Name: the 6-hydroxydopamine rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-27T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP, beca 2017/00003-0). Agradecemos a la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES). Agradecemos al Dr. Anthony R. West, al Dr. Heinz Steiner y al Dr. Kuei Y. Tseng por su apoyo y tutoría.

Todos los procedimientos con animales siguieron los principios éticos del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA) y la Ley Arouca (Ley 11.794/2008) y fueron aprobados por el comité de ética local (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).
1. Preparación de medicamentos
<ol><li>Anestesia con ketamina/xilazina NOTA: La dosis de ketamina utilizada es de 70 mg/kg, y la dosis de xilazina es de 10 mg/kg.<ol>
<li>Para preparar 1 ml de anestésico con ke...

En este trabajo se describe un protocolo para la realización de cirugía para la microinfusión unilateral de 6-OHDA en el MFB, capaz de causar lesiones robustas en las neuronas de la vía nigrostriatal y generar acinesia en el animal. También se describe el protocolo para realizar la prueba de paso, una prueba fácilmente aplicable y no invasiva que se puede utilizar para demostrar el éxito de las lesiones y evaluar la acinesia de las extremidades anteriores. Como se presenta en los resultados representativos, los an...

Las principales características neuropatológicas de la EP son la neurodegeneración progresiva crónica de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta (SNc) y la presencia de cuerpos de Lewy que contienen proteína α-sinucleína1. A medida que las neuronas dopaminérgicas SNc proyectan sus axones en el cuerpo estriado a través de la vía nigrostriatal, la neurodegeneración de neuronas en SNc da como resultado un déficit dopaminérgico en el cuerpo estriado2. La ausencia de dopamina en el cuerpo estriado provoca un desequilibrio en las actividades de las vías de control motor directo e indirecto, responsable de los principales síntomas motores de la EP: acinesia (movimiento lento), bradicinesia (dificultad para iniciar movimientos), rigidez muscular y temblor en reposo3,4,5.
Como los mecanismos moleculares y fisiológicos implicados en la aparición de la EP aún no se comprenden del todo, los principales tratamientos actualmente disponibles buscan aliviar los síntomas motores a través de farmacoterapias, estimulación cerebral profunda6,7, terapias genéticas8 y trasplante celular9. Por ello, la investigación preclínica es fundamental para dilucidar los mecanismos implicados en la aparición de la EP y descubrir nuevas metodologías para el diagnóstico precoz y nuevas terapias para prevenir o detener la degeneración de las neuronas afectadas por la PD10.
Los modelos animales se han utilizado ampliamente para simular la patología humana en el laboratorio, contribuyendo al avance de la medicina y la ciencia11,12,13,14. Sin embargo, es fundamental destacar que la correcta elección del modelo animal es fundamental para el éxito del estudio. Por lo tanto, el modelo animal debe ser validado en tres aspectos principales: i) validez facial, en la que el modelo animal debe tener las características de patología humana; ii) validez constructiva, en la que el modelo animal debe tener una base teórica sólida; y iii) validez predictiva, en la que los modelos animales deben responder a los tratamientos de manera similar al tratamiento clínico.
Actualmente, varios animales se utilizan como modelos animales para la EP. Los grupos principales incluyen mamíferos, como roedores, primates, minipigs, perros y gatos, y otros grupos como drosophila y pez cebra. Los roedores son el modelo animal más clásico para la EP y el más utilizado debido a su facilidad de manejo y mantenimiento. Además, la anatomía y los mecanismos moleculares, celulares y farmacológicos de la EP son similares en roedores y humanos15.
Una revisión publicada por Kin y sus colegas en 2019 analizó las principales metodologías de modelos animales utilizadas para la EP en la década de 2000 y encontró que el modelo animal más utilizado involucraba neurotoxinas como 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). Ambas neurotoxinas causan desregulación mitocondrial en las neuronas dopaminérgicas en la vía nigrostriatal, lo que lleva a la muerte celular16. Otro modelo ampliamente utilizado consiste en la manipulación genética a través de la mutación en genes específicos implicados en la aparición de la EP, provocando la desregulación mitocondrial17. Los modelos de neurotoxinas se utilizan comúnmente para evaluar y comparar terapias, mientras que los modelos genéticos se utilizan para estudiar el desarrollo de terapias preventivas y PD15 idiopáticas.
Se descubrió que la neurotoxina MPTP causa parkinsonismo a mediados de la década de 1980 después de que siete pacientes usaron la sustancia y exhibieron síntomas graves de EP. Además de los síntomas, los pacientes respondieron al tratamiento con L-DOPA, lo que hizo que los investigadores vincularan la molécula directamente a la EP. Después de que el caso fue publicado en 1986, varios investigadores comenzaron a utilizar MPTP en la investigación preclínica de LA EP18. Los investigadores han descubierto que al ser una molécula lipofílica, MPTP puede cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y convertirse en MPP + 19. Esta sustancia tóxica se acumula en el interior de las neuronas y causa daños en el complejo 1 de la cadena respiratoria mitocondrial, provocando la muerte de las neuronas dopaminérgicas20.
El modelo de neurotoxina 6-OHDA se utilizó por primera vez para inducir la degeneración de las neuronas monoamina de la vía nigrostriatal en 196821. El modelo 6-OHDA se usa comúnmente para causar neurodegeneración en la vía nigrostriatal, ya que es un análogo de la dopamina y tóxico para las células que contienen catecolaminas. Después de que el 6-OHDA ingresa al cerebro, puede ser absorbido por el transportador de dopamina (DAT) en las neuronas dopaminérgicas, lo que lleva a la degeneración de la vía nigrostriatal22. Debido a que el 6-OHDA no penetra en el BBB, debe administrarse directamente a través de la inyección estereotáxica intracerebral23. Un inhibidor de la recaptación de noradrenalina a menudo se combina con microinyección 6-OHDA para preservar las fibras noradrenérgicas y proporcionar una degeneración más selectiva de las neuronas dopaminérgicas24.
