP5G/6s. För in vivo mitokondriell Ca2 + imaging, adeno-associerade viral vektorer (AAV) förbereddes och injiceras i mushjärnorna att uttrycka GCaMP5G/6s i mitokondrier i astrocyter och nervceller. Vårt tillvägagångssätt ger ett användbart sätt att avbilda mitokondriell Ca2 + dynamik i astrocyter och nervceller för att studera förhållandet mellan cytosolic och mitokondriell Ca2 + signalering, liksom astrocyt-neuron interaktioner.

Syftet med denna studie var att tillhandahålla en metodik för att avbilda mitokondriella Ca2 + signaler med GECIs i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo. Resultaten av både in vitro och in vivo mitokondriell Ca2 + imaging presenteras här.
In vitro mitokondriell Ca2+ signalering i odlade astrocyter och nervceller Mitokondriell Ca<su...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs at JoVE.com

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Denna proctocol syftar till att tillhandahålla en metod för in vitro och in vivo mitokondriell Ca2 + imaging i astrocyter och nervceller.

Imaging mitokondriell Ca2+ upptag i astrocyter och nervceller med genetiskt kodade Ca2+ indikatorer (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Som demonstrerar kommer doktoranden Zhe Zhang, forskningsspecialisten Nannan Zhang, professorerna Illker Ozden och Shinghua Ding att demonstrera. Det övergripande målet med denna procedur är att utveckla celltyp specifika par astrocyter och nervceller och mitokondriell inriktningsmetod för in vitro och in vivo mitokondriellt antal avbildning med hjälp av genetiskt kodad kalciumindikator, GCaMP5G och 6s. För in vitro eller in vivo-avbildning kommer vi att konstruera DNA-plasmider som innehåller astrocyt eller neuronspecifika promotorer gfaABC1D eller CaMKII och genetiskt kodade kalciumindikatorer, GCaMP5G/6s med mitokondriella målsekvenser.För in vitro mitokondriell kalcium imaging vi transfected astrocyter nervceller odlade på glas omslag glider med ovannämnda DNA plasmider med lipofectamine metoden. Avbildning kan påbörjas en till två dagar efter transfektion genom att överföra glashöljets slipsar till profusionskammaren under ett epifluorescens- eller tvåfotomikroskop. Här är exempel på fluorescerande signaler från mitokondrier och en astrocyt som uttrycker GCaMP6s till vänster, och för mitokondrier i en neuron, som uttrycker GCaMP5G till höger.För in vivo imaging, vi beredd serotyp 5 associerade adenovirus för uttryck av mito-GCaMP5G i astrocyter och serotyp 9 associerade adenovirus för uttryck av mito-GCaMP6s i nervceller. För stereotaxic virus injektion operationer, vi först bedöva musen med 3%isofluran. Senare under operationen reduceras isoflurannivåerna till 2%Efter att rätt anestesinivå har uppnåtts rakas håret över hårbotten och musen placeras på ett stereotaxkirurgiskt instrument.En oftalmisk salva appliceras på ögonen för att skydda dem under operationen. Injektionsoperationerna utförs med aseptiska ingrepp, inklusive sterila instrument och aseptiska tekniker. De kirurgiska instrumenten steriliseras antingen genom autoklavering eller av en varmpärlasteriliserare.När musen är monterad på stereoskatten rengörs hårbotten med betadin och 70% etanol tre gånger. Sedan skärs huden upp längs Bregma Lambda-axeln och vertikalen görs av en höghastighetsborr över målplatsen. I detta arbete riktade vi antingen motorbarken eller paracortex.En 33 gauge Hamilton spruta som bär en tillhörande adenovirus vektor sätts in genom hålet i hjärnan och vektorer injiceras på målområdet. För när leverans injicerar vi viruslösningen på två djup i flera steg. Först sätter vi in nålen en millimeter djupt in i cortex.Efter att ha tillåtit fem minuter för hjärnan att återhämta sig flyttar vi nålen upp till 700 mikrometer djup, injicerar 500 nano liter viruslösning. När injektionen är klar väntar vi i fem minuter för att låta viruset spridas i hjärnan. Och sedan flyttar vi nålen upp till den andra injektionsplatsen på 300 mikrometer djup.Här injicerar vi ytterligare 500 nano liter viruslösning. När injektionen är klar väntar vi i 10 minuter för att låta viruset sprida sig och sedan tar vi bort nålen från hjärnan och stänger borrhålet med benvax eller Kwik-Sil. Slutligen