Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP, מענק 2017/00003-0). אנו מודים על התיאום לשיפור כוח האדם בהשכלה הגבוהה (CAPES). אנו מודים לד"ר אנתוני ר. ווסט, ד"ר היינץ שטיינר וד"ר קואי י. צנג על התמיכה וההדרכה.

כל הניסויים בוצעו בהתאם לוועדת האתיקה של הפקולטה לפילוסופיה, מדעים ומכתבי ריבייראו פרטו (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).
1. נגע 6-OHDA
<ol><li>השתמשו בחולדות זכריות של ספראג-דאולי במשקל 200-250 גרם בתחילת הניסויים (6 שבועות). בית החיות (2-3 לכל כלוב) בתנאי מעבדה סטנדרטיים (מחזור אור/חושך של 12:12 ש...

פרוטוקול זה מדגים כיצד לגרום ולנתח AIMs במודל החולדות של PD המושרה על ידי מיקרו-הזרקה חד צדדית של 6-OHDA ב- MFB. מתן יומי כרוני של מינונים נמוכים של L-DOPA (5 מ"ג/ק"ג, בשילוב עם 12.5 מ"ג/ק"ג של בנסרזיד) הביא לפיתוח AIMs במהלך 3 שבועות של טיפול. ניתוח טמפורלי גילה עלייה משמעותית של AIMs, ואת מינון השיא dyskinesia הוא ציי...

