Name: the 6-hydroxydopamine rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-27T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione di ricerca di San Paolo (FAPESP, sovvenzione 2017/00003-0). Siamo grati per il Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES). Ringraziamo il Dr. Anthony R. West, il Dr. Heinz Steiner e il Dr. Kuei Y. Tseng per il supporto e il mentoring.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali hanno seguito i principi etici del Consiglio nazionale per il controllo della sperimentazione animale (CONCEA) e la legge Arouca (legge 11.794/2008) e sono state approvate dal comitato etico locale (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).
1. Preparazione di farmaci
<ol><li>Anestesia con ketamina/xilazina NOTA: La dose di ketamina utilizzata è di 70 mg/kg e la dose di xilazina è di 10 mg/kg.<ol>
<li>Per preparare 1 mL di anestetico ...

Questo documento descrive un protocollo per l'esecuzione di interventi chirurgici per microinfusione unilaterale di 6-OHDA nel MFB, in grado di causare lesioni robuste nei neuroni della via nigrostriatale e generare acinesia nell'animale. Viene inoltre descritto il protocollo per l'esecuzione del test di stepping, un test facilmente applicabile e non invasivo che può essere utilizzato per dimostrare il successo delle lesioni e valutare l'acinesia degli arti anteriori. Come presentato nei risultati rappresentativi, gli a...

