Name: primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door financiering van de National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Verenigde Staten (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), giften van de Mark Daily, MD Research Fund en het Christopher and Alida Latham Research fund, een onbeperkte departementale subsidie van Research to Prevent Blindness en een carrièreontwikkelingsprijs van Research to Prevent Blindness (KP). Het werk in Bristol werd ondersteund door aanvullende financiering van Sight Research UK en The Underwood Trust.

De auteurs hebben geen financiële conflicten te onthullen.

Diermodellen van uveïtis hebben een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van de mechanismen van oogontsteking en homeostase en bij het mogelijk maken van preklinische evaluatie van medische en chirurgische therapieën voor patiënten met uveïtis37. Zowel konijnen- als rattenvarianten van het PMU-model hebben hun waarde in preklinische therapie aangetoond via proof of concept-studies 38,39,40. Vanwege de beschikbaarheid van een breed scala aan transgene stammen bij muizen, maakt het opzetten van het PMU-modelsysteem van de muis nu meer gedetailleerde mechanistische studies mogelijk om specifieke celtypen, paden en genen te identificeren die bijdragen aan de pathologie van deze ziekte.
Diermodellen van uveïtis kunnen de variabiliteit van dier tot dier aantonen in de incidentie en intensiteit van ontsteking41. In de C57BL/6-muizenstam wordt PMU betrouwbaar gegenereerd met behulp van het hier beschreven protocol. Stamspecifieke variaties in het verloop en de intensiteit van uveïtis zijn gemeld voor zowel EAU als EIU42,43. Hoewel stamspecifieke effecten op de ernst en het verloop van PMU niet experimenteel zijn gemeten, is dit model gebruikt in wild-type C57BL / 6J en in albino-muizen (B6 (Cg) - Tyrc-2J / J) en produceerde vergelijkbare ontstekingsreacties. Bij het genereren van het PMU-model kan het beheersen van de onderstaande overwegingen nieuwe onderzoekers helpen de variabiliteit te beperken en de meest consistente en reproduceerbare uveïtis te produceren.
Zorg voor consistentie in de subcutane injecties: Om een consistente subcutane injectie te bieden, moet u ervoor zorgen dat alle luchtbellen uit de emulsie worden verwijderd. Overwegingen omvatten een korte centrifuge (30 s bij 400 x g) van de vooraf gemaakte emulsie voorafgaand aan het laden van de spuit. Dit verwijdert lucht die vastzit in de emulsie. Keer bij het laden van de spuit ook regelmatig om (tip-up) en tik op de spuit om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats de spuit tijdens het injecteren niet te diep om intramusculaire injectie te voorkomen. Omgekeerd kan een ondiepe (intradermale) injectie leiden tot erosie van de emulsie door de huid. Vergeet niet om even te pauzeren voordat u de spuit van de injectieplaats verwijdert om volledige injectie van de dikke viskeuze emulsie te garanderen en om reflux van de huid te voorkomen.
Bevestig zeven dagen na het plaatsen van de subcutane injectie de aanwezigheid van voelbare knobbeltjes aan weerszijden van de achterpoten. Als er geen knobbeltjes kunnen worden geïdentificeerd, is het mogelijk dat lucht werd geïnjecteerd in plaats van emulsie. In dit geval is acute ontsteking mogelijk niet zo robuust en ontwikkelt chronische ontsteking zich mogelijk niet.
Voorkom de ontwikkeling van infectieuze endoftalmitis: Bacteriële of schimmelendoftalmitis zal een verstorende variabele genereren als deze niet wordt voorkomen44. Om bacteriële endoftalmitis te voorkomen, moet u altijd een goede aseptische techniek toepassen bij het maken van de intravitreale suspensie, het hanteren en reinigen van alle herbruikbare hulpmiddelen die in contact komen met het oog. Het gebruik van steriele items voor eenmalig gebruik, autoclaveren of schoonmaken met 95% alcoholwasbeurten of doekjes is belangrijk. Gepast gebruik van betadine aangebracht op het oculaire oppervlak, deksels en perioculaire vacht zal ook helpen voorkomen dat endoftalmitis45. Het is eenvoudig om een oog met infectie te herkennen, omdat de oculaire structuren tijdens de post-injectiekuur worden uitgewist door extreme ontsteking. Dit is niet typisch voor PMU. De aanwezigheid van intraoculaire bloedingen kan ook wijzen op endoftalmitis of trauma van de injectie. Sluit in dergelijke gevallen deze dieren uit van het onderzoek.