מבשר הדופמין L-3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין (L-DOPA) מייצג את הטיפול היעיל ביותר לתסמינים המוטוריים של מחלת פרקינסון (PD)1. טיפול ב-L-DOPA עשוי להקל על תסמינים מוטוריים הקשורים למחלת פרקינסון, אך מאבד מיעילותו עם הזמן. תנודות מוטוריות כגון "תנודות שחיקה" או "הידרדרות בסוף המינון" מתבטאות קלינית כמשך זמן מקוצר של ההשפעה של מנות L-DOPA בודדות2. במקרים אחרים, ביטויים קליניים מורכבים מתנועות פיתול איטיות ותנוחות לא תקינות (דיסטוניה)3 ומתרחשים כאשר רמות הדופמין נמוכות (דיסטוניה מחוץ לתקופה)4. מצד שני, dyskinesias המושרה על ידי L-DOPA (LIDs) מופיעים כאשר רמות הדופמין בפלזמה ובמוח גבוהות5.
LIDs מייצרים תופעות לוואי מתישות הכוללות סיבוכים מוטוריים כגון choreiform, דיסטוני, ותנועותבליסטיות 6. לאחר ההתבססות, LIDs מופיעים לאחר כל מתן L-DOPA. סיבוכים מוטוריים מתרחשים אצל 40%-50% מחולי פרקינסון העוברים טיפול L-DOPA במשך 5 שנים, והשכיחות עולה עם השנים7. למרות שהמנגנונים הפתופיזיולוגיים המעורבים בהתפתחות של LIDs בחולי פרקינסון עדיין לא הובהרו במלואם, היקף ניתוק העצבים הדופמינרגי, מתן L-DOPA פועם, שינויים במורד הזרם בחלבונים ובגנים סטריאליים, וחריגות במערכות משדרים שאינן דופמין הם גורמים התורמים להתפתחות תופעות לוואי לא רצויות אלה 6,8,9,10.
הנוירוטוקסין 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA) הוא כלי מאופיין היטב לחקר מחלת פרקינסון במכרסמים11,12,13,14. מאז 6-OHDA אינו חוצה את מחסום הדם-מוח, זה חייב להיות מוזרק ישירות לתוך המסלול nigrostriatal. דלדול דופמינרגי המושרה על ידי 6-OHDA הוא תלוי ריכוז ואתר15. מתן חד צדדי של 6-OHDA בצרור המוח הקדמי המדיאלי (MFB) יכול לגרום לנזק חמור (>90%) ניגרוסטריאטלי במכרסמים16,17,18,19. מתן כרוני של L-DOPA למכרסמים חד-צדדיים עם 6-OHDA גרם להופעת תנועות דמויות דיסקינטיות בשם תנועות לא רצוניות חריגות (AIMs). תנועות דמויות דיסקינטיקה במכרסמים חולקות מנגנונים מולקולריים, תפקודיים ופרמקולוגיים דומים הקשורים ל-LIDs בחולי פרקינסון5. לכן, חולדות20 ועכברים21 עם 6-OHDA הם מודלים פרה-קליניים חשובים לחקר LIDs. כאשר מטופלים באופן כרוני (7-21 ימים) במינונים טיפוליים של L-DOPA (5-20 מ"ג/ק"ג), באופן חד צדדי 6-OHDA חולדות ועכברים עם נגעים מראים התפתחות הדרגתית של AIMs המשפיעים על השרירים הקדמיים, תא המטען והאורופציאלי בניגוד לנגע 17,18,19,20,22,23,24 . תנועות אלה מוצגות במהלך זמן הדומה לדיסקינזיות במינון שיא המושרה על ידי L-DOPA בחולי פרקינסון25 ומאופיינות בתנועות היפרקינטיות ודיסטוניה5. AIMs מקבלים בדרך כלל ניקוד על סמך חומרתם (למשל, כאשר קיים AIM מסוים) והמשרעת (למשל, מאופיינת על ידי המשרעת של כל תנועה)5,23,25.
6-OHDA-נגע מכרסמים מודלים של LIDs להציג תוקף פנים (כלומר, המודל יש כמה מאפיינים שנראים כמו המצב האנושי)5,11,26,27,28. AIMs של מכרסמים, בדומה למה שקורה בחולי פרקינסון, נתפסים כתנועות היפרקינטית (פורלימב ואורולינגואלית) ודיסטונית (צירית)29 ומחקים דיסקינזיה במינון שיא. ברמה המולקולרית והתפקודית, מודלים של מכרסמים חולקים מאפיינים פתולוגיים רבים עם חולי פרקינסון5, כגון ויסות של FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 וטרנספורטר סרוטונין (SERT)34,35 . בנוגע לתוקף הניבוי, תרופות המפחיתות LIDs בחולי פרקינסון (למשל, אנטגוניסט קולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) אמנטדין) מציגות יעילות אנטי-דיסקינטית במודל המכרסמים 22,36,37,38,39.
סולם הדירוג של מכרסמים AIMs נוצר בהתבסס על ארבעה תתי-סוגים של AIMs הכוללים AIMs המשפיעים על הראש, הצוואר והגזע (AIMs ציריים), תנועות קדמימב היפרקינטיות (AIMs של גפיים) ותנועות אורולינגואליות דמויות דיסקינטיות (AIMs אורולינגואליות). למרות שסיבוב קונטרלטרלי (AIMs קטר) קיים גם במכרסמים נגעים חד צדדיים 20,22,23,25,40, הוא לא קיבל ניקוד כתנועה דמוית דיסקינט מכיוון שהוא עשוי שלא לייצג מדד ספציפי של LIDs 22,37,41.
במאמר זה נתאר כיצד לגרום ולנתח תנועות דמויות דיסקינטיות (AIMs ציריים, גפיים ואורולינגואליים) במודל החולדות החמורות (>90%) החד-צדדיות עם 6-OHDA של מחלת פרקינסון. ארגנו את הפרוטוקול שלנו על סמך הספרות הקודמת והמומחיות שלנו במעבדה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

