Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der São Paulo Research Foundation (FAPESP, Stipendium 2017/00003-0) unterstützt. Wir sind dankbar für die Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES). Wir danken Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner und Dr. Kuei Y. Tseng für die Unterstützung und das Mentoring.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Ethikkommission der Fakultät für Philosophie, Naturwissenschaften und Literatur von Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5) durchgeführt.
1. 6-OHDA-Läsion
<ol><li>Verwenden Sie zu Beginn der Experimente (6 Wochen) männliche Ratten von Sprague-Dawley mit einem Gewicht von 200-250 g. Unterbringung der Tiere (2-3 pro Käfig) unter Standardlaborbedingungen (12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus, Licht an um 06:00 Uhr, temperaturge...

Dieses Protokoll zeigt, wie AIMs im Rattenmodell von PD induziert und analysiert werden können, die durch einseitige Mikroinjektion von 6-OHDA in das MFB induziert werden. Die chronische tägliche Verabreichung niedriger Dosen von L-DOPA (5 mg/kg, kombiniert mit 12,5 mg/kg Benserazid) führte zur Entwicklung von AIM über die 3 Behandlungswochen. Die zeitliche Analyse ergab einen signifikanten Anstieg der AIMs, und die Dyskinesie mit der höchsten Dosis wird zwischen 30 und 90 Minuten nach der Verabreichung von L-DOPA b...

