Name: primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، ماريلاند ، الولايات المتحدة (KP) K08EY0123998 ، (KP) R01EY030431 ، (KP) R21 EY02939 ، منحة UW Vision Research الأساسية (NEI P30EY01730) ، هدايا من Mark Daily ، صندوق أبحاث MD وصندوق أبحاث كريستوفر وأليدا لاثام ، منحة إدارية غير مقيدة من Research to Prevent Blindness ، وجائزة التطوير الوظيفي من Research to Prevent Blindness (KP). تم دعم العمل الذي تم إجراؤه في بريستول بتمويل إضافي من Sight Research UK و The Underwood Trust.

ليس لدى المؤلفين أي نزاعات مالية للكشف عنها.

لعبت النماذج الحيوانية لالتهاب العنبية دورا أساسيا في فهم آليات التهاب العين والتوازن بالإضافة إلى تمكين التقييم قبل السريري للعلاجات الطبية والجراحية لمرضى التهاب العنبية37. أثبتت كل من متغيرات الأرانب والجرذان لنموذج PMU قيمتها في العلاج قبل السريري من خلال إثبات دراسات المفهوم38،39،40. نظرا لتوافر مجموعة متنوعة من السلالات المعدلة وراثيا في الفئران ، فإن إنشاء نظام نموذج PMU للفأر يسمح الآن بإجراء دراسات ميكانيكية أكثر تفصيلا لتحديد أنواع معينة من الخلايا والمسارات والجينات التي تساهم في أمراض هذا المرض.
يمكن أن تظهر النماذج الحيوانية لالتهاب العنبية التباين من إلى في حدوث الالتهابوشدته 41. في سلالة الماوس C57BL / 6 ، يتم إنشاء PMU بشكل موثوق باستخدام البروتوكول الموضح هنا. تم الإبلاغ عن اختلافات خاصة بالسلالة في مسار التهاب القزحية وشدته لكل من EAU و EIU42,43. في حين أن التأثيرات الخاصة بالسلالة على شدة ومسار PMU لم يتم قياسها تجريبيا ، فقد تم استخدام هذا النموذج في النوع البري C57BL / 6J وكذلك في الفئران البيضاء (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) وأنتج استجابات التهابية مماثلة. عند إنشاء نموذج PMU، يمكن أن يساعد التحكم في الاعتبارات المذكورة أدناه الباحثين الجدد على الحد من التباين وإنتاج التهاب العنبية الأكثر اتساقا وقابلية للتكرار.
ضمان الاتساق في الحقن تحت الجلد: لتوفير حقن متسق تحت الجلد ، تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء من المستحلب. تشمل الاعتبارات جهاز طرد مركزي قصير (30 ثانية عند 400 × جم) من المستحلب الجاهز قبل تحميل المحقنة. سيؤدي ذلك إلى إزالة الهواء المحبوس في المستحلب. أيضا ، عند تحميل المحقنة ، قم بعكس (تلميح) بشكل دوري واضغط على المحقنة لإزالة أي فقاعات هواء. أثناء الحقن ، لا تضع المحقنة عميقا جدا لتجنب الحقن العضلي. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي الحقن الضحل (داخل الأدمة) إلى تآكل المستحلب عبر الجلد. تذكر أن تتوقف لفترة وجيزة قبل إزالة المحقنة من موقع الحقن لضمان الحقن الكامل للمستحلب اللزج السميك ولمنع الارتجاع من الجلد.
بعد سبعة أيام من وضع الحقن تحت الجلد ، تأكد من وجود عقيدات واضحة على جانبي الساقين الخلفيتين. إذا لم يتم تحديد العقيدات ، فمن الممكن أن يكون الهواء قد تم حقنه بدلا من المستحلب. في هذه الحالة ، قد لا يكون الالتهاب الحاد قويا ، وقد لا يتطور الالتهاب المزمن.
منع تطور التهاب باطن المقلة المعدية: سوف يولد التهاب باطن المقلة البكتيري أو الفطري متغيرا مربكا إذا لم يتم منعه44. من أجل منع التهاب باطن المقلة الجرثومي ، مارس دائما تقنية معقمة جيدة عند إجراء التعليق داخل الجسم الزجاجي ، والتعامل ، وتنظيف جميع الأدوات القابلة لإعادة الاستخدام التي ستتلامس مع العين. من المهم استخدام العناصر المعقمة ذات الاستخدام الواحد أو التعقيم أو التنظيف باستخدام 95٪ من الغسول أو المناديل الكحولية. الاستخدام المناسب للبيتادين المطبق على سطح العين والأغطية والفراء حول العين سيساعد أيضا في منع التهاب باطن المقلة45. من السهل التعرف على العين المصابة بالعدوى حيث سيتم طمس هياكل العين بسبب الالتهاب الشديد أثناء دورة ما بعد الحقن. هذا ليس نموذجيا لجامعة الأمير محمد بن فهد. يمكن أن يشير وجود نزيف داخل العين أيضا إلى التهاب باطن المقلة أو صدمة من الحقن. في مثل هذه الحالات ، استبعد هذه الحيوانات من الدراسة.