דיסקינזיות הנגרמות על-ידי L-DOPA (LIDs) מתייחסות לסיבוכים מוטוריים הנובעים ממתן ממושך של L-DOPA לחולי פרקינסון (PD). הדפוס הנפוץ ביותר שנצפה במרפאה הוא דיסקינזיה במינון שיא המורכבת מביטויים קליניים של תנועות כורייפורמיות, דיסטוניות ובליסטיות. מודל החולדות 6-hydroxydopamine (6-OHDA) של מחלת פרקינסון מחקה מספר מאפיינים של LIDs. לאחר מתן L-DOPA חוזר ונשנה, חולדות עם 6 נגעים של OHDA מציגות תנועות דמויות דיסקינטיות (למשל, תנועות לא רצוניות חריגות, AIMs). פרוטוקול זה מדגים כיצד לגרום ולנתח AIMs בחולדות עם 6-OHDA נגע עם 90%-95% דלדול דופמינרגי במסלול nigrostriatal. מתן חוזר (3 שבועות) של L-DOPA (5 מ"ג/ק"ג, בשילוב עם 12.5 מ"ג/ק"ג של בנסרזיד) יכול לגרום להתפתחות של AIMs. ניתוח קורס הזמן מגלה עלייה משמעותית ב- AIMs ב 30-90 דקות (דיסקינזיה במינון שיא). מודלים מכרסמים של LIDs הם כלי פרה-קליני חשוב לזיהוי התערבויות אנטי-דיסקינטיות יעילות.

אף על פי שדפוסי ה-AIMs שנצפו בחולדות פשוטים ומוגבלים יותר בהשוואה לאלה שנצפו בבני אדם ובפרימטים לא אנושיים, מודל זה משחזר תנועות היפרקינטיות ודיסטוניות המושרות על-ידי מתן L-DOPA כרוני. כאן אנו מציגים נתונים שנאספו מקבוצה (n = 10) של חולדות חד-צדדיות עם 6-OHDA שטופלו באופן כרוני ב-L-DOPA (5 מ"ג/ק"ג בשילוב ע?...

Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

מודלים מכרסמים של dyskinesias המושרה על ידי L-DOPA הם כלים שלא יסולא בפז כדי לזהות התערבויות טיפוליות כדי להחליש את הפיתוח או להקל על הביטויים המופיעים עקב מתן חוזר ונשנה של L-DOPA. פרוטוקול זה מדגים כיצד לגרום ולנתח תנועות דמויות דיסקינטיות במודל החולדות החד-צדדיות עם 6-OHDA של מחלת פרקינסון.

דירוג L-DOPA-המושרה על ידי דיסקינזיות במודל העכברוש החד-צדדי 6-OHDA-נגעים של מחלת פרקינסון

