Name: primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות, בת'סדה, מרילנד, ארצות הברית (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, מענק ליבת מחקר ראייה של UW (NEI P30EY01730), מתנות מקרן המחקר מארק דיילי, MD וקרן המחקר של כריסטופר ואלידה לת'ם, מענק מחלקתי בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ופרס פיתוח קריירה ממחקר למניעת עיוורון (KP). העבודה שנערכה בבריסטול נתמכה על ידי מימון נוסף של Sight Research UK וקרן אנדרווד.

למחברים אין קונפליקטים כספיים לחשוף.

מודלים חייתיים של אובאיטיס סייעו בהבנת המנגנונים של דלקת עיניים והומאוסטזיס, כמו גם אפשרו הערכה פרה-קלינית של טיפולים רפואיים וכירורגיים לחולים עם אובאיטיס37. הן גרסאות ארנב והן חולדה של מודל PMU הוכיחו את ערכן בטיפול פרה-קליני באמצעות מחקרי הוכחת היתכנות38,39,40. בשל הזמינות של מגוון רחב של זנים מהונדסים בעכברים, הקמת מערכת מודל PMU של העכבר מאפשרת כעת מחקרים מכניסטיים מפורטים יותר כדי לזהות סוגי תאים, מסלולים וגנים ספציפיים התורמים לפתולוגיה של מחלה זו.
מודלים חייתיים של אובאיטיס יכולים להדגים שונות בין בעלי חיים לבעלי חיים בשכיחות ובעוצמה של דלקת41. בזן העכבר C57BL/6, PMU נוצר באופן אמין באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. דווח על שינויים ספציפיים לזן במסלול ובעוצמה של אובאיטיס הן עבור EAU והן עבור EIU42,43. בעוד שהשפעות ספציפיות לזן על חומרתו ומסלולו של PMU לא נמדדו בניסוי, מודל זה שימש ב-C57BL/6J מסוג פרא, כמו גם בעכברים לבקנים (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) והפיק תגובות דלקתיות דומות. ביצירת מודל PMU, שליטה בשיקולים המפורטים להלן יכולה לסייע לחוקרים חדשים להגביל את השונות ולייצר את האובאיטיס העקבית והניתנת לשחזור ביותר.
הקפידו על עקביות בזריקות התת עוריות: כדי לספק הזרקה תת עורית עקבית, ודא שכל בועות האוויר מוסרות מהתחליב. השיקולים כוללים צנטריפוגה קצרה (30 שניות ב-400 x גרם) של התחליב המוכן מראש לפני טעינת המזרק. פעולה זו תסיר אוויר כלוא בתחליב. כמו כן, בעת טעינת המזרק, הפוך מעת לעת (טיפ-אפ) והקש על המזרק כדי להסיר בועות אוויר. בזמן ההזרקה, אין למקם את המזרק עמוק מדי על מנת למנוע הזרקה תוך שרירית. לעומת זאת, זריקה רדודה (לא טריידלית) עלולה לגרום לשחיקה של התחליב דרך העור. זכרו להשהות לזמן קצר לפני הסרת המזרק ממקום ההזרקה כדי להבטיח הזרקה מלאה של התחליב הצמיג הסמיך ולמנוע ריפלוקס מהעור.
שבעה ימים לאחר הצבת הזריקה תת עורית, לאשר את נוכחותם של גושים מוחשיים משני צדי הרגליים האחוריות. אם לא ניתן לזהות גושים, ייתכן כי האוויר הוזרק ולא תחליב. במקרה זה, דלקת חריפה עשויה להיות פחות חזקה, ודלקת כרונית עשויה שלא להתפתח.