Zorg voor consistentie in de intravitreale injectie: De intravitreale injectie is een cruciale stap in de inductie van betrouwbare en reproduceerbare ontstekingen bij PMU. Het verstrekken van een consistente hoeveelheid Mtb-suspensie bij elke injectie, het vermijden van trauma en het voorkomen van reflux van de suspensie zijn allemaal factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van de injecties. Om een consistente suspensie te garanderen, vortex de stocksuspensie grondig bij het ontdooien en voordat deze in de spuit wordt geladen. Omdat dit gebruikte Mtb-extract geen oplossing vormt, kan de suspensie na verloop van tijd sedimentatie ondergaan. Om een uniforme concentratie van het Mtb-extract in elke injectie te garanderen, gebruikt of verwijdert u de spuit en laadt u deze binnen 15 minuten na het laden opnieuw. Fenylefrine wordt gebruikt voor verwijding om een groter gezichtsveld naar het achterste oog te bieden en het risico op trauma aan het oog tijdens de injectie te verminderen. Deze druppel genereert natuurlijke terugtrekking van het ooglid en lichte proptose van de wereldbol, waardoor een goede visualisatie van het gebied 1-2 mm achter de limbus mogelijk is zonder dat het oog met een tang hoeft te worden vastgepakt. Het gebruik van een tang om het oog te beteugelen kan potentieel trauma veroorzaken en de intraoculaire druk en het risico op reflux van de Mtb-suspensie tijdelijk verhogen. Trauma kan ook worden veroorzaakt door te proberen te veel volume in het oog te injecteren. Het injectievolume is beperkt tot 2 μL om significante en langdurige verhoging van de intraoculaire druk en trauma aan het oog te voorkomen. Bovendien zullen jongere dieren ogen hebben die kleiner zijn dan volwassen muizen. Typisch 6-8 weken muizen (20-25 g) zorgen voor een uniforme ooggrootte en zorgen voor een grotere consistentie in de ontsteking na injectie van Mtb. Een hogere frequentie van reflux na injectie van de mycobacteriële suspensie werd waargenomen bij kleinere muizen. Dit leidt op zijn beurt tot een minder dan verwachte acute ontsteking. Een verdunde fluoresceïneoplossing wordt gebruikt om de beginnende injector visuele feedback te geven over het succes van hun injectietechniek. Verwijding op het moment van injectie zorgt voor directe visualisatie van het geïnjecteerde materiaal in de glasvochtholte en de mogelijkheid om enig bewijs van lenstrauma op te merken. In het geval van lenstrauma kan het een verandering in de helderheid van de lens veroorzaken die een cataract veroorzaakt die op OCT kan worden gevisualiseerd. In het geval van oculair trauma moeten de ogen worden uitgesloten van het onderzoek vanwege de mogelijkheid van lensgeïnduceerde uveïtis46. We raden aan om 10 s te pauzeren voordat u de spuit uit het oog verwijdert om dispersie van de Mtb-suspensie in het oog mogelijk te maken en reflux te verminderen.
Het PMU-model kan worden aangepast om de intensiteit van acute ontsteking te veranderen door de concentratie van de Mtb in de intravitreale injectie te variëren. Verschillende doseringen variërend van 2,5 μg/μL tot 15 μg/μL zijn eerder getest in ons lab. Doses hoger dan 10 μg/μL bleken echter ernstige oogschade te veroorzaken, waaronder spontane lensruptuur, ernstig cornea-oedeem en littekens, en hyphema. Deze mate van ernst is niet typisch bij menselijke patiënten met post-infectieuze uveïtis en daarom worden deze concentraties niet aanbevolen. Een dosis van 5 μg/μL bleek op betrouwbare wijze milde tot matige acute ontsteking en milde chronische uveïtis te produceren; de dosis van 10 μg/μL produceert een betrouwbaar matige tot ernstige acute ziekte en een meer opvallende chronische ziekte. Het variëren van de intravitreale concentratie kan dus alternatieve ernst van de ziekte bieden voor gebruik indien nodig op basis van de experimentele vraag. Controles moeten worden geselecteerd om ervoor te zorgen dat de resultaten te wijten zijn aan de respons op mTB en niet aan trauma geassocieerd met de subcutane of intravitreale injecties. In de schijninjectiecontroles kan PBS worden gebruikt in plaats van het mTB-extract. Voor vergelijkingen met onbelichte dieren moeten echte naïeve monsters worden beschouwd als medeogen zijn niet altijd gelijkwaardig.