Le principali caratteristiche neuropatologiche del PD sono la neurodegenerazione cronica progressiva dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNc) e la presenza di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina1. Poiché i neuroni dopaminergici SNc proiettano i loro assoni nello striato attraverso la via nigrostriatale, la neurodegenerazione dei neuroni in SNc provoca un deficit dopaminergico nello striato2. L'assenza di dopamina nello striato provoca uno squilibrio nelle attività delle vie di controllo motorio dirette e indirette, che è responsabile dei principali sintomi motori del PD: acinesia (movimento lento), bradicinesia (difficoltà nei movimenti iniziali), rigidità muscolare e tremore a riposo3,4,5.
Poiché i meccanismi molecolari e fisiologici coinvolti nell'insorgenza del PD non sono ancora completamente compresi, i principali trattamenti attualmente disponibili cercano di alleviare i sintomi motori attraverso farmacoterapie, stimolazione cerebrale profonda6,7, terapie genetiche8 e trapianto di cellule9. Pertanto, la ricerca preclinica è fondamentale per chiarire i meccanismi coinvolti nell'insorgenza della PD e scoprire nuove metodologie per la diagnosi precoce e nuove terapie per prevenire o fermare la degenerazione dei neuroni affetti da PD10.
I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per simulare la patologia umana in laboratorio, contribuendo al progresso della medicina e della scienza11,12,13,14. Tuttavia, è essenziale sottolineare che la scelta corretta del modello animale è fondamentale per il successo dello studio. Pertanto, il modello animale deve essere validato in tre aspetti principali: i) validità facciale, in cui il modello animale deve avere le caratteristiche della patologia umana; ii) validità costruttiva, in cui il modello animale deve avere una solida base teorica; e iii) validità predittiva, in cui i modelli animali devono rispondere ai trattamenti in modo simile al trattamento clinico.
Attualmente, diversi animali sono usati come modelli animali per PD. I gruppi principali includono mammiferi, come roditori, primati, minipig, cani e gatti e altri gruppi come drosophila e zebrafish. I roditori sono il modello animale più classico per PD e il più utilizzato per la loro facilità di manipolazione e manutenzione. Inoltre, l'anatomia e i meccanismi molecolari, cellulari e farmacologici del PD sono simili nei roditori e negli esseri umani15.
Una revisione pubblicata da Kin e colleghi nel 2019 ha analizzato le principali metodologie di modelli animali utilizzate per il PD negli anni 2000 e ha scoperto che il modello animale più utilizzato coinvolgeva neurotossine come la 6-idrossidopamina (6-OHDA) e l'1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Entrambe le neurotossine causano disregolazione mitocondriale nei neuroni dopaminergici nella via nigrostriatale, portando alla morte cellulare16. Un altro modello ampiamente utilizzato prevede la manipolazione genetica attraverso la mutazione in geni specifici coinvolti nell'insorgenza della PD, causando la disregolazione mitocondriale17. I modelli di neurotossina sono comunemente usati per valutare e confrontare le terapie, mentre i modelli genetici sono usati per studiare lo sviluppo di terapie preventive e PD15 idiopatiche.
La neurotossina MPTP è stata scoperta per causare parkinsonismo a metà degli anni 1980 dopo che sette pazienti hanno usato la sostanza e hanno mostrato gravi sintomi di PD. Oltre ai sintomi, i pazienti hanno risposto al trattamento con L-DOPA, che ha fatto sì che i ricercatori collegassero la molecola direttamente al PD. Dopo che il caso è stato pubblicato nel 1986, diversi ricercatori hanno iniziato a utilizzare MPTP nella ricerca preclinica sul PD18. I ricercatori hanno scoperto che essendo una molecola lipofila, MPTP può attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) ed essere convertito in MPP + 19. Questa sostanza tossica si accumula all'interno dei neuroni e provoca danni al complesso 1 della catena respiratoria mitocondriale, portando alla morte dei neuroni dopaminergici20.
Il modello di neurotossina 6-OHDA è stato utilizzato per la prima volta per indurre la degenerazione dei neuroni monoamminici della via nigrostriatale nel 196821. Il modello 6-OHDA è comunemente usato per causare neurodegenerazione nella via nigrostriatale in quanto è un analogo della dopamina e tossico per le cellule contenenti catecolamine. Dopo che il 6-OHDA entra nel cervello, può essere assorbito dal trasportatore della dopamina (DAT) nei neuroni dopaminergici, portando alla degenerazione della via nigrostriatale22. Poiché il 6-OHDA non penetra nella BBB, deve essere somministrato direttamente attraverso l'iniezione stereotassica intracerebrale23. Un inibitore della ricaptazione della noradrenalina è spesso combinato con la microiniezione 6-OHDA per preservare le fibre noradrenergiche e fornire una degenerazione più selettiva dei neuroni dopaminergici24.
Dopo che il DAT assume 6-OHDA, si accumulerà nel citosol dei neuroni, producendo specie reattive dell'ossigeno (ROS) e portando alla morte cellulare15. Vengono frequentemente utilizzati tre diversi modelli di lesioni di 6-OHDA: i) lesioni alla SNc25,26; ii) lesioni allo striato27,28; iii) lesioni al MFB29,30. Le lesioni causate nello striato provocano una degenerazione lenta e retrograda dei neuroni dopaminergici in SNpc. Al contrario, le lesioni causate in SNpc e MFB provocano una degenerazione rapida e totale dei neuroni, portando a sintomi parkinsoniani più avanzati31.
L'iniezione unilaterale o bilaterale di 6-OHDA può causare neurodegenerazione nei neuroni dopaminergici. 6-OHDA non sempre causa gravi danni ai neuroni; a volte, l'iniezione provoca danni parziali, che viene anche utilizzato per simulare le prime fasi di PD32. L'iniezione unilaterale è più comunemente usata a causa della capacità del modello di valutare i deficit motori dell'animale e prevedere la perdita cellulare attraverso test come la rotazione indotta da anfetamine / apomorfina e il test di stepping29. Le iniezioni bilaterali sono più utilizzate per valutare la memoria spaziale e il riconoscimento33.
Il test di rotazione indotto da anfetamine / apomorfina è un test comportamentale comunemente usato per prevedere la perdita cellulare nella via nigrostriatale. È definito come un processo in cui la somministrazione ripetuta di agonisti della dopamina porta ad un'intensificazione del comportamento rotazionale in animali 6-OHDA-lesionati34. Il comportamento rotazionale consiste nel quantificare la rotazione ipsilaterale indotta dalle anfetamine o le svolte controlaterali indotte dall'apomorfina nei roditori unilateralmente lesionati. Il comportamento rotazionale indotto da farmaci è stato criticato perché la rotazione non corrisponde ai sintomi del PD negli esseri umani e può essere influenzata da variabili come tolleranza, sensibilizzazione e "priming"35.
L'adescamento è uno dei fattori più critici in questi test comportamentali. Sono stati riportati alcuni casi in cui una singola dose di L-DOPA ha portato a un fallimento nei comportamenti rotazionali36. Inoltre, un altro fattore critico correlato all'applicazione combinata del test indotto dalle anfetamine e del test indotto dall'apomorfina per uso parallelo è che misurano diversi endpoint a causa di diversi meccanismi d'azione, riflettendo l'inattivazione di diversi meccanismi e percorsi di segnalazione. Inoltre, il test indotto dalle anfetamine è più accurato per misurare le lesioni nigrostriatali superiori al 50-60%, mentre il test indotto dall'apomorfina è più accurato per le lesioni superiori all'80%37.
Il test di passo è emerso come un test comportamentale che indica deficit legati alla degenerazione neuronale dopaminergica e agli effetti terapeutici. Consente l'analisi dell'acinesia causata da una lesione 6-OHDA nei neuroni dopaminergici senza una procedura indotta da farmaci. Inoltre, il test è stato ben consolidato e comunemente usato dal 1995, quando è stato descritto per la prima volta da Olsson et al.35. Nel 1999, Chang et al.38 hanno anche analizzato e confrontato le prestazioni dei ratti nel test di stepping con il livello di degenerazione causato da 6-OHDA e hanno scoperto che gli animali che hanno ottenuto risultati peggiori nel test di stepping avevano anche una degenerazione più significativa dei neuroni dopaminergici.
Il test di stepping è un metodo eccellente per prevedere un grave danno nigrostriatale dopaminergico nei ratti 6-OHDA-lesionati. L'evidenza suggerisce che i deficit motori compaiono nell'arto anteriore controlaterale dell'infusione di 6-OHDA durante il test di stepping quando il grado di perdita dopaminergica in SNc è >90%39. Questo documento descrive i protocolli, le metodologie e i materiali utilizzati per eseguire la chirurgia stereotassica per l'infusione unilaterale di 6-OHDA nell'MFB dei ratti e come prevedere le lesioni dopaminergiche causate dalla tossina attraverso il test di stepping.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-OHDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4381</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&#38;region=BR&#38;cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel 
			_6-ohda-_-srpRecs3-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795437</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&#38;region=BR&#38;gclid= 
			Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD 
			RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 
			_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 
			6yicaAot6EALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill or tap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 50 uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80539</td>
			<td>https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine</td>
			<td>Alfa Aeser</td>
			<td>J63723</td>
			<td>https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>Insight</td>
			<td>EFF-311</td>
			<td>https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Dopalen)</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine for trichotomy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Maxicam 2%&#160; Ourofino)</td>
			<td>Ourofino</td>
			<td></td>
			<td>https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentabiotic</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic waste garbage can</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-antibiotic</td>
			<td>Pentabiotic (Wealth)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>Insight</td>
			<td>EFF-331</td>
			<td>https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Anasedan)</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the 6-hydroxydopamine rat model of parkinson's disease