מניעת התפתחות של אנדופתלמיטיס זיהומיות: אנדופתלמיטיס חיידקית או פטרייתית תיצור משתנה מבלבל אם לא תימנע44. על מנת למנוע אנדופתלמיטיס חיידקית, תמיד לתרגל טכניקה אספטית טובה בעת ביצוע ההשעיה intravitreal, טיפול, וניקוי כל הכלים לשימוש חוזר כי יבוא במגע עם העין. חשוב להשתמש בפריטים סטריליים לשימוש חד-פעמי, לטאטא או לנקות עם 95% אלכוהול לשטוף או למגבון. שימוש נכון בבטאדין המיושם על משטח העין, העפעפיים והפרווה הפרעינית יעזור גם הוא למנוע אנדופתלמיטיס45. זה פשוט לזהות עין עם זיהום כמו מבנים עיניים ייעלמו על ידי דלקת קיצונית במהלך המסלול שלאחר ההזרקה. זה לא אופייני ל-PMU. נוכחות של דימום תוך עיני יכול גם להציע אנדופתלמיטיס או טראומה מן הזריקה. במקרים כאלה, להוציא את בעלי החיים האלה מהמחקר.
ודא עקביות בהזרקה intravitreal: ההזרקה התוך-גופית היא שלב קריטי בהשראת דלקת אמינה וניתנת לשחזור ב-PMU. מתן כמות עקבית של תרחיף Mtb עם כל זריקה, הימנעות מטראומה ומניעת ריפלוקס של המתלה הם כולם גורמים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הזריקות. כדי להבטיח השעיה עקבית, מערבבים את מתלה המלאי ביסודיות עם הפשרה ולפני העמסתו במזרק. מכיוון שתמצית Mtb זו המשמשת אינה מהווה פתרון, ההשעיה יכולה לעבור שקיעה לאורך זמן. כדי להבטיח ריכוז אחיד של תמצית ה-Mtb בכל הזרקה, השתמש או גרש וטען מחדש את המזרק תוך 15 דקות מההעמסה. פנילפרין משמש להתרחבות כדי לספק שדה ראייה גדול יותר לעין האחורית ולהפחית את הסיכון לטראומה לעין במהלך ההזרקה. ירידה זו יוצרת נסיגת עפעפיים טבעית ופרופטוזה קלה של כדור הארץ, ומאפשרת הדמיה טובה של שטח 1-2 מ"מ אחורי ללימבוס ללא צורך לתפוס את העין עם מלקחיים. שימוש במלקחיים לריסון העין עלול לגרום לטראומה פוטנציאלית ולהגביר באופן זמני את הלחץ התוך עיני ואת הסיכון לרפלוקס של מתלה ה-Mtb. טראומה יכולה להיגרם גם על ידי ניסיון להזריק יותר מדי נפח לתוך העין. נפח ההזרקה מוגבל ל-2 μL כדי למנוע עלייה משמעותית וממושכת של לחץ תוך עיני וטראומה לעין. בנוסף, לבעלי חיים צעירים יותר יהיו עיניים קטנות יותר מעכברים בוגרים. בדרך כלל עכברים של 6-8 שבועות (20-25 גרם) מספקים גודל עיניים אחיד ומבטיחים עקביות רבה יותר בדלקת לאחר הזרקת Mtb. תדירות גבוהה יותר של רפלוקס לאחר ההזרקה של ההשעיה המיקובקטריאלית נצפתה בעכברים קטנים יותר. זה, בתורו, מוביל דלקת חריפה פחות מהצפוי. תמיסת פלואורסצין מדוללת משמשת כדי לספק למזרק המתחיל משוב חזותי על הצלחת טכניקת ההזרקה שלהם. התרחבות בזמן ההזרקה תאפשר הדמיה ישירה של החומר המוזרק בחלל הזגוגית והזדמנות לציין כל עדות לטראומה בעדשה. במקרה של טראומה בעדשה, זה יכול לגרום לשינוי בבהירות העדשה שיגרום לקטרקט אשר ניתן לדמיין על OCT. במקרה של טראומה עינית, העיניים צריכות להיות מחוץ למחקר בשל האפשרות של אובאיטיס המושרה על ידי עדשה46. מומלץ להשהות למשך 10 שניות לפני הסרת המזרק מהעין כדי לאפשר פיזור של מתלה ה-Mtb בתוך העין ולהפחית את הרפלוקס.