Vanwege de kleine omvang van het muisoog kan OCT een gevoeligere test zijn om ontstekingen in de voorste kamer te detecteren dan directe visualisatie of microscopische heldere veldfotografie. Eerder werk met PMU bij ratten25 bepaalde dat er meer cellen kunnen worden gedetecteerd door histologie dan door OCT, maar dat er een goede correlatie is tussen de twee modaliteiten. OCT heeft als bijkomend voordeel dat het kan worden gebruikt om de ontsteking longitudinaal bij hetzelfde dier te monitoren. Andere belangrijke muismodellen van uveïtis, zoals EAU en EIU, hebben ook OCT gebruikt voor kwantitatieve analyse 12,47,48. In het PMU-model van muizen zijn voorste kamercellen alleen zichtbaar op OCT en kunnen ze niet worden gezien op klinische onderzoeken tenzij er een groot hypopyon aanwezig is. Glasvochtontsteking (vitritis) kan worden waargenomen met color fundus imaging, maar het detecteren van kwantitatieve verandering is alleen mogelijk met OCT-beeldvorming. Andere aspecten van het model, zoals retinale vasculaire ontsteking en retinale schade, kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met OCT- en microscopische brightfield fundusfotografie.
Bij het gebruik van OCT is het belangrijk om te overwegen hoe gelokaliseerde beeldvorming kan worden beïnvloed door regionale verschillen in de mate van ontsteking. Eerdere rapporten hebben een ongelijke verdeling van cellen in de voorste kamer van mensen geïdentificeerd, met meer cellen inferieur49. Bij muizen komt een vergelijkbare aanleg vaak voor. Verticale of radiale scans door de AC zullen dus helpen zorgen voor beelden die het bereik van ontsteking vastleggen. Bovendien zal het uitvoeren van beeldvorming op dezelfde plaats ook consistentie bieden aan beelden die in de lengterichting van hetzelfde oog zijn verzameld. Om beelden in hetzelfde deel van het oog te verkrijgen, gebruikt u stabiele oriëntatiepunten en een systematische aanpak. Voor beelden van de voorste kamer wordt het beeld direct naast de top van het hoornvlies gecentreerd en verticaal georiënteerd, zodat de aanwezigheid van een hypopyon in de inferieure hoek kan worden gedetecteerd. Voor posterieure segmentafbeeldingen is het beeld gecentreerd op de oogzenuw. Het wordt aanbevolen om te overwegen om ten minste 3 lijnscans te gebruiken voor het scoren om ervoor te zorgen dat regionale variabiliteit wordt vastgelegd. In gevallen waarin ontsteking beperkt is tot perifere locaties, kan het verkrijgen van volumescans nuttig zijn. Het verzamelen van volumescans kan ook helpen bij het vastleggen van regionale variaties, maar zal de vereisten voor gegevensopslag verhogen.
Andere in vivo assays die kunnen worden gebruikt om ontstekingen in het PMU-muismodel te karakteriseren, zijn bioluminescentiebeeldvorming13,35. Postmortale assays zoals multi-parameter flowcytometrische analyse kunnen worden uitgevoerd om infiltrerende immuunceltypepopulaties in de waterige en achterste oogkamer te identificeren en te kwantificeren12,26. In het PMU-model wordt acute ontsteking gekenmerkt door een aangeboren respons met een overheersend neutrofiel infiltraat, gevolgd door een chronische en aanhoudende adaptieve T-cel dominante respons die langer dan een maand aanhoudt35. Andere testen van de immuunfunctie die kunnen worden uitgevoerd op post-mortem weefsels omvatten oculaire vloeistof cytokine analyse. Bovendien kunnen andere downstream-testen zoals mRNA-sequencing en immunofluorescentiebeeldvorming worden gebruikt om gen- en eiwitexpressiepatronen van retinale immuuncelpopulaties bij uveïtiste beoordelen 50,51.