Die Dopamin-Vorstufe L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) stellt die wirksamste Behandlung der motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit (PD)1 dar. Die L-DOPA-Therapie kann motorische Symptome im Zusammenhang mit PD lindern, verliert jedoch mit der Zeit an Wirksamkeit. Motorische Schwankungen wie "Abnutzungsschwankung" oder "Verschlechterung am Ende der Dosis" manifestieren sich klinisch als verkürzte Wirkungsdauer einzelner L-DOPA-Dosen2. In anderen Fällen bestehen klinische Manifestationen aus langsamen Drehbewegungen und abnormalen Körperhaltungen (Dystonie)3 und treten auf, wenn der Dopaminspiegel niedrig ist (Off-Period-Dystonie)4. Auf der anderen Seite treten L-DOPA-induzierte Dyskinesien (LIDs) auf, wenn der Dopaminspiegel im Plasma und im Gehirn hoch ist5.
LIDs erzeugen schwächende Nebenwirkungen, darunter motorische Komplikationen wie choreiforme, dystonische und ballistische6-Bewegungen. Einmal etabliert, treten LIDs nach jeder L-DOPA-Verabreichung auf. Motorische Komplikationen treten bei 40% -50% der PD-Patienten auf, die sich 5 Jahre lang einer L-DOPA-Therapie unterziehen, und die Inzidenz steigt im Laufe der Jahre7. Obwohl die pathophysiologischen Mechanismen, die an der Entwicklung von LIDs bei Parkinson-Patienten beteiligt sind, noch nicht vollständig aufgeklärt sind, sind das Ausmaß der dopaminergen Denervierung, die pulsatile L-DOPA-Verabreichung, nachgeschaltete Veränderungen in striatalen Proteinen und Genen sowie Anomalien in Nicht-Dopamin-Transmittersystemen Faktoren, die zur Entwicklung dieser unerwünschten Nebenwirkungen beitragen 6,8,9,10.
Das Neurotoxin 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) ist ein gut charakterisiertes Werkzeug zur Untersuchung von PD bei Nagetieren11,12,13,14. Da 6-OHDA die Blut-Hirn-Schranke nicht überschreitet, muss es direkt in den nigrostriatalen Weg injiziert werden. 6-OHDA-induzierte dopaminerge Depletion ist konzentrations- und standortabhängig15. Die einseitige Verabreichung von 6-OHDA am medialen Vorderhirnbündel (MFB) kann bei Nagetieren schwere (>90%) nigrostriatale Schäden verursachen16,17,18,19. Die chronische Verabreichung von L-DOPA an schwere einseitig 6-OHDA-läsionierte Nagetiere verursacht das Auftreten dyskinetischer Bewegungen, die als abnormale unwillkürliche Bewegungen (AIMs) bezeichnet werden. Dyskinetische Bewegungen bei Nagetieren haben ähnliche molekulare, funktionelle und pharmakologische Mechanismen im Zusammenhang mit LIDs bei Parkinson-Patienten5. Daher sind 6-OHDA-läsionierte Ratten20 und Mäuse21 wertvolle präklinische Modelle zur Untersuchung von LIDs. Bei chronischer Behandlung (7-21 Tage) mit therapeutischen Dosen von L-DOPA (5-20 mg/kg) zeigen einseitig 6-OHDA-läsionierte Ratten und Mäuse eine allmähliche Entwicklung von AIMs, die die Vordergliedmaßen, den Rumpf und die orofazialen Muskeln kontralateral zur Läsion betreffen 17,18,19,20,22,23,24 . Diese Bewegungen zeigen sich in einem Zeitverlauf, der L-DOPA-induzierten Spitzendosis-Dyskinesien bei PD-Patienten25 ähnelt und sind durch hyperkinetische Bewegungen und Dystoniegekennzeichnet 5. AIMs werden normalerweise basierend auf ihrem Schweregrad (z. B. wenn ein bestimmtes AIM vorhanden ist) und ihrer Amplitude (z. B. gekennzeichnet durch die Amplitude jeder Bewegung) bewertet5,23,25.
