Name: imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) tarafından desteklenmiştir R01NS069726 ve R01NS094539 SD'ye hibe eder. Erica DeMers'a ses kaydı için teşekkür ederiz.

Hayvanları içeren prosedürler Missouri-Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. DNA plazmidlerinin yapımı
NOT: İn vitro ve in vivo görüntüleme için, Astrosit ve nörona özgü promotörler ve mitokondriyal hedefleme dizileri ile GCaMP5G/6'ları kodlayan DNA plazmidleri oluşturulur.
<ol><li>Mitokondriyal matris (MM)- hedefleme sırası (mito-) ATGT CCGT...

<ol>
	<li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells.">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li><li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++homeostasis:+mechanism,+role,+and+tissue+specificities.">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li><li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR/AGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons.">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li><li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signaling+mediates+rhythmic+extracellular+ATP+accumulation+in+suprachiasmatic+nucleus+astrocytes.">Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).</li><li>Duchen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease.">Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).</li><li>Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+handling+during+ischemia-induced+cell+death+in+neurons.">Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons.</a> Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).</li><li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uniporter+Mcu+controls+excitotoxicity+and+is+transcriptionally+repressed+by+neuroprotective+nuclear+calcium+signals.">Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals.</a> Nature Communications. 4, 2034 (2013).</li><li>Filadi, R., Greotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+mitochondrial+Ca2++signaling+in+cell+physiology+and+pathology.">The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology.</a> Cell Calcium. 93, 102321 (2021).</li><li>Finkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+mitochondrial+calcium.">The ins and outs of mitochondrial calcium.</a> Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+The+calcium+connection.">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2++indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells.">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells.">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li><li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2++signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction.">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+Ca2++dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G/6s:+Mitochondrial+Ca2++uptake+and+cytosolic+Ca2++availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store.">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li><li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2++signals+in+cultured+astrocytes.">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li><li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models.">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li><li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia.">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+NAMPT-mediated+NAD++salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury.">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li><li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice.">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li><li>Ding, S., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. , 545-554 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2++signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke.">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2++signaling+in+vivo.">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+astrocytic+Ca2++signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus.">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li><li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling.">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle.">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821 (2021).</li></ol>

Bu yazıda astrosit ve nöronlarda mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin görüntülenmesi için bir yöntem ve protokol sunuyoruz. GECI GCaMP5G/6'ları ifade etmek için mitokondri hedefleme ve hücre tipine özgü stratejiler uyguladık. Mitokondrilerde GCaMP5G/6'ları hedeflemek için plazmidlere mitokondri hedefleme dizisi dahil ettik. GCaMP5G/6'ları astrositlerde ve nöronlarda ifadeetmek için in vivo , plazmidlere astrositlere özgü bir promotör gfaABC1D ve nörona özgü promotör CaMKII yerleş...

Mitokondriler dinamik hücre altı organellerdir ve enerji üretimi için hücre güç merkezleri olarak kabul edilir. Öte yandan, mitokondriler lokal veya sitozolitik Ca2+ yükselmelerine yanıt olarak Ca2+'yı matrise alabilir. Mitokondriyal Ca2+ alımı, trikarboksilik asit (TCA) döngüsündeki reaksiyonlar ve oksidatif fosforilasyon gibi metabolik süreçler de dahil olmak üzere mitokondriyal fonksiyonu etkiler ve fizyolojik koşullar altında Ca2+duyarlı proteinleri düzenler 1,2,3,4. Mitokondriyal Ca2+ aşırı yükleme, çeşitli beyin bozukluklarında nekroz ve apoptoz da dahil olmak üzere hücre ölümü için de belirleyicidir5,6,7. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin (mPTP' ler) açılmasına ve apoptotik hücre ölümünü başlatan caspase kofaktörün salınmamasına neden olur. Bu nedenle hücresel fizyolojiyi ve patolojiyi daha iyi anlamak için canlı hücrelerde mitokondriyal Ca2+ dinamiklerinin ve elleçlemenin incelenmesi önemlidir.
Mitokondri, Ca2+ alımı ve efflux arasındaki denge ile matris Ca2+ homeostazını korur. Mitokondriyal Ca2+ alımı esas olarak mitokondriyal Ca2+ uniporterler (MCU' lar) tarafından aracılık edilirken, mitokondriyal Ca2+ efflux Na+-Ca2+-Li+ eşanjörleri (NCLXs) ve H+/ Ca2+ eşanjörleri (mHCXs)8ile aracılık eder. Denge, G-protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) uyarılması yoluyla bozunabilir9. Mitokondriyal Ca2+ homeostaz da çözünmeyen xCa2+-xPO4x-xOH komplekslerinin oluşumu ile mitokondriyal tamponlamadan etkilenir8.