Het PMU-model kan worden gerepliceerd in andere knaagdiersystemen met behulp van aanpassingen die geschikt zijn voor de verschillende soorten. PMU-model is eerder gebruikt bij ratten en konijnen 38,39,40. Bij ratten ontwikkelt acute panuveitis zich na intravitreale injectie die spontaan verdwijnt gedurende 14 dagen zonder tekenen van chronische ontsteking te ontwikkelen door histologie24. Bij konijnen maakt inductie van uveïtis gebruik van twee rondes subcutane injectie voorafgaand aan intravitreale injectie, maar genereert ook een robuuste panuveitis. Een van de voordelen van het gebruik van het muismodel is de beschikbaarheid van talrijke transgene en knock-out stammen die kunnen helpen het basismechanisme van uveïtiste begrijpen 52. Alle knaagdiermodellen kunnen worden gebruikt voor preklinische therapietests als het middel systemisch of als een actuele druppel wordt toegediend. Vanwege hun grotere omvang zijn ratten- en konijnenogen echter betere modellen voor gebruik in preklinische studies van implanteerbare of lokale injectiebehandelingsopties voor uveïtis.
Samenvattend biedt dit protocol onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de mechanismen van chronische oogontsteking een nieuw hulpmiddel dat niet afhankelijk is van eerdere immunisatie met oculaire antigenen.

De term 'uveïtis' beschrijft een heterogene reeks aandoeningen die allemaal intraoculaire ontsteking kenmerken1. Diermodellen van uveïtis zijn belangrijk voor het begrijpen van ziektemechanismen en voor het preklinisch testen van nieuwe therapieën. Er zijn een aantal diermodellen van uveïtis vastgesteld2. De twee die het meest uitgebreid zijn bestudeerd, zijn experimentele auto-immune uveïtis (of uveoretinitis; EAU) en endotoxine-geïnduceerde uveïtis (EIU). EAU wordt meestal gegenereerd door immunisatie met oculaire antigenen of kan spontaan optreden wanneer de centrale tolerantie wordt verstoord in afwezigheid van het AIRE-gen 3,4. Andere varianten van het model zijn sindsdienontwikkeld 5,6,7 om verschillende uveitogene peptiden op te nemen; deze zijn uitgebreid beoordeeld 8,9,10. EAU is het primaire model voor vormen van T-celafhankelijke auto-immune uveïtis zoals de ziekte van Vogt-Koyanagi-Harada en birdshot chorioretinitis bij de mens. EIU wordt gegenereerd door systemische of lokale injectie van bacteriële lipopolysaccharide (LPS)10,11. EIU is gebruikt als een model van acute uveïtis gegenereerd door activering van aangeboren immuunsignaleringsroutes12. Beide modellen zijn instrumenteel geweest voor het huidige begrip van oculaire immunologie, maar geen van beide zijn effectieve modellen voor post-infectieuze chronische uveïtis. Onlangs vastgesteld bij muizen, biedt het Primed Myco bacteriële Uveitis (PMU) -model nu een benadering om klinische en cellulaire aspecten van deze vorm van uveïtis te ondervragen en te evalueren13.