sutureras huden med Vetbond och musen återvinns på en värmeplatta innan den skickas tillbaka till djuranläggningen.Musen kommer att vara klar för in vivo-avbildning om minst tre veckor, vilket är den tidsram inom vilken GCaMP-uttrycket mognar. Hjärnskålen fönster implantation operationer görs också genom att använda aseptiska villkor som beskrivs för injektion operationer. Hjärnskålen fönster kirurgiska ingrepp är identiska med injektion kirurgiska ingrepp fram till punkt av skalle exponering.När skallen har exponerats markeras kvarts fjärdedelar av en 2-3 mm diameter kraniotomi över det virusinsprutade området med fyra grunda hål gjorda av en höghastighetsborr fäst vid en manipulator. Sedan tunnas delen av skallen, vid kraniotomins raviner, genom att försiktigt och långsamt borra benet runt i en cirkel och ansluta dessa fyra hål. När skallen vid gränserna är tunn nog, lyfts benet med skarpa pincett och avlägsnas.Den exponerade duramatern kan tas bort eller hållas intakt för implantation av hjärnskålen. Vårt kranialfönster består av en glasöverdragsglidning på 3-5 millimeter i diameter, vilket skapar en silikonskiva ca 300 mikron tjock i mitten. Monteringen av kranialfönstret åstadkoms genom att placera den över kraniotomin.En bit tandpetare fäst vid en manipulator används för att försiktigt trycka kranialfönstret på hjärnans yta. Därefter förseglas kranialfönstrets kant med en liten mängd silikonlim Kwik-Sil. Slutligen är kranialfönstret fixerat i skallkanterna med dental akryl.Försiktighet bör ges för applicering av tand akryl något över kanterna på kranialfönstret för stark bindning. Som många andra forskargrupper har implementerat tidigare kan en 1,2% agarosegel användas mellan täckglaset och hjärnan som ett alternativ till silikonskivan. När kranialfönstret är säkert installerat fästs en metallplatta på skallen.Denna huvudplatta kommer att användas för att fixera musens huvud på scenen i ett tvåfotonmikroskop under avbildningssessioner. Mitokondriellt kalciumupptag i astrocyter kan framkallas genom ATD-tillämpning medan mitokondriellt kalciumupptag i nervceller kan framkallas av glutamat glycinapplikation i konstgjord cerebral spinalvätska, med gravitation genom ett perfusionssystem. Kalciumupptag i enskilda mitokondrier i astrocyter och nervceller kan sedan observeras.Följande filmer visar mitokondriell kalciumupptag i en astrocyt som framkallas av ATP till vänster och i en neuron som framkallas av glutamat och glycin till höger. Avbildningen görs genom att samla in vivo tvåfoton bilder av mitokondriella fluorescerande signaler i astrocyter och nervceller med ett Ultima två-foton mikroskopisystem från Prairie Technologies, som är utrustad med en miljon Ti Sapphire Ultra en laser från Coherent. Vi använder excitationsvåglängderna på 880 till 910 nanometer, som är optimala för in vivo-avbildning med GCaMP5G och 6s.Astrocyter och neuron-specifika uttryck av mito-GCaMP5G och 6s och bekräftas genom samlokalisering av astrocyt-specifika märkning av SR101 eller neuron specifika markör NeuN. Spontan mitokondriellt kalciumupptag i astrocyter och nervceller in vivo kan observeras genom tidsfördröjning imaging med hjälp av två-foton mikroskopi. Bilder visar spontana kalcium ökningar i enskilda mitokondrier i en astrocyt till vänster och en neuron till höger.Våra metoder är användbara för celltyp specifika mitokondriell kalcium imaging in vitro och in vivo. Efter att ha tittat på den här videon bör du ha en god förståelse för hur man avbildar mitokondriellt kalciumupptag i astrocyter och i nervceller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging Neuronal svar i Slice Beredningar av vomeronasala Orgel uttrycker en genetiskt kodade Kalcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Striatal Astrocyter från vuxna möss använda genetiskt kodade kalcium indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2 + avbildning av det enteriska nervsystemet

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nervceller

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Imaging membranpotential med två typer av genetiskt kodade fluorescerande Spänningssensorer

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...