Ca2+ konsantrasyonundaki hücre içi ve mitokondriyal değişiklikler ([Ca2+]) floresan veya lüminesan Ca2+ göstergeleri ile değerlendirilebilir. Göstergelere ca2+ bağlama spektral değişikliklere neden olur ve canlı hücrelerde gerçek zamanlı olarak ücretsiz hücresel [Ca2+] kaydedilmeye izin verir. Hücrelerdeki Ca2+ değişikliklerini izlemek için şu anda iki tür prob mevcuttur: organik kimyasal göstergeler ve genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergeleri (GECI'ler). Genellikle, incelenmektedir biyolojik sorular için farklı Ca2+ benzeşimlerine (Kd'yedayalı), spektral özelliklere (uyarlama ve emisyon dalga boyları), dinamik aralıklara ve hassasiyetlere sahip farklı varyantlar mevcuttur. Sitosolic Ca2+ görüntüleme için birçok sentetik organik Ca2+ göstergesi kullanılmış olsa da, sadece birkaçı mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için mitokondriyal matrise seçici olarak yüklenebilir ve Rhod-2 en yaygın kullanılandır (incelemeler için bkz.10,11). Bununla birlikte, Rhod-2 uzun süreli denemeler sırasında sızıntının büyük bir dezavantajı vardır; ek olarak, mitokondriler, diğer organeller ve sitozol arasında bölünür ve farklı alt bölümlerde mutlak ölçümleri zorlaştırır. Buna karşılık, hücre tipine özgü promotörler ve hücre altı bölme hedefleme dizileri kullanılarak, GECI'ler hücre ve bölmeye özgü Ca2+ görüntüleme in vitro veya in vivo için farklı hücre tiplerinde ve hücre altı bölmelerdeifade edilebilir. Tek dalga boyu floresan yoğunluğuna dayalı GCaMP Ca2+ göstergeleri son zamanlarda majörGECI'ler 12 , 13,14,15,16olarak ortayaçıkmıştır. Bu makalede, astrositlerde ve nöronlarda GCaMP5G ve GCaMP6s'ın (GCaMP5G/6s) mitokondri hedeflemesi ve hücre tipi spesifik ekspresyonu ve bu hücre tiplerinde mitokondriyal Ca2+ alımını görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol kullanılarak, bireysel mitokondrilerde GCaMP6G / 6s ifadesi ortaya çıkarılabilir ve tek mitokondriyal çözünürlükte Ca2 + alımı astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears ointment</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC-0536-6550-91</td>
			<td>83% white petrolatum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td>3M Vetbond Adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 2B</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps with fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>for removal of dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td>for cranial window cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed micro drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>with bone polishing drill bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>for viral injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-996-06</td>
			<td>100 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9793</td>
			<td>reducing movement artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal frame</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>see Fig 1</td>
			<td>for brain attachment to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3</td>
			<td>Injection speed controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotaxic device</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51725</td>
			<td>for holding mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Persfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA-VM8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-regulating heating pad</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>21061</td>
			<td>to prevent hypothermia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-359</td>
			<td>red fluorescent dye to label astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-23</td>
			<td>for clearing of material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC-50989-234-11</td>
			<td>10 mg/kg body weight</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mitochondrial ca2+ uptake in astrocytes and neurons using genetically encoded ca2+ indicators (gecis)

Mitokondriyal Ca2+, sitozolitik Ca2+ arabelleğe alma, enerji metabolizması ve hücresel sinyal transdüksiyonunu kontrol etmede kritik bir rol oynar. Mitokondriyal Ca2+'nın aşırı yüklenmesi, nörolojik hastalıklarda nörodejenerasyon ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlara katkıda bulunur. Burada astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için moleküler yaklaşımı hedefleyen hücre tipi spesifik ve mitokondriler in vitro ve in vivo sunuyoruz. Genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergelerini (GECI'ler) GCaMP5G veya GCaMP6'ları (GCaMP5G/6s) astrosit ve nörona özgü promotörler gfaABC1D ve CaMKII ve mitokondri hedefleme dizisi (mito-) ile kodlayan DNA plazmidleri inşa ettik. İn vitro mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için plazmidler GCaMP5G/6'ları ifade etmek için kültürlü astrositlerde ve nöronlarda transkripsiyon edildi. In vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için adeno ilişkili viral vektörler (AAV' ler) hazırlandı ve astrositlerde ve nöronlarda mitokondrilerde GCaMP5G/6'ları ifade etmek için fare beyinlerine enjekte edildi. Yaklaşımımız, astrosit ve nöronlardaki mitokondriyal Ca2+ dinamiklerini, sitosolik ve mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin yanı sıra astrosit-nöron etkileşimleri arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Bu çalışmanın amacı astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivoolarak GECI'ler kullanarak mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin görüntülenerek bir metodoloji sağlamaktı. Hem in vitro hem de in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme sonuçları burada sunulmuştur.