ضمان الاتساق في الحقن داخل الجسم الزجاجي: يعد الحقن داخل الجسم الزجاجي خطوة حاسمة في تحريض الالتهاب الموثوق به والقابل للتكرار في PMU. إن توفير كمية ثابتة من تعليق Mtb مع كل حقنة ، وتجنب الصدمات ، ومنع ارتداد التعليق كلها عوامل يجب مراعاتها عند إجراء الحقن. لضمان تعليق ثابت ، قم بتدوير تعليق المخزون جيدا عند الذوبان وقبل تحميله في المحقنة. نظرا لأن مستخلص Mtb المستخدم لا يشكل حلا ، يمكن أن يخضع التعليق للترسيب بمرور الوقت. لضمان تركيز موحد لمستخلص Mtb في كل حقنة ، استخدم أو طرد وإعادة تحميل المحقنة في غضون 15 دقيقة من التحميل. يستخدم فينيليفرين للتوسع لتوفير مجال رؤية أكبر للعين الخلفية وتقليل خطر حدوث صدمة للعين أثناء الحقن. يولد هذا الانخفاض تراجعا طبيعيا للغطاء وبروبتوزا طفيفا للكرة الأرضية ، مما يسمح بتصور جيد للمنطقة الخلفية 1-2 مم إلى الحافة دون الحاجة إلى إمساك العين بالملقط. يمكن أن يؤدي استخدام الملقط لتقييد العين إلى حدوث صدمة محتملة وزيادة ضغط العين بشكل عابر وخطر ارتجاع تعليق MTB. يمكن أن تحدث الصدمة أيضا بسبب محاولة حقن الكثير من الحجم في العين. يقتصر حجم الحقن على 2 ميكرولتر لمنع الارتفاع الكبير والمطول لضغط العين والصدمات في العين. بالإضافة إلى ذلك ، سيكون للحيوانات الأصغر سنا عيون أصغر من الفئران البالغة. عادة ما توفر الفئران التي تتراوح مدتها بين 6 و 8 أسابيع (20-25 جم) حجما موحدا للعين وتضمن اتساقا أكبر في الالتهاب بعد حقن MTB. لوحظ تواتر أعلى من ارتداد ما بعد الحقن من تعليق المتفطرات في الفئران الأصغر. وهذا بدوره يؤدي إلى التهاب حاد أقل من المتوقع. يتم استخدام محلول الفلوريسئين المخفف لتزويد الحاقن المبتدئ بملاحظات بصرية حول نجاح تقنية الحقن الخاصة بهم. سيسمح التمدد في وقت الحقن بالتصور المباشر للمادة المحقونة في التجويف الزجاجي وفرصة ملاحظة أي دليل على صدمة العدسة. في حالة صدمة العدسة ، يمكن أن يتسبب ذلك في تغيير وضوح العدسة الذي سيؤدي إلى إعتام عدسة العين الذي يمكن تصوره في OCT. في حالة صدمة العين ، يجب استبعاد العينين من الدراسة بسبب احتمال الإصابة بالتهاب القزحية46 الناجم عن العدسة. نوصي بالتوقف لمدة 10 ثوان قبل إزالة المحقنة من العين للسماح بتشتت تعليق Mtb داخل العين وتقليل الارتجاع.
يمكن تعديل نموذج PMU لتغيير شدة الالتهاب الحاد عن طريق تغيير تركيز Mtb في الحقن داخل الجسم الزجاجي. تم اختبار جرعات مختلفة تتراوح من 2.5 ميكروغرام / ميكرولتر إلى 15 ميكروغرام / ميكرولتر سابقا في مختبرنا. ومع ذلك ، تم العثور على جرعات أعلى من 10 ميكروغرام / ميكرولتر تسبب تلفا شديدا للعين ، بما في ذلك تمزق العدسة التلقائي ، وذمة القرنية الشديدة والتندب ، و hyphema. هذه الدرجة من الشدة ليست نموذجية في المرضى الذين يعانون من التهاب القزحية بعد العدوى ، وبالتالي ، لا ينصح بهذه التركيزات. تم العثور على جرعة 5 ميكروغرام / ميكرولتر لإنتاج التهاب حاد خفيف إلى معتدل والتهاب العنبية المزمن الخفيف. تنتج جرعة 10 ميكروغرام / ميكرولتر مرضا حادا معتدلا إلى شديدا ومرضا مزمنا أكثر بروزا. وبالتالي ، فإن تغيير التركيز داخل الجسم الزجاجي يمكن أن يوفر شدة مرض بديلة للاستخدام حسب الحاجة بناء على السؤال التجريبي. يجب اختيار الضوابط للتأكد من أن النتائج ناتجة عن الاستجابة ل mTB وليس الصدمة المرتبطة بالحقن تحت الجلد أو داخل الجسم الزجاجي. في ضوابط الحقن الوهمية ، يمكن استخدام PBS بدلا من مستخلص mTB. بالنسبة للمقارنات مع الحيوانات غير المعرضة ، يجب اعتبار العينات الساذجة الحقيقية لأن عيون الزملاء ليست متكافئة دائما.