Er is wereldwijd een hoge prevalentie van mycobacteriële infecties, met meer dan 10 miljoen nieuwe gevallen en meer dan 1,4 miljoen sterfgevallen gemeld door de Wereldgezondheidsorganisatie in 201914. Extrapulmonale manifestatie van actieve tuberculose (TB) infectie omvat uveïtis en is een goed erkende oorzaak van infectieuze uveïtis15,16. De manifestaties van tbc-geassocieerde uveïtis zijn proteaan, wat waarschijnlijk meerdere verschillende ziektemechanismen weerspiegelt, waaronder directe oculaire infectie en minder goed begrepen immuungemedieerde ontsteking 17,18,19. De voorgestelde mechanismen voor deze post-infectieuze sequelae omvatten een chronische ontstekingsreactie gestimuleerd door de persistentie van een pauci-bacillaire infectie in het retinale pigmentepitheel (RPE), een chronische ontstekingsreactie gestimuleerd door de aanwezigheid van residuele pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) van een succesvol geklaarde oculaire infectie, en ongepaste activering van de adaptieve immuunrespons tegen oculaire antigenen door een proces van moleculaire mimicry of antigeen verspreiding veroorzaakt door systemische tbc-infectie 20,21,22,23.
Om een beter mechanistisch begrip te krijgen van chronische post-infectieuze uveïtis en de rol van mycobacteriële antigenen bij het initiëren van de ziekte te bestuderen, werd het PMU-model ontwikkeld voor gebruik bij muizen13,24. Dienovereenkomstig, om ontstekingen op te wekken, krijgt de muis eerst een subcutane injectie van antigeen van de hitte-gedode Mycobacterium tuberculosis H37Ra-stam om systemische infectie na te bootsen, zeven dagen later door intravitreale injectie van hetzelfde antigeen toegediend aan het linker- of rechteroog om lokale oculaire infectie na te bootsen. De intensiteit en duur van de daaropvolgende uveïtis worden gemonitord door longitudinale in vivo Optical Coherence Tomography (OCT) en fundale beeldvorming van het oog25. PMU wordt gekenmerkt door een acute, myeloïde-dominante panuveitis die zich ontwikkelt tot een chronische T-cel-dominante posterieure uveïtis met vitritis, perivasculaire retinale ontsteking en focale gebieden van buitenste retinale schade26. De aanwezigheid van granulomateuze ontsteking in het achterste segment van het oog suggereert dat het PMU-model kan worden gebruikt om sommige vormen van anterieure (granulomateuze en niet-granulomateuze) en intermediaire uveïtis te bestuderen, gezien bij patiënten met immunologisch bewijs van mtb-infectie in het verleden27. Bovendien is gesuggereerd dat de componenten van hitte-gedode Mtb die in het PMU-model worden gebruikt, immuunresponsen veroorzaken die ten grondslag liggen aan de aspecten van terugkerende uveïtis bij patiënten met oculaire tuberculose die reageren op anti-tuberculaire therapie (ATT)28. Vanwege de verschillen in ziekte-initiatie en ontstekingsverloop in vergelijking met EAU en EIU, vertegenwoordigt PMU een nieuw diermodel van uveïtis dat niet afhankelijk is van immunisatie met oculaire antigenen en kan helpen bij het ophelderen van ziektemechanismen bij patiënten met chronische uveïtis. Dit protocol schetst de methoden voor het genereren van PMU, het monitoren van het klinische verloop van ontsteking en het verzamelen van oculaire monsters voor postmortemanalyse met flowcytometrie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-FLUOR</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed</td>
			<td>Akorn Animal Health, IL, USA</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Xylazine 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>8007-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide Needles -25 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide needle -30-G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond MAX, Bond Rx</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol ointment</td>
			<td>Martindale Pharma, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>1% w/w Chloramphenicol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG1150H</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2300</td>
			<td>Bioptigen/Leica</td>
			<td></td>
			<td>OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Incomplete Adjuvant</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>263910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye ointment</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra lyophilized Mycobacteria extract</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton RN Needle (33/12/2)S</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>7803-05(33/12/2)</td>