Kültürlü astrositlerde ve nöronlarda in vitro mitokondriyal Ca2+ sinyali...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs at JoVE.com

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Prosedürü gösteren yüksek lisans öğrencisi Zhe Zhang, araştırma uzmanı Nannan Zhang, profesörler Illker Özden ve Shinghua Ding olacak. Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, GCaMP5G ve 6s kullanarak in vitro ve in vivo mitokondriyal görüntüleme sayıları için hücre tipi spesifik çift astrositler ve nöronlar ve mitokondriyal hedefleme yöntemini geliştirmektir. İn vitro veya in vivo görüntüleme için, astrosit veya nöronlara özgü organizatörler gfaABC1D veya CaMKII içeren DNA plazmidleri ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, mitokondriyal hedefleme dizilimleri olan GCaMP5G/6'lar inşa edeceğiz.İn vitro mitokondriyal kalsiyum görüntüleme için, lipofectamin yöntemini kullanarak yukarıda belirtilen DNA plazmidleri ile cam kapak kaymaları üzerinde kültürlenmiş astrosit nöronlarını transkâr ettik. Cam kapak kaymalarının epifluoresans veya iki foton mikroskobu altında bolluk odasına aktarılmasıyla transeksiyondan bir ila iki gün sonra görüntülemeye başlanabilir. İşte mitokondriden floresan sinyal örnekleri ve solda GCaMP6s'ı ifade eden bir astrosit ve sağdaki GCaMP5G'yi ifade eden bir nörondaki mitokondri için.In vivo görüntüleme için, astrositlerde mito-GCaMP5G ekspresyonu için serotip 5 ilişkili adenovirüs ve nöronlarda mito-GCaMP6s ekspresyonu için serotip 9 ilişkili adenovirüs hazırladık. Stereotaksik virüs enjeksiyon ameliyatları için önce fareyi %3 izofluran ile uyuşturduk. Ameliyat sırasında daha sonra izofluran seviyeleri %2'ye düşürülür Uygun anestezi seviyesine ulaşıldıktan sonra saç derisinin üzerindeki saçlar tıraş edilir ve fare stereotaks cerrahi bir alet üzerine yerlenir.Ameliyat sırasında onları korumak için gözlere oftalmik bir merhem uygulanır. Enjeksiyon ameliyatları steril aletler ve aseptik teknikler de dahil olmak üzere aseptik prosedürler kullanılarak gerçekleştirilir. Cerrahi aletler ya otoklavlama ya da sıcak boncuk sterilizatörü ile sterilize edilir.Fare stereotaks üzerine monte edildikten sonra, kafa derisi betadin ve% 70 etanol ile üç kez temizlenir. Daha sonra cilt Bregma Lambda ekseni boyunca kesilir ve dikey hedef konum üzerinde yüksek hızlı bir matkapla yapılır. Bu çalışmada ya motor korteksi ya da parakorteksi hedef aldık.İlişkili bir adenovirüs vektörü taşıyan 33 kalibrelik hamilton şırınnası delikten beyne yerleştirilir ve hedef bölgeye vektörler enjekte edilir. Kortikal teslimat için virüs çözeltisini birden fazla adımda iki derinlikte enjekte ediyoruz. İlk olarak, iğneyi korteksin bir milimetre derinine yerleştiriyoruz.Beynin iyileşmesi için beş dakika izin ettikten sonra, iğneyi 700 mikrometre derine kadar hareket ettiriyoruz, 500 nano litre virüs çözeltisi enjekte ediyoruz. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüsün beyinde yayılması için beş dakika bekleriz. Sonra iğneyi 300 mikrometre derinlikteki ikinci enjeksiyon yerine taşıyacağız.Burada, 500 nano litre daha virüs çözeltisi enjekte ediyoruz. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüsün yayılmasına izin vermek için 10 dakika bekleriz ve ardından iğneyi beyinden çıkarır ve çapak deliğini kemik balmumu veya Kwik-Sil ile kapatırız. Son olarak, cilt Vetbond ile dikilir ve fare hayvan tesisine geri gönderilmeden önce bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarılmıştır.Fare, GCaMP ifadesinin olgunlaştığı zaman dilimi olan en az üç hafta içinde in vivo görüntüleme için kullanıma hazır olacaktır. Kranial pencere implantasyon ameliyatları da enjeksiyon ameliyatları için açıklandığı gibi aseptik durumlar kullanılarak yapılır. Kranial pencere cerrahi prosedürleri kafatasına maruz kalma noktasına kadar enjeksiyon cerrahi prosedürleri ile aynıdır.Kafatası açığa çıktıktan sonra, virüs enjekte edilen bölge üzerindeki 2-3 mm çapındaki kraniyotomi çeyrekleri, bir manipülatöre bağlı yüksek hızlı bir matkap tarafından yapılan dört sığ delik ile işaretlenir. Daha sonra kafatasının kraniyotomi geçitlerindeki bölümü, bu dört deliği birbirine bağlayarak kemiği bir daire içinde dikkatlice ve yavaşça delerek inceltilir. Sınırlardaki kafatası yeterince ince olduğunda, kemik keskin cımbızla kaldırılır ve çıkarılır.Maruz kalan dura mater, kraniyal pencerenin implantasyonu için çıkarılabilir veya bozulmadan tutulabilir. Kranial penceremiz, merkezde yaklaşık 300 mikron kalınlığında bir silikon disk oluşturan 3-5 milimetre çapında bir cam kapak kaymasından oluşur. Kranial pencerenin montajı kraniyotomi üzerine yerleştirilerek gerçekleştirilir.Bir manipülatöre bağlı bir kürdan parçası, kraniyal pencereyi beynin yüzeyine hafifçe itmek için kullanılır. Daha sonra, kranial pencerenin kenarı az miktarda silikon yapıştırıcı Kwik-Sil ile kapatılır. Son olarak, kranial pencere diş akrilik ile kafatası kenarlarına sabitlenir.Güçlü yapıştırma için diş akrilikinin kranial pencerenin kenarlarına hafifçe uygulanmasına özen gösterilmelidir. Geçmişte diğer birçok araştırma grubunun uyguladığı gibi, silikon diske alternatif olarak kapak camı ve beyin arasında% 1.2 agarose jel kullanılabilir. Kranial pencere güvenli bir şekilde monte edildikten sonra, kafatasına metal bir plaka tutturulur.Bu kafa plakası, görüntüleme seansları sırasında farenin başını iki foton mikroskop sahnesinde sabitlemek için kullanılacaktır. Astrositlerde mitokondriyal kalsiyum alımı ATD uygulaması ile ortaya çıkabilirken, nöronlarda mitokondriyal kalsiyum alımı yapay serebral spinal sıvıda glutamat glisin uygulaması ile, bir perfüzyon sistemi ile yerçekimi ile ortaya çıkabilir. Astrositlerde ve nöronlarda bireysel mitokondrilerde kalsiyum alımı daha sonra gözlenebilir.Aşağıdaki filmler, solda ATP tarafından ortaya çıkan bir astrositte ve sağdaki glutamat ve glisin tarafından ortaya çıkan bir nöronda mitokondriyal kalsiyum alımını göstermektedir. Görüntüleme, Coherent'ten bir milyon Ti Sapphire Ultra bir lazerle donatılmış Prairie Technologies'den Ultima iki fotonlu mikroskopi sistemi ile astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal floresan sinyallerin zaman atlamalı in vivo iki foton görüntülerinin toplanmasıyla yapılır. GCaMP5G ve 6s ile in vivo görüntüleme için en uygun olan 880 ila 910 nanometrelik ekscitasyon dalga boylarını kullanıyoruz.Astrositler ve mito-GCaMP5G ve 6s'in nörona özgü ekspresyasyonu ve SR101 veya nörona özgü belirteç NeuN'un astrositlere özgü etiketlemesinin birlikte lokalizasyonu ile yeniden doğrulanmıştır. Astrositlerde ve in vivo nöronlarda spontan mitokondriyal kalsiyum alımı, iki fotonlu mikroskopi kullanılarak hızlandırılmış görüntüleme ile gözlemlenebilir. Görüntüler, solda bir astrositte ve sağda bir nöronda bireysel mitokondrilerde spontan kalsiyum artışlarını göstermektedir.Yaklaşımlarımız hücre tipi spesifik mitokondriyal kalsiyum görüntüleme in vitro ve in vivo için yararlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal kalsiyum alımını nasıl görüntüleyebilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Görüntüleme hücre içi Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...