ניתן לשנות את מודל PMU כדי לשנות את עוצמת הדלקת החריפה על ידי שינוי ריכוז ה- Mtb בזריקה התוך-גופית. מינונים שונים הנעים בין 2.5 מיקרוגרם/מיקרון ל-15 מיקרוגרם/מיקרול נבדקו בעבר במעבדה שלנו. עם זאת, מינונים גבוהים מ-10 מיקרוגרם/μL נמצאו כגורמים נזק חמור לעיניים, כולל קרע ספונטני בעדשה, בצקת וצלקות קשות בקרנית, ומקף. דרגה זו של חומרה אינה אופיינית בחולים אנושיים עם אובאיטיס לאחר זיהומיות, ולכן, ריכוזים אלה אינם מומלצים. נמצא כי מינון של 5 מיקרוגרם/μL מייצר באופן אמין דלקת חריפה קלה עד בינונית ואובאיטיס כרונית קלה; המינון של 10 מיקרוגרם/μL מייצר מחלה חריפה בינונית עד חמורה באופן אמין ומחלה כרונית בולטת יותר. לפיכך, שינוי הריכוז התוך-ורידי יכול לספק חומרת מחלה חלופית לשימוש לפי הצורך בהתבסס על שאלת הניסוי. יש לבחור בקרות כדי להבטיח שהתוצאות נובעות מהתגובה ל- mTB ולא מטראומה הקשורה לזריקות תת עוריות או תוך-ורידיות. בפקדי הזרקת הבושה, ניתן להשתמש ב- PBS במקום תמצית ה- mTB. לצורך השוואה לבעלי חיים שלא נחשפו, יש להתייחס לדגימות נאיביות אמיתיות שכן עיניים אחרות אינן תמיד שקולות.
בשל גודלה הקטן של עין העכבר, OCT יכול להיות בדיקה רגישה יותר לזיהוי דלקת בתא הקדמי מאשר הדמיה ישירה או צילום שדה בהיר מיקרוסקופי. עבודה קודמת עם PMU בחולדות25 קבעה כי ניתן לזהות יותר תאים על ידי היסטולוגיה מאשר על ידי OCT, אך יש מתאם טוב בין שני האופנים. ל-OCT יש יתרון נוסף בכך שניתן להשתמש בו כדי לנטר את הדלקת לאורך אותה חיה. מודלים עכבריים גדולים אחרים של אובאיטיס, כגון EAU ו- EIU, השתמשו גם הם ב- OCT לניתוח כמותי 12,47,48. במודל PMU של עכברים, תאי החדר הקדמיים נראים רק ב- OCT ולא ניתן לראותם בבדיקות קליניות אלא אם כן קיים היפופיון גדול. דלקת זגוגית (vitrititis) ניתן לראות עם הדמיית פונדוס צבע, אבל זיהוי שינוי כמותי אפשרי רק עם הדמיה OCT. היבטים אחרים של המודל, כגון דלקת בכלי הדם ברשתית ופגיעה ברשתית, ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות OCT וצילום מיקרוסקופי של פונדוס ברייטפילד.
בעת שימוש ב- OCT, חשוב לשקול כיצד הדמיה מקומית יכולה להיות מושפעת מהבדלים אזוריים במידת הדלקת. דיווחים קודמים זיהו התפלגות לא אחידה של תאים בחדר הקדמי של בני אדם, כאשר יותר תאים ממוקמים נחותים49. בעכברים, נטייה דומה נפוצה. לפיכך, סריקות אנכיות או רדיאליות דרך זרם החילופין יסייעו להבטיח תמונות הלוכדות את טווח הדלקת. בנוסף, ביצוע הדמיה באותו מקום יספק גם עקביות לתמונות שנאספו באותה עין לאורך זמן. כדי לקבל תמונות באותו חלק של העין, השתמש בציוני דרך יציבים ובגישה שיטתית. עבור תמונות תא קדמיות, התמונה ממורכזת מיד בסמוך לפסגת הקרנית ומכוונת אנכית, כך שניתן לזהות נוכחות של היפופיון בזווית הנחותה. עבור תמונות מקטע אחורי, התמונה מרוכזת בעצב הראייה. מומלץ לשקול שימוש בלפחות 3 סריקות קו לצורך ניקוד כדי להבטיח לכידת שונות אזורית. במקרים שבהם הדלקת מוגבלת למיקומים היקפיים, רכישת סריקות נפח יכולה להיות מועילה. אוסף סריקות אמצעי האחסון יכול גם לסייע בלכידת וריאציות אזוריות, אך יגדיל את דרישות אחסון הנתונים.