			<td>33 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>CAL7633-01</td>
			<td>5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td>Exel International, USA</td>
			<td>26029</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset</td>
			<td>Zoetis, USA</td>
			<td>377341</td>
			<td>Ketamine HCL 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA</td>
			<td></td>
			<td>Alternative Imaging/OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil 10 &#181;L syringe</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Intraocular Injection Kit</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>IO-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissection scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td>17478020115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>309602</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine 0.5%</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>1041544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek VIP series</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc.,CA.</td>
			<td></td>
			<td>Histology Tissue Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1%</td>
			<td>Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>Minims</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tylenol</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc, PA, USA</td>
			<td>NDC 50580-614-01</td>
			<td>Acetaminophen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK</td>
			<td></td>
			<td>Carbomer eye gel 0.2% w/w</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis

De term 'uveïtis' beschrijft een heterogene reeks aandoeningen die allemaal intraoculaire ontsteking kenmerken. In grote lijnen wordt uveïtis gedefinieerd door etiologie: infectie of auto-immuniteit. Infectieuze uveïtis vereist behandeling met de juiste antimicrobiële middelen, terwijl auto-immune uveïtis behandeling met corticosteroïden of andere immunosuppressiva vereist. Post-infectieuze uveïtis is een vorm van chronische uveïtis die corticosteroïden vereist om immuunse gevolgen na de eerste infectie onder controle te houden. Uveïtis geassocieerd met Mycobacterium tuberculosis (Mtb) -infectie is een goed erkende vorm van post-infectieuze uveïtis, maar de mechanismen van ziekte zijn niet volledig begrepen. Om de rol te begrijpen die mycobacteriële antigenen en aangeboren liganden spelen bij het stimuleren van chronische oogontsteking na mTB-infectie, werd het model Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) ontwikkeld voor gebruik bij muizen. Dit manuscript schetst de methoden voor het genereren van PMU en het monitoren van het klinische verloop van ontsteking met behulp van kleurenfundus en optische coherentietomografie (OCT) beeldvorming. PMU wordt geïnduceerd door immunisatie met hitte-gedood mycobacteriële extract gevolgd door intravitreale injectie van hetzelfde extract in één oog zeven dagen later. Oculaire ontsteking wordt longitudinaal gemonitord met behulp van in vivo beeldvorming en gevolgd door monsterverzameling voor een breed scala aan testen, waaronder histologie, flowcytometrie, cytokine-analyse, qPCR of mRNA-sequencing. Het muismodel van PMU is een nuttig nieuw hulpmiddel voor het bestuderen van de oculaire reacties op mTB, het mechanisme van chronische uveïtis, en voor preklinische effectiviteitstests van nieuwe ontstekingsremmende therapieën.

Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis

Dit protocol schetst de stappen voor het induceren van Primed Myco bacteriële Uveïtis (PMU) bij muizen. Deze methode schetst de stappen om betrouwbare en robuuste oogontsteking in het muismodelsysteem te helpen produceren. Met behulp van dit protocol genereerden we uveitische ogen en niet-ontstoken medeogen van afzonderlijke dieren voor verdere evaluatie met immunologische, transcriptomische en proteomische assays.

Geprimed mycobacteriële uveïtis (PMU) als model voor post-infectieuze uveïtis

The term 'uveitis' describes a heterogeneous set of conditions that all feature intraocular inflammation. Broadly, uveitis is defined by etiology:  ...