Después de que daT absorba 6-OHDA, se acumulará en el citosol de las neuronas, produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) y llevando a la muerte celular15. Se utilizan con frecuencia tres modelos diferentes de lesiones de 6-OHDA: i) lesiones al SNc25,26; ii) lesiones en el cuerpo estriado27,28; iii) lesiones en el MFB29,30. Las lesiones causadas en el cuerpo estriado dan lugar a una degeneración lenta y retrógrada de las neuronas dopaminérgicas en SNpc. Por el contrario, las lesiones causadas en SNpc y MFB dan lugar a una degeneración rápida y total de las neuronas, dando lugar a síntomas parkinsonianos más avanzados31.
La inyección unilateral o bilateral de 6-OHDA puede causar neurodegeneración en las neuronas dopaminérgicas. 6-OHDA no siempre causa daño severo a las neuronas; a veces, la inyección resulta en daño parcial, que también se utiliza para simular las primeras etapas de PD32. La inyección unilateral se utiliza más comúnmente debido a la capacidad del modelo para evaluar los déficits motores del animal y predecir la pérdida celular a través de pruebas como la rotación inducida por anfetamina/apomorfina y la prueba de paso29. Las inyecciones bilaterales son las más utilizadas para evaluar la memoria espacial y el reconocimiento33.
La prueba de rotación inducida por anfetamina/apomorfina es una prueba de comportamiento comúnmente utilizada para predecir la pérdida celular en la vía nigrostriatal. Se define como un proceso en el que la administración repetida de agonistas dopaminérgicos conduce a una intensificación del comportamiento rotacional en animales lesionados por 6-OHDA34. El comportamiento rotacional consiste en cuantificar la rotación ipsilateral inducida por anfetaminas o los giros contralaterales inducidos por apomorfina en roedores lesionados unilateralmente. El comportamiento rotacional inducido por fármacos ha sido criticado porque la rotación no corresponde a los síntomas de la EP en humanos y puede verse afectada por variables como la tolerancia, la sensibilización y el "cebado"35.
El cebado es uno de los factores más críticos en estas pruebas de comportamiento. Se han reportado algunos casos en los que una sola dosis de L-DOPA condujo a un fracaso en los comportamientos rotacionales36. Además, otro factor crítico relacionado con la aplicación combinada de la prueba inducida por anfetamina y la prueba inducida por apomorfina para uso paralelo es que miden diferentes puntos finales debido a diferentes mecanismos de acción, lo que refleja la inactivación de diferentes mecanismos y vías de señalización. Además, la prueba inducida por anfetamina es más precisa para medir lesiones nigrostriatales por encima del 50-60%, mientras que la prueba inducida por apomorfina es más precisa para lesiones superiores al 80%37.
La prueba escalonada ha surgido como una prueba de comportamiento que indica déficits relacionados con la degeneración de las neuronas dopaminérgicas y los efectos terapéuticos. Permite el análisis de la acinesia causada por una lesión 6-OHDA en neuronas dopaminérgicas sin un procedimiento inducido por fármacos. Además, la prueba está bien establecida y se ha utilizado comúnmente desde 1995, cuando fue descrita por primera vez por Olsson et al.35. En 1999, Chang et al.38 también analizaron y compararon el rendimiento de las ratas en la prueba de paso con el nivel de degeneración causada por 6-OHDA y encontraron que los animales que se desempeñaron peor en la prueba de paso también tuvieron una degeneración más significativa de las neuronas dopaminérgicas.
La prueba de paso es un método excelente para predecir el daño nigrostriatal dopaminérgico severo en ratas lesionadas por 6-OHDA. La evidencia sugiere que los déficits motores aparecen en la extremidad anterior contralateral de la infusión de 6-OHDA durante la prueba de paso cuando el grado de pérdida dopaminérgica en SNc es >90%39. Este artículo describe los protocolos, metodologías y materiales utilizados para realizar la cirugía estereotáxica para la infusión unilateral de 6-OHDA en el MFB de ratas y cómo predecir las lesiones dopaminérgicas causadas por la toxina a través de la prueba de paso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-OHDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4381</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&#38;region=BR&#38;cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel 
			_6-ohda-_-srpRecs3-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>795437</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&#38;region=BR&#38;gclid= 
			Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD 
			RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 
			_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 
			6yicaAot6EALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill or tap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 50 uL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80539</td>
			<td>https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine</td>
			<td>Alfa Aeser</td>
			<td>J63723</td>
			<td>https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>Insight</td>
			<td>EFF-311</td>
			<td>https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Dopalen)</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine for trichotomy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Maxicam 2%&#160; Ourofino)</td>
			<td>Ourofino</td>
			<td></td>
			<td>https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentabiotic</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic waste garbage can</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-antibiotic</td>
			<td>Pentabiotic (Wealth)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>Insight</td>
			<td>EFF-331</td>
			<td>https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Anasedan)</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the 6-hydroxydopamine rat model of parkinson's disease

