Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

이 연구는 상파울루 연구 재단 (FAPESP, 보조금 2017/00003-0)의 지원을 받았습니다. 고등 교육 인력 향상을 위한 조정(CAPES)에 감사드립니다. Anthony R. West 박사, Heinz Steiner 박사, Kuei Y. Tseng 박사의 지원과 멘토링에 감사드립니다.

모든 실험은 Ribeirão Preto의 철학, 과학 및 편지 학부 윤리위원회 (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5)에 따라 수행되었습니다.
1. 6-OHDA 병변
<ol><li>실험 시작 (6 주)에 체중이 200-250g 인 Sprague-Dawley 수컷 쥐를 사용하십시오. 표준 실험실 조건 (12:12 h 명암 주기, 06:00 h에 조명 켜짐, 온도 조절 시설 (22-24 ° C))에서 동물 (케이지 당 2-3 마리)을 수용하고 음식과 물을 자유롭게 사용할</em...

이 프로토콜은 MFB에서 6-OHDA의 일방적 미세주입에 의해 유도된 PD의 래트 모델에서 AIMs를 유도하고 분석하는 방법을 보여줍니다. 저용량의 L-DOPA (5mg / kg, 벤세 라지드 12.5mg / kg과 병용)를 매일 만성적으로 투여하면 치료 3 주 동안 AIM이 발생했습니다. 시간적 분석은 AIM의 현저한 증가를 나타냈으며, L-DOPA 투여 후 30분에서 90분 사이에 피크 용량 운동 이상증이 관찰됩니다. AIM은 축, 사지 및 구강 언어 ?...

도파민 전구체 L-3,4- 디 히드 록시 페닐알라닌 (L-DOPA)은 파킨슨 병 (PD)의 운동 증상에 가장 효과적인 치료법입니다 1. L-DOPA 요법은 PD와 관련된 운동 증상을 개선할 수 있지만 시간이 지남에 따라 효과가 떨어집니다. "마모 변동" 또는 "용량 종료 악화"와 같은 운동 변동은 단일 L-DOPA 용량의 효과 단축 기간으로 임상적으로나타납니다2. 다른 경우에는 임상 증상이 느린 비틀림 운동과 비정상적인 자세 (근긴장 이상)3 로 구성되며 도파민 수치가 낮을 때 발생합니다 (오프 기간 근긴장 이상)4. 반면에 L-DOPA 유발 운동 이상증 (LID)은 혈장과 뇌의 도파민 수치가 높을 때 나타납니다5.
LID는 무도병, 근긴장 이상 및 탄도6 운동과 같은 운동 합병증을 포함하는 쇠약해지는 부작용을 생성합니다. 일단 확립되면 LID는 모든 L-DOPA 투여 후에 발생합니다. 운동 합병증은 5 년 동안 L-DOPA 치료를받는 PD 환자의 40 % -50 %에서 발생하며 발병률은 수년에 걸쳐 증가합니다7. PD 환자에서 LID의 발달에 관여하는 병태생리학적 기전이 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 도파민성 탈신경화, 박동성 L-DOPA 투여, 선조체 단백질 및 유전자의 다운스트림 변화, 비도파민 전달 시스템의 이상은 이러한 원치 않는 부작용의 발생에 기여하는 인자이다 6,8,9,10.
신경독 6- 하이드 록시 도파민 (6-OHDA)은 설치류 11,12,13,14에서 PD를 연구하기위한 잘 특성화 된 도구입니다. 6-OHDA는 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않기 때문에 흑색 선조체 경로에 직접 주사해야합니다. 6-OHDA-유도된 도파민성 고갈은 농도- 및 부위-의존적이다15. 내측 전뇌 다발(MFB)에서 6-OHDA를 일방적으로 투여하면 설치류16,17,18,19에서 심각한(>90%) 흑색선체 손상이 발생할 수 있습니다. 중증 일방적 인 6-OHDA 병변 설치류에 L-DOPA를 만성적으로 투여하면 비정상적인 비자발적 운동 (AIM)이라고하는 운동 이상과 유사한 움직임이 나타납니다. 설치류에서의 운동 장애-유사 운동은PD 환자에서 LID와 관련된 유사한 분자적, 기능적 및 약리학적 메커니즘을 공유한다5. 따라서, 6-OHDA 병변 래트20 및 마우스21은 LID를 연구하기 위한 귀중한 전임상 모델이다. L-DOPA (5-20 mg / kg)의 치료 용량으로 만성적으로 (7-21 일) 치료했을 때, 일방적으로 6-OHDA 병변을 입은 쥐와 마우스는 병변과 반대쪽의 앞다리, 몸통 및 구강 안면 근육에 영향을 미치는 AIM의 점진적인 발달을 보여줍니다 17,18,19,20,22,23,24 . 이러한 움직임은 PD 환자25에서 L-DOPA 유도 피크 용량 운동 이상증과 유사한 시간 코스에서 나타나며과 운동 운동 및 근긴장 이상증을 특징으로합니다5. AIM은 일반적으로 심각도(예: 특정 AIM이 있는 경우)와 진폭(예: 각 움직임의 진폭으로 특징지어짐)5,23,25에 따라 점수가 매겨집니다.
LID의 6-OHDA 병변 설치류 모델은 얼굴 유효성을 나타냅니다 (즉, 모델은 인간 상태와 유사한 몇 가지 특성을 가짐) 5,11,26,27,28. PD 환자에서 발생하는 것과 유사한 설치류 AIM은 과운동(앞다리 및 구강설) 및 근긴장(축 방향) 운동29으로 간주되며 피크 선량 운동 이상증을 모방합니다. 분자 및 기능적 수준에서 설치류 모델은 FosB / ΔFosB 19,26,30,31,32,33 및 세로토닌 수송 체 (SERT) 34,35의 상향 조절과 같은 PD 환자 5와 많은 병리학 적 특성을 공유합니다. . 예측 타당성과 관련하여, PD 환자에서 LID를 감소시키는 약물 (예를 들어, N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체 길항제 아만타딘)은 설치류 모델 22,36,37,38,39에서 항이동성 효능을 나타낸다.
설치류 AIM 등급 척도는 머리, 목 및 몸통에 영향을 미치는 AIM(축 방향 AIM), 과운동 앞다리 움직임(사지 AIM) 및 운동성 유사 구강 언어 운동(구강 언어 AIM)을 포함하는 4가지 AIM 하위 유형을 기반으로 만들어졌습니다. 반대쪽 회전 (기관차 AIMs)이 일방적으로 병변 된 설치류 20,22,23,25,40에도 존재하지만, LIDS 22,37,41의 특정 측정을 나타내지 않을 수 있기 때문에 운동 장애와 같은 운동으로 점수가 매겨지지 않았습니다.
여기에서는 PD의 중증 (>90 %) 일방적 인 6-OHDA 병변 쥐 모델에서 운동 장애 유사 운동 (축 방향, 사지 및 구강 언어 AIMs)을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다. 우리는 이전 문헌과 실험실 전문 지식을 기반으로 프로토콜을 구성했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