6-OHDA-läsionierte Nagetiermodelle von LIDs zeigen Gesichtsvalidität (d.h. das Modell hat mehrere Merkmale, die dem menschlichen Zustand ähneln)5,11,26,27,28. Nagetier-AIMs, ähnlich wie bei Parkinson-Patienten, werden als hyperkinetische (Vordergliedmaßen und orolinguale) und dystone (axiale) Bewegungen angesehen29 und ahmen Dyskinesie mit höchster Dosis nach. Auf molekularer und funktioneller Ebene teilen Nagetiermodelle viele pathologische Merkmale mit PD-Patienten5, wie z.B. die Hochregulierung von FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 und Serotonintransporter (SERT)34,35 . In Bezug auf die prädiktive Validität zeigen Medikamente, die LIDs bei Parkinson-Patienten reduzieren (z. B. der N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptorantagonist Amantadin), eine antidyskinetische Wirksamkeit im Nagetiermodell 22,36,37,38,39.
Die Bewertungsskala für Nagetier-AIM wurde basierend auf vier AIMs-Subtypen erstellt, darunter AIMs, die Kopf, Hals und Rumpf betreffen (axiale AIMs), hyperkinetische Vorderbeinbewegungen (Gliedmaßen-AIMs) und dyskinetisch-ähnliche orolinguale Bewegungen (orolinguale AIMs). Obwohl die kontralaterale Rotation (Lokomotiv-AIMs) auch bei einseitig läsionierten Nagetieren 20,22,23,25,40 vorhanden ist, wurde sie nicht als dyskinetische Bewegung bewertet, da sie möglicherweise kein spezifisches Maß für LIDs 22,37,41 darstellt.
Hier werden wir beschreiben, wie dyskinetische Bewegungen (axiale, gliedmaßenartige und orolinguale AIMs) im schweren (>90%) einseitig 6-OHDA-läsionierten Rattenmodell von PD induziert und analysiert werden können. Wir haben unser Protokoll auf der Grundlage der bisherigen Literatur und unseres Laborfachwissens organisiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

L-DOPA-induzierte Dyskinesien (LIDs) beziehen sich auf motorische Komplikationen, die durch eine längere L-DOPA-Verabreichung an Patienten mit Parkinson-Krankheit (PD) entstehen. Das häufigste Muster, das in der Klinik beobachtet wird, ist die Spitzendosis-Dyskinesie, die aus klinischen Manifestationen von choreiformen, dystonischen und ballistischen Bewegungen besteht. Das 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) Rattenmodell von PD ahmt mehrere Eigenschaften von LIDs nach. Nach wiederholter L-DOPA-Verabreichung zeigen 6-OHDA-läsionierte Ratten dyskinetische Bewegungen (z. B. abnormale unwillkürliche Bewegungen, AIMs). Dieses Protokoll zeigt, wie AIMs bei 6-OHDA-läsionierten Ratten mit 90%-95% dopaminerger Depletion im nigrostriatalen Signalweg induziert und analysiert werden können. Wiederholte Verabreichung (3 Wochen) von L-DOPA (5 mg/kg, kombiniert mit 12,5 mg/kg Benserazid) kann die Entwicklung von AIM induzieren. Die Zeitverlaufsanalyse zeigt einen signifikanten Anstieg der AIMs nach 30-90 min (Peak-Dose-Dyskinesie). Nagetiermodelle von LIDs sind ein wichtiges präklinisches Instrument, um wirksame antidyskinetische Interventionen zu identifizieren.