Los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson (EP) -bradicinesia, acinesia y temblor en reposo- son consecuencias de la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta (SNc) y el déficit estriatal dopaminérgico. Los modelos animales se han utilizado ampliamente para simular la patología humana en el laboratorio. Los roedores son los modelos animales más utilizados para la EP debido a su facilidad de manejo y mantenimiento. Además, la anatomía y los mecanismos moleculares, celulares y farmacológicos de la EP son similares en roedores y humanos. La infusión de la neurotoxina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), en un haz medial del cerebro anterior (MFB) de ratas reproduce la destrucción severa de las neuronas dopaminérgicas y simula los síntomas de la EP. Este protocolo demuestra cómo realizar la microinyección unilateral de 6-OHDA en el MFB en un modelo de rata de EP y muestra los déficits motores inducidos por 6-OHDA y las lesiones dopaminérgicas predichas a través de la prueba de paso. El 6-OHDA causa un deterioro significativo en el número de pasos realizados con la extremidad anterior contralateral.

Evaluación de la lesión dopaminérgica La prueba escalonada permite la evaluación de la acinesia del miembro anterior contralateral a la lesión y la selección de animales con una posible lesión de la vía nigrostriatal inducida por infusión de 6-OHDA (Figura 1). La comparación de la realización de la prueba de paso de extremidad anterior contralateral antes de la cirugía y 2 semanas y 4 semanas después de la cirugía reveló interacción (F2,74 = 93,...

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The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

El modelo de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) se ha utilizado durante décadas para avanzar en la comprensión de la enfermedad de Parkinson. En este protocolo, demostramos cómo realizar lesiones nigrostriatales unilaterales en la rata inyectando 6-OHDA en el haz medial del cerebro anterior, evaluar los déficits motores y predecir lesiones utilizando la prueba de paso.

El modelo de rata 6-hidroxidopamina de la enfermedad de Parkinson

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...

Este protocolo demuestra cómo realizar lesiones nigrostriatales unilaterales en la rata mediante la inyección de 6-hidroxidopamina en el haz medial del cerebro anterior. Este protocolo también demuestra cómo evaluar los déficits motores y predecir lesiones utilizando la prueba de paso. Este modelo reproduce la destrucción severa de las neuronas dopaminérgicas y simula los síntomas parkinsonianos en ratas. Este protocolo modelo de rata permite estudiar la enfermedad de Parkinson en el laboratorio, cubriendo varias áreas de interés, como la fisiología, la anatomía y el mecanismo patológico de la enfermedad. La prueba se realiza con ambas extremidades anteriores, una a la vez, como se describe en el protocolo previo a la prueba. Realizar las sesiones de entrenamiento durante tres días. El primer día, en la primera sesión, sostenga a la rata durante 1 a 2 minutos para permitir que la rata se familiarice con el manejador o experimentador. En la segunda sesión, para familiarizar a la rata con la configuración experimental para la prueba de paso, sostenga a la rata durante 20 segundos y luego colóquela sobre la mesa durante 20 segundos. Repita este paso de entrenamiento durante 3 minutos. En el segundo y tercer día, en la primera sesión de entrenamiento, coloque ambas patas delanteras de la rata en la mesa de protocolo sosteniendo sus patas traseras y traseras con una mano. Incline la rata hacia abajo, cabeza primero, en un ángulo de 45

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