L-DOPA 유발 운동 이상증 (LID)은 파킨슨 병 (PD) 환자에게 장기간 L-DOPA 투여로 인해 발생하는 운동 합병증을 나타냅니다. 클리닉에서 관찰되는 가장 흔한 패턴은 choreiform, 근긴장 이상 및 탄도 운동의 임상 증상으로 구성된 피크 용량 운동 이상증입니다. PD의 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 래트 모델은 LID의 여러 특성을 모방합니다. 반복적인 L-DOPA 투여 후, 6-OHDA-병변을 가진 랫트는 이운동성 유사 움직임(예를 들어, 비정상적인 비자발적 움직임, AIMs)을 나타낸다. 이 프로토콜은 흑색 선조체 경로에서 90%-95% 도파민 고갈을 보이는 6-OHDA 병변 쥐에서 AIM을 유도하고 분석하는 방법을 보여줍니다. L-DOPA (5 mg / kg, 벤세 라지드 12.5 mg / kg과 병용)의 반복 투여 (3 주)는 AIM 발생을 유도 할 수 있습니다. 시간 과정 분석은 30-90 분 (피크 용량 운동 이상증)에서 AIM의 상당한 증가를 보여줍니다. LID의 설치류 모델은 효과적인 항이동성 중재를 확인하는 중요한 전임상 도구입니다.

쥐에서 관찰된 AIMs 패턴은 인간 및 비인간 영장류에서 관찰된 패턴에 비해 더 간단하고 제한적이지만, 이 모델은 만성 L-DOPA 투여에 의해 유도된 과운동 및 근긴장유사 운동을 모두 재현합니다. 여기에서는 3 주 (월요일부터 금요일) 동안 L-DOPA (벤세 라지드 12.5mg / kg과 결합 된 5mg / kg)로 만성적으로 처리 된 일방적 인 6-OHDA 병변 쥐 그룹 (n = 10)에서 수집 한 데이터를 제시합니다. 그림 ...

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Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

L-DOPA 유발 운동 이상증의 설치류 모델은 L-DOPA의 반복 투여로 인해 나타나는 증상을 완화하거나 발달을 약화시키기위한 치료 적 개입을 식별하는 데 귀중한 도구입니다. 이 프로토콜은 파킨슨 병의 일방적 인 6-OHDA 병변 쥐 모델에서 운동 장애와 같은 움직임을 유도하고 분석하는 방법을 보여줍니다.