Dit protocol schetst de stappen om betrouwbare en robuuste oogontsteking te induceren met behulp van hittedode mycobacteriën in het muismodel. Dit geprimeerde mycobacteriële uveïtismodel kan helpen bij het bestuderen van de mechanismen van chronische immuungemedieerde oculaire ontsteking die zich ontwikkelt na een mycobacteriële infectie. Dit model van chronische uveïtis vereist geen gebruik van specifieke muizenstammen of immunisatie met oculaire antigenen.Dit model vergemakkelijkt het gebruik van transgene en gen knock-out muislijnen in mechanistische studies van de pathogenese van oculaire ontsteking. Dit PMU-model zal nuttig zijn bij studies die nieuwe therapieën testen voor oogontsteking of uveïtis bij mensen. Behandelingen zoals nieuwe oogdruppels of systemisch toegediende immuunmodulerende middelen kunnen met dit model op werkzaamheid worden getest.Dit model zal het bestuderen vergemakkelijken hoe hitte-gedode mycobacteriële antigenen de micro-omgeving van een immuungeprivilegieerd orgaan zoals het oog veranderen. Deze resultaten kunnen ook inzicht geven in hoe andere soorten ooginfecties het oog beïnvloeden of hoe immuungeprivilegieerde sites, zoals de hersenen, reageren op microbacteriële antigenen. Om te beginnen, ontklemt u het lichaam van de Sonicator-convertereenheid en reinigt u de sonde met een alcoholdoekje van 70%.Schakel vervolgens de Sonicator in en stel de stroominstelling in op vier door aan de aan / uit-knop te draaien. Om vervolgens een fijne suspensie van de microbacterie tuberculosis H37Ra in PBS te genereren, dompelt u de punt van de sonde onder in het PBS-bevattende microbacteriële poeder. Soniceer het mengsel gedurende 30 seconden op ijs, pauzeer vervolgens gedurende 30 seconden en herhaal dit in totaal vijf minuten om het poeder volledig in een gelijkmatige suspensie te verspreiden zonder de vloeistof te verwarmen.Voeg vervolgens 2,5 milliliter onvolledig adjuvans van Freund toe aan het mengsel en herhaal het ultrasoonapparaatproces op ijs totdat de emulsie een tandpasta-achtige consistentie vormt. Laad voor de subcutane injectie 200 tot 300 microliter van de microbacteriële emulsie in een spuit van één milliliter. Verwijder de lucht uit de spuit en blijf de spuit vullen met intermitterend omkeren en tikken totdat deze gevuld is.Plaats vervolgens de subcutane injecties op het dorsale oppervlak van de heupen of op het ventrale oppervlak van de benen proximaal aan het gebied van de inguinale lymfeklieren van een 6 tot 10 weken oude verdoofde C57 zwarte 6J-muis. Steek de naald voorzichtig in, zorg ervoor dat u de spier niet binnendringt en injecteer 50 microliter van de emulsie in de onderhuidse ruimte. Verwijder de naald niet onmiddellijk om de dikke emulsie volledig te kunnen injecteren.Om de antigeenvoorraad voor te bereiden op de intravitreale injectie, soniceert u de H37Ra in PBS-oplossing zoals eerder gedemonstreerd, aliquot u de oplossing in volumes van 100 microliter en bewaart u deze bij 20 graden Celsius. Op de dag van de injectie, na bevestiging van de diepte van de algemene anesthesie, anesthetie het hoornvlies met één druppel van 0,5% tetracaïne en verwijd de pupil met één druppel van 2,5% fenylefrine. Voeg na het afdeppen van overtollige vloeistof een druppel van 5% Betadine toe aan het oogoppervlak en het omliggende haar om het risico op endoftalmitis te verminderen.Verwijder na twee tot drie minuten de Betadine en bedek het oog met 0,3% hypromellose gel om uitdroging onder anesthesie en cataractvorming te voorkomen. Laad vervolgens een spuit van 10 microliter met het antigeen- en fluoresceïnemengsel, plaats de muis vervolgens in een buikligging op het platform en gebruik de rechter- en linkeroorbalken om de muiskop te bevestigen. Plaats en oriënteer de muis onder de scoop zodat het superieure nasale aspect van het rechteroog zichtbaar is.Verplaats vervolgens met een naald van 30 gauge de wimpers, stel de sclera bloot en visualiseer de limbus en het radiale bloedvat. Maak vervolgens met behulp van een steriele naald van 30 gauge een geleidingsgat in de sclera één tot twee millimeter achter de limbus. Steek vervolgens de naald van 34 gauge die aan de injectiehouder is bevestigd in het oog, door het geleidingsgat, in een hoek die de lens vermijdt, maar plaats de naaldpunt in de glasvochtholte.Injecteer met behulp van een microspuitpompregelaar voorzichtig één microliter van het M.tuberculosis-extract in de glasvochtholte. In geval van consistente reflux, verhoog het injectievolume tot 1,5 microliter om een adequate dosisafgifte te garanderen. Bevestig de intravitreale plaatsing door een groenachtige reflex in het oog te visualiseren en verwijder na 10 seconden de naald uit het oog.Na het verdoven van de muis, verwijdt u