בדיקות in vivo אחרות שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין דלקת במודל עכבר PMU כוללות הדמיה ביולומינסנציה13,35. ניתן לבצע בדיקות פוסט-מורטם כמו ניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים כדי לזהות ולכמת אוכלוסיות מסוג תאי חיסון מסתננים בחדר מימי ואחורי של העין12,26. במודל PMU, דלקת חריפה מאופיינת בתגובה מולדת עם חדירת נויטרופילים דומיננטית, ואחריה תגובה כרונית ומתמשכת של תאי T דומיננטיים שנמשכים למעלה מחודש35. בדיקות אחרות של תפקוד מערכת החיסון שניתן לבצע על רקמות שלאחר המוות כוללות ניתוח ציטוקינים של נוזל העין. בנוסף, ניתן להשתמש במבחנים אחרים במורד הזרם, כגון ריצוף mRNA והדמיית אימונופלואורסצנציה כדי להעריך דפוסי ביטוי של גנים וחלבונים של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון ברשתיתב-50,51 אובאיטיס.
ניתן לשכפל את מודל PMU במערכות מכרסמים אחרות באמצעות התאמות המתאימות למינים השונים. מודל PMU שימש בעבר חולדות וארנבות38,39,40. בחולדות, דלקת פנובאיטיס חריפה מתפתחת לאחר הזרקה תוך-גופית שפותרת באופן ספונטני במשך 14 יום מבלי לפתח סימנים של דלקת כרונית על ידי היסטולוגיה24. בארנבים, אינדוקציה של אובאיטיס משתמשת בשני סבבים של הזרקה תת עורית לפני הזרקה תוך-גופית, אך גם יוצרת פנובאיטיס חזקה. אחד היתרונות של שימוש במודל העכבר הוא הזמינות המוכנה של זנים מהונדסים ונוקאאוט רבים שיכולים לעזור להבין את המנגנון הבסיסי של אובאיטיס52. כל דגמי המכרסמים יכולים לשמש לבדיקות טיפול פרה-קליניות אם הסוכן מנוהל באופן מערכתי או כטיפה מקומית. עם זאת, בשל גודלם הגדול יותר, עיני חולדה וארנב הם מודלים טובים יותר לשימוש במחקרים פרה-קליניים של אפשרויות טיפול מושתלות או מקומיות בהזרקה עבור אובאיטיס.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק לחוקרים המעוניינים לחקור את המנגנונים של דלקת עיניים כרונית כלי חדש שאינו תלוי בחיסון קודם עם אנטיגנים עיניים.

המונח 'אובאיטיס' מתאר קבוצה הטרוגנית של מצבים שכולם כוללים דלקת תוך עינית1. מודלים של אובאיטיס בבעלי חיים חשובים להבנת מנגנוני המחלה ולניסויים פרה-קליניים של טיפולים חדשים. מספר מודלים של בעלי חיים של אובאיטיס הוקמו2. השניים שנחקרו בהרחבה הם אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (או uveoretinitis; EAU) ואובאיטיס המושרה על ידי אנדוטוקסין (EIU). EAU נוצר בדרך כלל על ידי חיסון עם אנטיגנים עיניים או יכול להתרחש באופן ספונטני כאשר סובלנות מרכזית מופרעת בהיעדר הגן AIRE 3,4. גרסאות אחרות של המודל פותחו מאז 5,6,7 כדי לכלול פפטידים אובאיטוגניים שונים; אלה נבדקו בהרחבה 8,9,10. EAU הוא המודל העיקרי לצורות של אובאיטיס אוטואימונית תלוית תאי T כגון מחלת ווגט-קויאנאגי-הראדה וכוריורטיניטיס ציפורים בבני אדם. EIU נוצר על ידי הזרקה מערכתית או מקומית של ליפופוליסכריד חיידקי (LPS)10,11. EIU שימש כמודל של אובאיטיס חריפה הנוצרת על ידי הפעלת מסלולי איתות מולדים של מערכת החיסון12. שני המודלים סייעו להבנה הנוכחית של אימונולוגיה של העין, אך שניהם אינם מודלים יעילים לאובאיטיס כרונית פוסט-זיהומית. מודל Primed Mycobacterial Uveitis (PMU), שהוקם לאחרונה בעכברים, מספק כעת גישה לחקור ולהעריך היבטים קליניים ותאיים של צורה זו של אובאיטיס13.