파킨슨 병의 일방적 인 6-OHDA 병변 쥐 모델에서 L-DOPA 유발 운동 이상증 평가

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

파킨슨병의 6-하이드록시도파민 래트 모델에서 L-DOPA 유도 운동이상증 등급은 효과적인 항이동성 중재를 확인하기 위한 중요한 전임상 도구입니다. 이 모델은 비교적 간단하고 비용이 저렴하며 클리닉에서 일어나는 일과 유사합니다. 이 절차는 실험실의 박사 과정 학생 인 Danilo Leandro Ribeiro가 시연합니다.무게가 200-250 그램 인 Sprague-Dawley 수컷 쥐로 실험을 시작하십시오. 표준 실험실 조건에서 케이지 당 2-3 마리의 동물을 수용하고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 수술 전에 노르에피네프린 수송체 억제제인 이미프라민을 쥐에게 복강 주사로 투여합니다.발가락 꼬집음에 대한 반응의 부족에 의한 마취를 확인한 후, 가열 패드 상단의 정위 장치에서 엎드린 위치에 쥐를 위치시킨다. 쥐가 위치하면 메스를 사용하여 미세 주사가 발생할 부위에 1cm 길이의 절개를합니다. 그런 다음 면봉으로 두개골 부위를 청소하고 브레그마와 람다가 노출되었는지 확인합니다.내측 전뇌 다발 또는 MFB, 브레그마에서 정위 좌표를 전방 4.3mm, 오른쪽 측면 1.6mm, 경도계에서 복부 8.3mm에서 취하십시오. 좌표가 결정되면 6- 하이드 록시 도파민 또는 6- OHDA를 50 마이크로 리터 해밀턴 유리 주사기로 오른쪽 MFB에 분당 0.4 마이크로 리터의 속도로 일방적으로 투여합니다. 수술이 끝나면 두피 절개를 봉합하고 따뜻하고 멸균 된 0.9 % 식염수로 동물을 킬로그램 당 10 밀리리터의 용량으로 피하 재수 화합니다.정위 프레임에서 동물을 제거하고 따뜻한 회복 케이지에 넣고 의식을 회복 할 때까지 모니터링하십시오. 병변 후 4 주에, 병변에 반대하는 앞다리의 무 운동증을 평가함으로써 스테핑 테스트를 사용하여 도파민 성 병변의 효과를 측정하십시오. 반대쪽 앞다리와 함께 3 개 이하의 조정 단계를 나타내는 쥐는 추정되는 심각한 6-OHDA 병변 쥐로 연구에 포함되어야합니다.6-OHDA 병변 4 주 후 월요일에 만성 치료를 시작하고 수요일에 비정상적인 비자발적 움직임을 기록합니다. 이렇게하려면 쥐를 직경 20cm, 높이 40cm의 투명한 실린더 안에 넣고 최소 15 분 동안 순응하도록하십시오. 바닥이 침구 재료로 덮여 있고 가능한 모든 각도에서 동물을 관찰 할 수 있도록 거울이 실린더 뒤에 있는지 확인하십시오.고해상도 비디오 카메라를 배치하여 축, 사지 및 구강 언어의 비정상적인 비자발적 움직임을 볼 수 있습니다. 실린더 뒤의 거울을 사용하면 비정상적인 비자발적 움직임을 360도 각도로 추적 할 수 있습니다. 카메라는 동물로부터 15도 각도로 비행기 약간 아래에 위치하여 구강 언어의 비정상적인 비자발적 움직임을 관찰 할 수 있습니다.위치가 결정되면 카메라를 벤치에 직접 고정하십시오. 동물이 15 분 동안 순응하면 실린더에서 동물을 제거하고 새로 준비된 L- 도파민 또는 L-DOPA를 킬로그램 당 5 밀리그램과 벤세 라지드 킬로그램 당 12.5 밀리그램을 피하 투여합니다. 동물을 실린더에 다시 넣고 비정상적인 비자발적 움직임을 추적하는 타이머를 시작하십시오.비디오 카메라를 사용하여 주사 후 180분 동안 30분 간격으로 비정상적인 비자발적 움직임을 기록하여 오프라인 채점을 수행합니다. 6 개의 관찰 기간이 지나면 점수는 1-2 분 에포크에 걸쳐 주어져야하며 축 방향, 사지 또는 구강 언어로 분류되어야합니다. 정상적인 동작을 포함하지 않도록 합니다.L-DOPA 및 벤세라자이드 치료는 월요일부터 금요일까지 하루에 한 번 3주 동안 계속되어야 합니다. 대표적인 시간 경과 분석에서, 만성 L-DOPA 투여 3주 동안 축, 사지 및 구강 언어의 비정상적인 비자발적 움직임에 적용된 점수가 표시됩니다. L-DOPA 유도 피크 용량 운동 이상증은 30 분에서 90 분 사이에 발생하며 주사 후 120 분 후에 점진적으로 감소하는 것으로 나타났습니다.또한, 축, 사지 및 구강 언어의 비정상적인 비자발적 움직임의 합계가 개인에게 제시되었으며, 만성 L-DOPA 투여 3 주 동안 일 및 매주 점수를 매겼습니다. 비정상적인 비자발적 운동 프로토콜은 일반적으로 항이동성 번역 잠재력을 가진 새로운 치료 도구의 조사를 위한 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

올 Isacson : 파킨슨병을위한 새로운 요법 개발

연구

생물학

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

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Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

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Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

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