نظرا لصغر حجم عين الفأر ، يمكن أن يكون OCT مقايسة أكثر حساسية للكشف عن الالتهاب في الغرفة الأمامية من التصور المباشر أو التصوير المجهري للمجال الساطع. حدد العمل السابق مع PMU في الفئران25 أنه يمكن اكتشاف المزيد من الخلايا عن طريق الأنسجة أكثر من OCT ولكن هناك علاقة جيدة بين الطريقتين. OCT لديه ميزة إضافية أنه يمكن استخدامه لمراقبة الالتهاب طوليا في نفس الحيوان. كما استخدمت نماذج الفئران الرئيسية الأخرى لالتهاب القزحية ، مثل EAU و EIU ، OCT للتحليل الكمي12،47،48. في نموذج PMU للفئران ، تكون خلايا الغرفة الأمامية مرئية فقط في OCT ولا يمكن رؤيتها في الاختبارات السريرية ما لم يكن هناك نقص كبير في البويون. يمكن ملاحظة الالتهاب الزجاجي (التهاب الزجاجية الزجاجي) من خلال تصوير قاع العين الملون ، ولكن لا يمكن اكتشاف التغير الكمي إلا من خلال التصوير المقطعي المحوسب. يمكن التعرف بسهولة على الجوانب الأخرى للنموذج ، مثل التهاب الأوعية الدموية في شبكية العين وتلف الشبكية ، إما من خلال التصوير المقطعي المحوسب والتصوير المجهري لقاع العين الساطع.
عند استخدام OCT ، من المهم التفكير في كيفية تأثر التصوير الموضعي بالاختلافات الإقليمية في درجة الالتهاب. حددت التقارير السابقة توزيعا غير متساو للخلايا في الغرفة الأمامية للبشر ، مع وجود المزيد من الخلايا بشكل أقل شأنا49. في الفئران ، استعداد مماثل أمر شائع. وبالتالي ، فإن المسح الرأسي أو الشعاعي من خلال التيار المتردد سيساعد في ضمان الصور التي تلتقط نطاق الالتهاب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إجراء التصوير في نفس المكان سيوفر أيضا اتساقا للصور التي تم جمعها في نفس العين طوليا. للحصول على صور في نفس الجزء من العين ، استخدم معالم مستقرة ونهج منهجي. بالنسبة لصور الغرفة الأمامية ، يتم توسيط الصورة مباشرة بجوار قمة القرنية وتوجيهها عموديا بحيث يمكن اكتشاف وجود hypopyon في الزاوية السفلية. بالنسبة لصور المقطع الخلفي ، تتمركز الصورة على العصب البصري. يوصى بالتفكير في استخدام 3 عمليات مسح على الأقل للتسجيل لضمان التقاط التباين الإقليمي. في الحالات التي يقتصر فيها الالتهاب على المواقع الطرفية ، يمكن أن يكون الحصول على فحوصات الحجم مفيدا. يمكن أن تساعد مجموعة عمليات فحص الحجم أيضا في التقاط الاختلافات الإقليمية ولكنها ستزيد من متطلبات تخزين البيانات.
تشمل المقايسات الأخرى في الجسم الحي التي يمكن استخدامها لتوصيف الالتهاب في نموذج الماوس PMU التصوير الحيوي13,35. يمكن إجراء فحوصات ما بعد الوفاة مثل تحليل قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات لتحديد وقياس مجموعات الخلايا المناعية المتسللة في الغرفة المائية والخلفية للعين12,26. في نموذج PMU ، يتميز الالتهاب الحاد باستجابة فطرية مع تسلل العدلات السائد ، يليه استجابة مهيمنة للخلايا التائية التكيفية المزمنة والمستمرة والتي تستمر لأكثر من شهر35. تشمل المقايسات الأخرى لوظيفة المناعة التي يمكن إجراؤها على أنسجة ما بعد الوفاة تحليل السيتوكين السائل العيني. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام فحوصات أخرى في اتجاه مجرى النهر مثل تسلسل mRNA والتصوير المناعي لتقييم أنماط التعبير الجيني والبروتيني لمجموعات الخلايا المناعية في شبكية العين في التهاب القزحية50,51.
يمكن تكرار نموذج PMU في أنظمة القوارض الأخرى باستخدام التعديلات المناسبة للأنواع المختلفة. تم استخدام نموذج PMU سابقا في الفئران والأرانب38،39،40. في الفئران ، يتطور التهاب العنبية الحاد بعد الحقن داخل الجسم الزجاجي الذي يزول تلقائيا على مدار 14 يوما دون ظهور علامات التهاب مزمن بواسطة علم الأنسجة24. في الأرانب، يستخدم تحريض التهاب العنبية جولتين من الحقن تحت الجلد قبل الحقن داخل الجسم الزجاجي ولكنه يولد أيضا التهاب العنبية القوي. تتمثل إحدى مزايا استخدام نموذج الماوس في التوافر السهل للعديد من السلالات المعدلة وراثيا والضربة القاضية التي يمكن أن تساعد في فهم الآلية الأساسية لالتهاب القزحية52. يمكن استخدام جميع نماذج القوارض لاختبار العلاج قبل السريري إذا تم إعطاء العامل بشكل منهجي أو كقطرة موضعية. ومع ذلك ، نظرا لحجمها الأكبر ، تعد عيون الفئران والأرانب نماذج أفضل للاستخدام في الدراسات قبل السريرية لخيارات العلاج بالحقن القابلة للزرع أو المحلية لالتهاب القزحية.
باختصار ، يوفر هذا البروتوكول للباحثين المهتمين بدراسة آليات التهاب العين المزمن أداة جديدة لا تعتمد على التحصين المسبق بمستضدات العين.