Obwohl die bei Ratten beobachteten AIM-Muster im Vergleich zu denen bei Menschen und nichtmenschlichen Primaten einfacher und begrenzter sind, reproduziert dieses Modell sowohl hyperkinetische als auch dystonische Bewegungen, die durch chronische L-DOPA-Verabreichung induziert werden. Hier präsentieren wir Daten aus einer Gruppe (n = 10) von einseitig 6-OHDA-läsionierten Ratten, die 3 Wochen lang (Montag bis Freitag) chronisch mit L-DOPA (5 mg/kg kombiniert mit 12,5 mg/kg Benserazid) behandelt wurden. Beachten Sie, das...

Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

Nagetiermodelle von L-DOPA-induzierten Dyskinesien sind unschätzbare Werkzeuge, um therapeutische Interventionen zu identifizieren, um die Entwicklung abzuschwächen oder die Manifestationen zu lindern, die aufgrund der wiederholten Verabreichung von L-DOPA auftreten. Dieses Protokoll zeigt, wie dyskinetische Bewegungen im einseitig 6-OHDA-läsionierten Rattenmodell der Parkinson-Krankheit induziert und analysiert werden können.

Bewertung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien im einseitig 6-OHDA-läsionierten Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

Die Bewertung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien im 6-Hydroxydopamin-Rattenmodell der Parkinson-Krankheit ist ein wichtiges präklinisches Instrument, um wirksame antidyskinetische Interventionen zu identifizieren. Dieses Modell ist relativ einfach, bietet niedrige Kosten und hat Ähnlichkeiten mit dem, was in der Klinik passiert. Das Verfahren demonstriert Danilo Leandro Ribeiro, Doktorand im Labor.Beginnen Sie das Experiment mit männlichen Sprague-Dawley-Ratten, die 200 bis 250 Gramm wiegen. Unterbringung von zwei bis drei Tieren pro Käfig unter den Standardlaborbedingungen mit Futter und Wasser ad libitum. Vor der Operation den Noradrenalin-Transporter-Hemmer Imipramin intraperitoneal an die Ratte verabreichen.Nachdem Sie die Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf das Zehenklemmen bestätigt haben, positionieren Sie die Ratte in Bauchlage im stereotaktischen Gerät auf dem Heizkissen. Sobald die Ratte positioniert ist, verwenden Sie ein Skalpell, um einen einen Zentimeter langen Schnitt in der Region zu machen, in der die Mikroinjektion stattfinden wird. Reinigen Sie dann die Schädelregion mit Wattestäbchen und stellen Sie sicher, dass Bregma und Lambda freiliegen.Nehmen Sie das mediale Vorderhirnbündel oder MFB, stereotaktische Koordinaten von Bregma 4,3 Millimeter vorne, 1,6 Millimeter seitlich zur rechten Seite und 8,3 Millimeter ventral vom Durometer. Wenn die Koordinaten festgelegt sind, verabreichen Sie das 6-Hydroxydopamin oder 6-OHDA einseitig mit einer Rate von 0,4 Mikrolitern pro Minute in der richtigen MFB mit einer 50-Mikroliter-Hamilton-Glasspritze. Am Ende der Operation vernähen Sie den Kopfhautschnitt und rehydrieren Sie das Tier mit warmer, steriler, 0,9% Kochsalzlösung subkutan in einer Dosis von 10 Milliliter pro Kilogramm.Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es in einen warmen Erholungskäfig, während Sie es überwachen, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Messen Sie vier Wochen nach der Läsion die Wirksamkeit der dopaminergen Läsion mit einem Schritttest, indem Sie die Akinesie der Vordergliedmaße kontralateral zur Läsion beurteilen. Ratten, die drei oder weniger Anpassungsschritte mit der kontralateralen Vorderbein aufweisen, sollten als mutmaßliche, schwer 6-OHDA-läsionierte Ratten in die Studie einbezogen werden.Vier Wochen nach den 6-OHDA-Läsionen beginnen Sie die chronische Behandlung am Montag und zeichnen abnormale unwillkürliche Bewegungen am Mittwoch auf. Setzen Sie die Ratte dazu in einen transparenten Zylinder mit 20 Zentimetern Durchmesser und 40 Zentimetern Höhe und lassen Sie sie mindestens 15 Minuten akklimatisieren. Stellen Sie sicher, dass der Boden mit dem Einstreumaterial bedeckt ist und die Spiegel hinter dem Zylinder positioniert sind, um das Tier aus allen möglichen Winkeln zu beobachten.Positionieren Sie eine hochauflösende Videokamera, um die Anzeige von axialen, gliedrigen und orolingualen abnormalen unwillkürlichen Bewegungen zu ermöglichen. Die Spiegel hinter dem Zylinder ermöglichen es, abnormale unwillkürliche Bewegungen in einem 360-Grad-Winkel zu verfolgen. Die Kamera kann in einem 15-Grad-Winkel von Tieren leicht unter dem Flugzeug positioniert werden, um orolinguale abnormale unwillkürliche Bewegungen zu beobachten.Wenn die Position festgelegt ist, befestigen Sie die Kamera direkt an der Bank. Sobald das Tier für 15 Minuten akklimatisiert ist, nehmen Sie das Tier aus dem Zylinder und verabreichen Sie fünf Milligramm pro Kilogramm frisch zubereitetes L-Dopamin oder L-DOPA kombiniert mit 12,5 Milligramm pro Kilogramm Benserazid, subkutan. Setzen Sie das Tier zurück in den Zylinder und starten Sie einen Timer, um abnormale unwillkürliche Bewegungen zu verfolgen.Verwenden Sie eine Videokamera, um die abnormalen unwillkürlichen Bewegungen 180 Minuten nach der Injektion in 30-Minuten-Intervallen aufzuzeichnen, um eine Offline-Bewertung durchzuführen. Nach den sechs Beobachtungsperioden müssen die Scores über ein bis zwei Minuten Epochen angegeben und als axial, gliederisch oder orolingual klassifiziert werden. Stellen Sie sicher, dass Sie keine normalen Verhaltensweisen einbeziehen.Die Behandlung mit L-DOPA und Benzerazid sollte drei Wochen lang einmal täglich von Montag bis Freitag fortgesetzt werden. In der repräsentativen Zeitverlaufsanalyse werden die Werte für axiale, gliedmaßen- und orolinguale abnormale unwillkürliche Bewegungen über drei Wochen chronischer L-DOPA-Verabreichung gezeigt. Es wurde festgestellt, dass L-DOPA-induzierte, hochdosierte Dyskinesien zwischen 30 und 90 Minuten auftreten, mit einer allmählichen Abnahme nach 120 Minuten nach der Injektion.Darüber hinaus wurde die Summe der axialen, gliedmaßenartigen und orolingualen abnormalen unwillkürlichen Bewegungen an Individuen präsentiert, die Tage und wöchentlich über drei Wochen chronischer L-DOPA-Verabreichung bewerteten. Das Protokoll für abnorme unwillkürliche Bewegungen dient in der Regel der Untersuchung neuer therapeutischer Instrumente mit antidyskinetischem translationalem Potenzial.

Research

JoVE Journal

Biology

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der Parkinson-Krankheit

Forschung

Biologie

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

The Structure of Skilled Vorderbein Reaching in den Rat: A Movement Rating Scale

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Die Implantation von Engineered Tissue in der Ratte Herz

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Mausmodell für Morbus Parkinson: von 6-OH Dopamin Läsion Behavioral-Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...