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

דירוג דיסקינזיות המושרות על-ידי L-DOPA במודל החולדות 6-הידרוקסידופמין של מחלת פרקינסון הוא כלי פרה-קליני חשוב לזיהוי התערבויות אנטי-דיסקינטיות יעילות. מודל זה הוא פשוט יחסית, מציג עלות נמוכה, ויש לו קווי דמיון למה שקורה במרפאה. ההליך יודגם על ידי דנילו ליאנדרו ריביירו, דוקטורנט במעבדה.התחל את הניסוי עם חולדות זכרים Sprague-Dawley, במשקל 200 עד 250 גרם. אכלסו שניים עד שלושה בעלי חיים בכל כלוב בתנאי המעבדה הסטנדרטיים עם מזון ומים זמינים ad libitum. לפני הניתוח, לתת את מעכב טרנספורטר נוראדרנלין, imipramine, לחולדה intraperitoneally.לאחר אישור ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת הבוהן, מקם את החולדה במצב נוטה במנגנון הסטריאוטקסי על גבי כרית החימום. לאחר מיקום החולדה, השתמשו באזמל כדי לבצע חתך באורך סנטימטר אחד באזור שבו תתרחש המיקרו-הזרקה. לאחר מכן, נקו את אזור הגולגולת עם צמר גפן וודאו שהברגמה והלמבדה חשופות.קח את צרור המוח הקדמי המדיאלי, או MFB, קואורדינטות סטריאוטקסיות מברגמה ב 4.3 מילימטרים קדמיים, 1.6 מילימטרים לרוחב לצד ימין, ו 8.3 מילימטרים גחון מהדורומטר. כאשר הקואורדינטות נקבעות, לנהל את 6-hydroxydopamine, או 6-OHDA, באופן חד צדדי בקצב של 0.4 microliters לדקה MFB ימין, עם מזרק זכוכית המילטון 50 מיקרוליטר. בתום הניתוח תופרים את חתך הקרקפת ומייבשים מחדש את בעל החיים בתמיסת מלח חמה, סטרילית, 0.9% תת עורית, במינון של 10 מיליליטר לקילוגרם.הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח אותה בכלוב התאוששות חם, תוך ניטור עד להחזרת ההכרה. בארבעה שבועות לאחר הנגע, למדוד את היעילות של הנגע הדופמינרגי באמצעות מבחן צעד, על ידי הערכת akinesia של forelimb contralateral לנגע. חולדות המציגות שלושה או פחות שלבי הסתגלות עם הפורלימב הנגדי צריכות להיכלל במחקר כחולדות בעלות 6 נגעים חמורים של OHDA.ארבעה שבועות לאחר נגעי 6-OHDA, להתחיל את הטיפול הכרוני ביום שני ולרשום תנועות לא רצוניות חריגות ביום רביעי. לשם כך, הניחו את החולדה בתוך גליל שקוף בקוטר 20 ס"מ ובגובה 40 ס"מ, ותנו לה להתאקלם למשך 15 דקות לפחות. ודאו שהרצפה מכוסה בחומר המצעים והמראות ממוקמות מאחורי הצילינדר כדי לצפות בבעל החיים מכל הזוויות האפשריות.מקם מצלמת וידאו ברזולוציה גבוהה כדי לאפשר צפייה בתנועות לא רצוניות ציריות, גפיים ואורולינגואליות חריגות. המראות מאחורי הצילינדר יאפשרו מעקב אחר תנועות לא רצוניות חריגות בזווית של 360 מעלות. ניתן למקם את המצלמה מעט מתחת למישור בזווית של 15 מעלות מבעלי חיים כדי לצפות בתנועות לא רצוניות חריגות.כאשר המיקום נקבע, הצמידו את המצלמה ישירות לספסל. לאחר בעל החיים הוא התאקלם במשך 15 דקות, להסיר את החיה מן הגליל ולנהל חמישה מיליגרם לכל קילוגרם של L-דופמין מוכן טרי או L-DOPA בשילוב עם 12.5 מיליגרם לק"ג של benserazide, תת עורית. החזירו את החיה לצילינדר והפעילו טיימר כדי לעקוב אחר תנועות לא רצוניות חריגות.השתמש במצלמת וידאו כדי לתעד את התנועות הלא רצוניות החריגות במשך 180 דקות לאחר ההזרקה, במרווחים של 30 דקות, כדי לבצע ניקוד לא מקוון. לאחר שש תקופות התצפית, יש לתת את הציונים על פני תקופות של דקה עד שתיים ולסווג אותם כציריים, גפיים או אורולינגואליים. הקפידו לא לכלול התנהגויות נורמליות.הטיפול עם L-DOPA ו benserazide צריך להימשך במשך שלושה שבועות, פעם ביום, מיום שני עד שישי. בניתוח קורס הזמן המייצג, מוצגים הציונים שהוחלו על תנועות לא רצוניות לא תקינות ציריות, גפיים ואורולינגואליות חריגות במשך שלושה שבועות של מתן L-DOPA כרוני. צוין כי דיסקינזיות המושרות על ידי L-DOPA, מינון שיא, מתרחשות בין 30 ל -90 דקות, עם ירידה הדרגתית לאחר 120 דקות לאחר ההזרקה.בנוסף, סכום התנועות הלא רצוניות הציריות, הגפיים והאורולינגואליות החריגות הוצג על אנשים, תוך ציון ימים ושבוע במשך שלושה שבועות של מתן L-DOPA כרוני. פרוטוקול התנועות הלא רצוניות החריגות הוא בדרך כלל לחקירת כלים טיפוליים חדשים עם פוטנציאל תרגום אנטי-דיסקינטי.

Research

JoVE Journal

Biology

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

אולה Isacson: פיתוח טיפולים חדשים עבור מחלת פרקינסון

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

מבנה Forelimb מיומנים להגיע ב עכברוש: ​​סולם דירוג התנועה

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

השתלת רקמות מהונדסות בלב החולדה

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

דגם Murine עבור מחלת פרקינסון: מן הנגע 6-OH דופמין מבחן ההתנהגות

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...