يصف مصطلح "التهاب العنبية" مجموعة غير متجانسة من الحالات التي تتميز جميعها بالتهاب داخل العين1. تعد النماذج الحيوانية لالتهاب العنبية مهمة لفهم آليات المرض وللاختبار قبل السريري للعلاجات الجديدة. تم إنشاء عدد من النماذج الحيوانية لالتهاب القزحية2. الاثنان اللذان تمت دراستهما على نطاق واسع هما التهاب القزحية المناعي الذاتي التجريبي (أو التهاب الشبكية الدهنية. EAU) والتهاب القزحية الناجم عن السموم الداخلية (EIU). عادة ما يتم إنشاء EAU عن طريق التحصين بمستضدات العين أو يمكن أن يحدث تلقائيا عندما يتعطل التسامح المركزي في غياب جين AIRE 3,4. ومنذ ذلك الحين تم تطوير متغيرات أخرى من النموذج5،6،7 لتشمل الببتيدات العنبية المختلفة. تمت مراجعتها على نطاق واسع8،9،10. EAU هو النموذج الأساسي لأشكال التهاب العنبية المناعي الذاتي المعتمد على الخلايا التائية مثل مرض Vogt-Koyanagi-Harada والتهاب مشيمية الطيور في البشر. يتم إنشاء EIU عن طريق الحقن الجهازي أو المحلي لعديد السكاريد الدهني البكتيري (LPS)10,11. تم استخدام EIU كنموذج لالتهاب العنبية الحاد الناتج عن تنشيط مسارات الإشارات المناعية الفطرية12. كان كلا النموذجين فعالين في الفهم الحالي لمناعة العين، ولكن لا يعد أي منهما نموذجين فعالين لالتهاب العنبية المزمن بعد العدوى. يوفر نموذج التهاب القزحية الفطري (PMU) ، الذي تم إنشاؤه مؤخرا في الفئران ، نهجا لاستجواب وتقييم الجوانب السريرية والخلوية لهذا النوع من التهاب القزحية13.
هناك انتشار مرتفع للعدوى الفطرية في جميع أنحاء العالم ، مع أكثر من 10 ملايين حالة جديدة وأكثر من 1.4 مليون حالة وفاة أبلغت عنها منظمة الصحة العالمية في عام 201914. يشمل المظهر خارج الرئة لعدوى السل النشط (TB) التهاب القزحية وهو سبب معترف به جيدا لالتهاب القزحية المعدي15,16. مظاهر التهاب القزحية المرتبط بالسل هي البروتيان ، والتي من المحتمل أن تعكس آليات متميزة متعددة للمرض لتشمل عدوى العين المباشرة بالإضافة إلى التهاب المناعة الأقل فهما17،18،19. تشمل الآليات المقترحة لهذه العواقب اللاحقة للعدوى استجابة التهابية مزمنة يحفزها استمرار عدوى عصوية في ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) ، واستجابة التهابية مزمنة يحفزها وجود أنماط جزيئية متبقية مرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) من عدوى العين التي تم تطهيرها بنجاح ، والتنشيط غير المناسب للاستجابة المناعية التكيفية ضد مستضدات العين من خلال عملية التقليد الجزيئي أو المستضد. الانتشار الناجم عن عدوى السل الجهازية20،21،22،23.
من أجل الحصول على فهم ميكانيكي أفضل لالتهاب القزحية المزمن بعد العدوى ودراسة دور المستضدات الفطرية في بدء المرض ، تم تطوير نموذج PMU للاستخدام في الفئران13,24. وفقا لذلك ، لاستنباط الالتهاب ، يتلقى الفأر أولا حقنة تحت الجلد من مستضد من سلالة المتفطرة السلية H37Ra المقتولة بالحرارة لتقليد العدوى الجهازية ، تليها بعد سبعة أيام الحقن داخل الجسم الزجاجي لنفس المستضد الذي يتم إعطاؤه للعين اليسرى أو اليمنى لتقليد عدوى العين المحلية. تتم مراقبة شدة ومدة التهاب القزحية التالي عن طريق التصوير المقطعي الطولي للتماسك البصري في الجسم الحي (OCT) والتصوير القاعي للعين25. تتميز PMU بالتهاب العنبية الحاد المهيمن على النخاع والذي يتطور إلى التهاب العنبية الخلفي المزمن المهيمن على الخلايا التائية مع التهاب الزجاجية والتهاب الشبكية حول الأوعية الدموية والمناطق البؤرية لتلف الشبكية الخارجية26. يشير وجود التهاب حبيبي في الجزء الخلفي من العين إلى أنه يمكن استخدام نموذج PMU لدراسة بعض أشكال التهاب القزحية الأمامي (الحبيبي وغير الحبيبي) والتهاب القزحية المتوسط ، الذي يظهر في المرضى الذين يعانون من أدلة مناعية على عدوى Mtb السابقة27. بالإضافة إلى ذلك ، تم اقتراح مكونات Mtb المقتولة بالحرارة المستخدمة في نموذج PMU لتحفيز الاستجابات المناعية الكامنة وراء