I sintomi motori della malattia di Parkinson (PD) - bradicinesia, acinesia e tremore a riposo - sono conseguenze della neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNc) e nel deficit striatale dopaminergico. I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per simulare la patologia umana in laboratorio. I roditori sono i modelli animali più utilizzati per pd grazie alla loro facilità di manipolazione e manutenzione. Inoltre, l'anatomia e i meccanismi molecolari, cellulari e farmacologici del PD sono simili nei roditori e negli esseri umani. L'infusione della neurotossina, 6-idrossidopamina (6-OHDA), in un fascio proencefalico mediale (MFB) di ratti riproduce la grave distruzione dei neuroni dopaminergici e simula i sintomi del PD. Questo protocollo dimostra come eseguire la microiniezione unilaterale di 6-OHDA nell'MFB in un modello di RATto di PD e mostra i deficit motori indotti da 6-OHDA e le lesioni dopaminergiche previste attraverso il test di stepping. Il 6-OHDA causa una significativa compromissione del numero di passaggi eseguiti con l'arto anteriore controlaterale.

Valutazione della lesione dopaminergica Il test di stepping consente la valutazione dell'acinesia dell'arto anteriore controlaterale alla lesione e la selezione di animali con una possibile lesione della via nigrostriatale indotta dall'infusione di 6-OHDA (Figura 1). Il confronto delle prestazioni del test di stepping dell'arto anteriore controlaterale pre-chirurgia e 2 settimane e 4 settimane dopo l'intervento ha rivelato un'interazione (F2,74 = 93,63; p < 0,0...

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The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

Il modello 6-idrossidopamina (6-OHDA) è stato utilizzato per decenni per far progredire la comprensione della malattia di Parkinson. In questo protocollo, dimostriamo come eseguire lesioni nigrostriatali unilaterali nel ratto iniettando 6-OHDA nel fascio proencefalico mediale, valutare i deficit motori e prevedere le lesioni utilizzando il test di stepping.

Il modello di ratto 6-idrossidopamina della malattia di Parkinson

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...

Questo protocollo dimostra come eseguire lesioni nigrostriatali unilaterali nel ratto iniettando 6-idrossidopamina nel fascio proencefalico mediale. Questo protocollo dimostra anche come valutare i deficit motori e prevedere le lesioni utilizzando il test di stepping. Questo modello riproduce la grave distruzione dei neuroni dopaminergici e simula i sintomi parkinsoniani nei ratti. Questo protocollo modello di ratto consente di studiare la malattia di Parkinson in laboratorio, coprendo diverse aree di interesse, come la fisiologia, l'anatomia e il meccanismo patologico della malattia. Il test viene eseguito con entrambi gli arti anteriori, uno alla volta, come descritto nel protocollo pretest. Esegui le sessioni di allenamento per tre giorni. Il primo giorno, nella prima sessione, tenere il ratto per 1 o 2 minuti per consentire al ratto di familiarizzare con il conduttore o lo sperimentatore. Nella seconda sessione, al fine di familiarizzare il ratto con la configurazione sperimentale per il test di stepping, tenere il ratto per 20 secondi, quindi posizionarlo sul tavolo per 20 secondi. Ripeti questo passaggio di allenamento per 3 minuti. Il secondo e il terzo giorno, nella prima sessione di allenamento, posizionare entrambe le zampe anteriori del ratto sul tavolo del protocollo tenendo le zampe posteriori e la schiena con una mano. Inclinare il ratto verso il basso, testa prima, con un angolo di 45

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