de pupil met één druppel 2,5% fenylefrine, waardoor overtollige druppels in de neus of mond worden vermeden. Dep na twee tot drie minuten de overtollige vloeistof af en bedek het oog met 0,3% hypromellose gel. Wikkel vervolgens de muis in een laag chirurgisch gaas om de lichaamswarmte te behouden, plaats de muis vervolgens op de dierencassette en plaats het hoofd met de bijtbalk.Als u de optische coherentietomografie of OCT-beelden wilt verkrijgen, schakelt u het OCT-beeldvormingssysteem in en opent u de beeldbewerkingssoftware. Breng voor beeldvorming van de achterste kamer de OCT dicht bij het oogoppervlak en zorg ervoor dat het oppervlak van de lens niet in contact komt met het oog. Zodra het oog correct is gepositioneerd, stopt u de snelle scan, selecteert u het volumescanprotocol en activeert u de scan met de optie Doel.Voor afbeeldingen van het posterieure segment past u zich aan totdat de oogzenuw is gecentreerd in de horizontale B-scanuitlijningsafbeelding en het netvlies is uitgelijnd met de verticale uitlijningsas. Voor afbeeldingen van het voorste segment past u de positie aan om de top van het hoornvlies te centreren in zowel de horizontale B-scanuitlijningsafbeelding als de verticale B-scanuitlijningsafbeelding. Klik ten slotte op Snapshot om de volumescanafbeelding vast te leggen en klik vervolgens op opslaan.24 uur na intravitreale injectie worden ontstekingscellen gezien in het waterige en glasvocht. Cornea-oedeem, een hypopyon en meerdere vrij zwevende ontstekingscellen worden gezien in de voorste kamer en vitritis in de achterste kamer. De mate van oogontsteking kan op deze OCT-beelden worden gescoord.Gecombineerde scores groter dan nul maar minder dan 2,5 vertegenwoordigen milde ontsteking. Scores groter dan 2,5, maar minder dan 4,5. vertegenwoordigen matige ontsteking en scores groter dan 4,5 identificeren ernstige ontsteking.Ontstekingsscores kunnen ook worden bepaald met behulp van vijf kenmerken die zichtbaar zijn in hematoxyline- en eosinekleuringssecties. De ernstscore wordt bepaald door het aantal ontstekingscellen in het waterige en glasvocht te tellen. Brightfield longitudinale fundus beeldvorming kan ook retinale en perivasculaire ontsteking identificeren.Ernstig ontstoken ogen vertonen meerdere witte infiltraten in het netvlies en vasculaire tortuositeit op kleuren fundus beeldvorming, evenals dichte vitritis en retinaal oedeem op OCT op dag twee. Licht ontstoken ogen vertonen minder en meer discrete lineaire laesies in de fundus en een aantal infiltrerende cellen in de glasvochtruimte. Het waarborgen van consistentie tijdens de subcutane en intravitreale injecties en het nemen van passende maatregelen om de ontwikkeling van infectieuze endoftalmitis te voorkomen, zijn de belangrijkste stappen die helpen bij het succesvol repliceren van dit model.In vivo bioluminescentie beeldvorming kan worden gebruikt om ontstekingen te karakteriseren, terwijl post-mortem assays, zoals multi-parameter, flow cytometrische analyse kunnen worden uitgevoerd om infiltrerende immuunceltype populaties te identificeren en te kwantificeren. Cytokine-analyse, mRNA-sequencing en immunofluorescentiebeeldvorming kunnen worden gebruikt om gen- en eiwitexpressiepatronen te beoordelen of retinale immuuncelpopulaties bij uveïtis te identificeren. Dit protocol laat zien hoe reproduceerbare, aseptische en minimaal traumatische injecties kunnen worden uitgevoerd die toekomstige onderzoekers zullen helpen toegang te krijgen tot de intravitreale ruimte bij muizen.OCT zal ook een belangrijke rol spelen bij het opsporen van oogontstekingen die anders gemist zouden kunnen worden door een visueel onderzoek van de ogen van kleine proefdieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Gebruik<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als modelorganisme om te studeren<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infectie

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Zebravis als een model om de teratogene potentie van nitriet Assess

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

Experimentele infectie met<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Diepe dermale injectie als de een Model van Candida albicans infectie van de huid voor histologisch Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

Meting van specifieke mycobacteriële verkeerde vertaaltarieven met winst-van-functie reporter systemen

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...