جوانب التهاب القزحية المتكرر في المرضى الذين يعانون من مرض السل العيني الذين يستجيبون للعلاج المضاد للسل (ATT)28. نظرا للاختلافات في بدء المرض ومسار الالتهاب عند مقارنته ب EAU و EIU ، تمثل PMU نموذجا حيوانيا جديدا لالتهاب القزحية لا يعتمد على التحصين بمستضدات العين وقد يساعد في توضيح آليات المرض لدى المرضى الذين يعانون من التهاب القزحية المزمن. يحدد هذا البروتوكول طرق توليد PMU ، ومراقبة المسار السريري للالتهابات ، وجمع عينات العين لتحليل ما بعد الوفاة مع قياس التدفق الخلوي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-FLUOR</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed</td>
			<td>Akorn Animal Health, IL, USA</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Xylazine 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>8007-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide Needles -25 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide needle -30-G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond MAX, Bond Rx</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol ointment</td>
			<td>Martindale Pharma, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>1% w/w Chloramphenicol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG1150H</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2300</td>
			<td>Bioptigen/Leica</td>
			<td></td>
			<td>OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Incomplete Adjuvant</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>263910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye ointment</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra lyophilized Mycobacteria extract</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton RN Needle (33/12/2)S</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>7803-05(33/12/2)</td>
			<td>33 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>CAL7633-01</td>
			<td>5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td>Exel International, USA</td>
			<td>26029</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset</td>
			<td>Zoetis, USA</td>
			<td>377341</td>
			<td>Ketamine HCL 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA</td>
			<td></td>
			<td>Alternative Imaging/OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil 10 &#181;L syringe</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Intraocular Injection Kit</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>IO-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissection scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td>17478020115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>309602</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine 0.5%</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>1041544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek VIP series</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc.,CA.</td>
			<td></td>
			<td>Histology Tissue Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1%</td>
			<td>Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>Minims</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tylenol</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc, PA, USA</td>
			<td>NDC 50580-614-01</td>
			<td>Acetaminophen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK</td>
			<td></td>
			<td>Carbomer eye gel 0.2% w/w</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis

يصف مصطلح "التهاب العنبية" مجموعة غير متجانسة من الحالات التي تتميز جميعها بالتهاب داخل العين. على نطاق واسع ، يتم تعريف التهاب القزحية من خلال المسببات: العدوى أو المناعة الذاتية. يتطلب التهاب العنبية المعدي العلاج بالعوامل المضادة للميكروبات المناسبة، بينما يتطلب التهاب العنبية المناعي الذاتي العلاج بالكورتيكوستيرويدات أو غيرها من العوامل المثبطة للمناعة. التهاب العنبية التالي للعدوى هو شكل من أشكال التهاب العنبية المزمن الذي يتطلب الكورتيكوستيرويدات للسيطرة على عقابيل المناعة بعد العدوى الأولية. التهاب القزحية المرتبط بعدوى المتفطرة السلية (Mtb) هو شكل معترف به جيدا من التهاب القزحية بعد العدوى ، لكن آليات المرض ليست مفهومة تماما. لفهم الدور الذي تلعبه المستضدات الفطرية والروابط الفطرية في تحفيز التهاب العين المزمن بعد الإصابة بالسل ، تم تطوير نموذج التهاب القزحية المتفطر (PMU) للاستخدام في الفئران. توضح هذه المخطوطة طرق توليد PMU ومراقبة المسار السريري للالتهاب باستخدام قاع العين الملون والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). يتم تحفيز PMU عن طريق التحصين بمستخلص المتفطرات المقتولة بالحرارة متبوعا بالحقن داخل الجسم الزجاجي لنفس المستخلص في عين واحدة بعد سبعة أيام. تتم مراقبة التهاب العين طوليا باستخدام التصوير في الجسم الحي ويتبعه جمع العينات لمجموعة واسعة من المقايسات ، بما في ذلك الأنسجة ، وقياس التدفق الخلوي ، وتحليل السيتوكين ، و qPCR ، أو تسلسل mRNA. يعد نموذج الماوس الخاص ب PMU أداة جديدة مفيدة لدراسة استجابات العين ل mTB ، وآلية التهاب القزحية المزمن ، ولاختبارات الفعالية قبل السريرية للعلاجات الجديدة المضادة للالتهابات.

Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis

يحدد هذا البروتوكول خطوات إحداث التهاب القزحية المتفطر (PMU) في الفئران. تحدد هذه الطريقة الخطوات للمساعدة في إنتاج التهاب عين موثوق وقوي في نظام نموذج الماوس. باستخدام هذا البروتوكول ، قمنا بتوليد عيون UVEITIC وعيون زميلة غير ملتهبة من مفردة لمزيد من التقييم باستخدام المقايسات المناعية والنسخية والبروتينية.

التهاب العنبية المتفطر (PMU) كنموذج لالتهاب العنبية بعد العدوى

The term 'uveitis' describes a heterogeneous set of conditions that all feature intraocular inflammation. Broadly, uveitis is defined by etiology:  ...

يحدد هذا البروتوكول خطوات إحداث التهاب عيني موثوق وقوي باستخدام المتفطرات المقتولة بالحرارة في نموذج الفأر. يمكن أن يساعد نموذج التهاب العنبية المتفطر هذا في دراسة آليات التهاب العين المناعي المزمن الذي يتطور بعد عدوى المتفطرات. لا يتطلب هذا النموذج من التهاب القزحية المزمن استخدام سلالات معينة من الفئران أو التحصين باستخدام مستضدات العين.يسهل هذا النموذج استخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا والجينية في الدراسات الميكانيكية للتسبب في التهاب العين. سيكون نموذج PMU هذا مفيدا في الدراسات التي تختبر علاجات جديدة لالتهاب العين أو التهاب القزحية لدى البشر. يمكن اختبار العلاجات مثل قطرات العين الجديدة أو عوامل تعديل المناعة التي يتم إعطاؤها بشكل منهجي للتأكد من فعاليتها مع هذا النموذج.سيسهل هذا النموذج دراسة كيفية تغيير مستضدات البكتيريا الفطرية المقتولة بالحرارة للبيئة المكروية لعضو مناعي متميز مثل العين. يمكن أن توفر هذه النتائج أيضا رؤى حول كيفية تأثير أنواع أخرى من عدوى العين على العين أو كيفية استجابة المواقع المناعية المتميزة ، مثل الدماغ ، لمستضدات البكتيريا الدقيقة. للبدء ، قم بفك جسم وحدة محول Sonicator وتنظيف المسبار بمسحة كحول بنسبة 70٪.ثم قم بتشغيل Sonicator واضبط إعداد الطاقة على أربعة عن طريق تدوير مقبض التحكم في الطاقة. بعد ذلك ، لتوليد تعليق دقيق للبكتيريا السلية H37Ra في برنامج تلفزيوني ، اغمر طرف المسبار في مسحوق البكتيريا الدقيقة المحتوي على PBS. قم بتسخين الخليط على الثلج لمدة 30 ثانية ، ثم توقف لمدة 30 ثانية وكرر لمدة خمس دقائق لتفريق المسحوق بالكامل في تعليق متساو دون تسخين السائل.بعد ذلك ، أضف 2.5 ملليلتر من مساعد Freund's Incomplete إلى الخليط ، وكرر عملية الصوتنة على الثلج حتى يشكل المستحلب تناسقا يشبه معجون الأسنان. للحقن تحت الجلد ، قم بتحميل 200 إلى 300 ميكرولتر من مستحلب البكتيريا الدقيقة في حقنة ملليلتر واحد. اطرد الهواء من المحقنة واستمر في ملء المحقنة بقلب متقطع والنقر حتى تمتلئ.بعد ذلك ، ضع الحقن تحت الجلد إما على السطح الظهري للوركين أو على السطح البطني للساقين القريب من منطقة الغدد الليمفاوية الأربية لفأر C57 الأسود 6J المخدر من 6 إلى 10 أسابيع. أدخل الإبرة بعناية ، مع الحرص على عدم اختراق العضلات ، وحقن 50 ميكرولتر من المستحلب في الفضاء تحت الجلد. لا تقم بإزالة الإبرة على الفور للسماح بحقن المستحلب السميك بالكامل.لتحضير مخزون المستضد للحقن داخل الجسم الزجاجي ، قم بصوتنة H37Ra في محلول PBS كما هو موضح سابقا ، ثم قم بتقسيم المحلول في أحجام 100 ميكرولتر وتخزينه عند 20 درجة مئوية. في يوم الحقن ، بعد التأكد من عمق التخدير العام ، قم بتخدير القرنية بقطرة واحدة من 0.5٪ من التتراكائين وتوسيع التلميذ بقطرة واحدة من 2.5٪ فينيليفرين. بعد التخلص من السوائل الزائدة ، أضف قطرة واحدة من 5٪ Betadine على سطح العين والشعر المحيط لتقليل خطر الإصابة بالتهاب باطن المقلة .بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، قم بإزالة Betadine وقم بتغطية العين بجل هيدروكسي بروبيل ميثيل ميثيل ملون بنسبة 0.3٪ لمنع الجفاف تحت التخدير وتشكيل إعتام عدسة العين. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة سعة 10 ميكرولتر بمزيج المستضد والفلوريسئين ، ثم ضع الماوس في وضع الانبطاح على المنصة واستخدم قضبان الأذن اليمنى واليسرى لإصلاح رأس الماوس. ضع الماوس ووجهه تحت المنظار بحيث يكون الجانب الأنفي العلوي للعين اليمنى مرئيا.ثم ، باستخدام إبرة قياس 30 ، قم بإزاحة الرموش ، وكشف الصلبة ، وتصور الحافة والأوعية الدموية الكعبرية. بعد ذلك ، باستخدام إبرة قياس 30 معقمة ، قم بعمل ثقب توجيه في الصلبة من واحد إلى ملليمترين خلف الليمبوس. بعد ذلك ، أدخل إبرة القياس 34 المرفقة بحامل الحقن في العين ، من خلال فتحة التوجيه ، بزاوية تتجنب العدسة ، ولكن ضع طرف الإبرة في التجويف الزجاجي.باستخدام وحدة تحكم مضخة حقنة صغيرة ، قم بحقن ميكرولتر واحد بعناية من مستخلص M.tuberculosis في التجويف الزجاجي. في حالة الارتجاع المستمر ، قم بزيادة حجم الحقن إلى 1.5 ميكرولتر لضمان توصيل الجرعة الكافية. تأكد من وضع الجسم الزجاجي عن طريق تصور منعكس أخضر في العين ، وبعد 10 ثوان ، قم بإزالة الإبرة من العين.بعد تخدير الفأر ، قم بتوسيع التلميذ بقطرة واحدة من 2.5٪ فينيليفرين ، وتجنب القطرات الزائدة التي تدخل الأنف أو الفم. بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، انزع السائل الزائد وقم بتغطية العين بجل هيدروكسي بروبيل ميثيل سيلوز بنسبة 0.3٪. بعد ذلك ، لف الماوس في طبقة من الشاش الجراحي للحفاظ على دفء الجسم ، ثم ضع الماوس على كاسيت الحيوان وضع الرأس مع شريط العض.للحصول على التصوير المقطعي للتماسك البصري أو صور OCT ، قم بتشغيل نظام التصوير OCT وافتح برنامج التصوير. بالنسبة لتصوير الغرفة الخلفية ، اجعل OCT قريبا من سطح العين ، مع الحرص على عدم ملامسة سطح العدسة للعين. بمجرد وضع العين بشكل صحيح ، أوقف الفحص السريع ، وحدد بروتوكول مسح وحدة التخزين ، وقم بتنشيط الفحص باستخدام خيار الهدف.بالنسبة لصور المقطع الخلفي، اضبط حتى يتمركز العصب البصري في صورة محاذاة المسح الأفقي B ، ويتم محاذاة شبكية العين مع محور المحاذاة الرأسية. بالنسبة لصور المقطع الأمامي، اضبط الموضع لتوسيط قمة القرنية في كل من صورة محاذاة المسح B الأفقية وصورة محاذاة المسح B العمودية. أخيرا ، انقر فوق لقطة لالتقاط صورة مسح وحدة التخزين ، ثم انقر فوق حفظ.بعد 24 ساعة من الحقن داخل الجسم الزجاجي ، تظهر الخلايا الالتهابية في الماء والزجاج. تظهر وذمة القرنية ، ونقص ضغط الدم ، والعديد من الخلايا الالتهابية العائمة في الغرفة الأمامية ، والتهاب الجسم الزجاجي في الغرفة الخلفية. يمكن تسجيل درجة التهاب العين على صور OCT هذه.تمثل الدرجات المجمعة الأكبر من الصفر ولكن أقل من 2.5 التهابا خفيفا. درجات أكبر من 2.5 ، ولكن أقل من 4.5. تمثل التهابا معتدلا ، وعشرات أكبر من 4.5 تحدد الالتهاب الشديد.يمكن أيضا تحديد درجات الالتهاب باستخدام خمس خصائص مرئية في أقسام بقع الهيماتوكسيلين والإيوزين. يتم تحديد درجة الخطورة عن طريق حساب عدد الخلايا الالتهابية في الماء والزجاجي. يمكن لتصوير قاع العين الطولي في برايتفيلد أيضا تحديد التهاب الشبكية وحول الأوعية الدموية.تظهر العيون الملتهبة بشدة تسلل أبيض متعدد في شبكية العين وتعرج الأوعية الدموية في تصوير قاع العين الملون ، بالإضافة إلى التهاب الزجاج الكثيف وذمة الشبكية في OCT في اليوم الثاني. تظهر العيون الملتهبة بشكل معتدل آفات خطية أقل وأكثر سرية في قاع العين ، وعدد من الخلايا المتسللة في الفضاء الزجاجي. ضمان الاتساق أثناء الحقن تحت الجلد وداخل الجسم الزجاجي واتخاذ التدابير المناسبة لمنع تطور التهاب باطن المقلة المعدية هي الخطوات الرئيسية التي تساعد في تكرار هذا النموذج بنجاح.يمكن استخدام التصوير بالتلألؤ الحيوي في الجسم الحي لتوصيف الالتهاب بينما يمكن إجراء فحوصات ما بعد الوفاة ، مثل تحليل التدفق الخلوي متعدد المعلمات لتحديد وقياس مجموعات الخلايا المناعية المتسللة. يمكن استخدام تحليل السيتوكينات وتسلسل mRNA والتصوير المناعي لتقييم أنماط التعبير الجيني والبروتيني أو تحديد مجموعات الخلايا المناعية في شبكية العين في التهاب العنبية. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء الحقن القابلة للتكرار والمعقمة والحد الأدنى من الصدمة التي ستساعد الباحثين في المستقبل على الوصول إلى الفضاء داخل الجسم الزجاجي في الفئران.سيلعب OCT أيضا دورا مهما في الكشف عن التهاب العين الذي يمكن تفويته عن طريق الفحص البصري لعيون التجارب الصغيرة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

اللثوية Porphyromonas كما كائن نموذج لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع خلايا المضيف

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

الزرد نموذجا لتقييم إمكانات المسخية من النطرون

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

العدوى التجريبية مع<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; نموذجا لدراسة المضيف الردود انترفيرون γ

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

منهجيات لدراسة<em&gt; B. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

العميق "الجلد حقن كنموذج" "عدوى الجلد" المبيضات البيض "التحليل النسيجي"

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

قياس معدلات المتفطرات المحددة مع أنظمه المراسلة التي تكتسب وظيفة

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...