קיימת שכיחות גבוהה של זיהום מיקובקטריאלי ברחבי העולם, עם למעלה מ-10 מיליון מקרים חדשים ויותר מ-1.4 מיליון מקרי מוות שדווחו על ידי ארגון הבריאות העולמי בשנת 201914. ביטוי אקסטרפולמונרי של זיהום שחפת פעיל (שחפת) כולל אובאיטיס והוא גורם מוכר היטב של אובאיטיס זיהומית15,16. הביטויים של אובאיטיס הקשורה לשחפת הם פרוטאן, אשר ככל הנראה משקף מספר מנגנונים שונים של המחלה הכוללים זיהום ישיר בעיניים, כמו גם דלקת פחות מובנת בתיווך מערכת החיסון17,18,19. המנגנונים המוצעים עבור sequelae פוסט-זיהומיות אלה כוללים תגובה דלקתית כרונית המתעוררת על ידי התמדה של זיהום פאוצ'י-בצילארי באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), תגובה דלקתית כרונית המתעוררת על ידי נוכחות של דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs) כתוצאה מזיהום עיניים שפונה בהצלחה, והפעלה לא הולמת של התגובה החיסונית הנרכשת נגד אנטיגנים עיניים בתהליך של חיקוי מולקולרי או אנטיגן התפשטות הנגרמת על ידי זיהום שחפת מערכתי20,21,22,23.
על מנת להשיג הבנה מכניסטית טובה יותר של אובאיטיס כרונית פוסט-זיהומית ולחקור את תפקידם של אנטיגנים מיקובקטריאליים בייזום מחלות, פותח מודל PMU לשימוש בעכברים13,24. בהתאם לכך, כדי לעורר דלקת, העכבר מקבל תחילה זריקה תת-עורית של אנטיגן מזן השחפת H37Ra המומת בחום כדי לחקות זיהום מערכתי, ולאחר מכן שבעה ימים לאחר מכן הזרקה תוך-גופית של אותו אנטיגן הניתן לעין שמאל או ימין כדי לחקות זיהום מקומי בעיניים. העוצמה והמשך של האובאיטיס הנובעת מכך מנוטרים על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית in vivo אורכית (OCT) והדמיה כספית של העין25. PMU מאופיין בדלקת פאנובאיטיס חריפה ודומיננטית מיאלואידית המתפתחת לאובאיטיס אחורית כרונית דומיננטית של תאי T עם ויטריטיס, דלקת רשתית פריווסקולרית ואזורים מוקדיים של נזק חיצוני לרשתית26. נוכחות של דלקת גרנולומטוס בקטע האחורי של העין מצביעה על כך שניתן להשתמש במודל PMU כדי לחקור כמה צורות של אובאיטיס קדמית (גרנולומטוס ולא גרנולומטוסית) ודלקת ביניים, שנראתה בחולים עם ראיות אימונולוגיות לזיהום Mtb בעבר27. בנוסף, הוצע כי המרכיבים של Mtb המומת בחום המשמשים במודל PMU מעוררים תגובות חיסוניות העומדות בבסיס ההיבטים של אובאיטיס חוזרת בחולים עם שחפת עיניים המגיבים לטיפול נגד שחפת (ATT)28. בשל ההבדלים בהתחלת המחלה ובמסלול הדלקתי בהשוואה ל- EAU ו- EIU, PMU מייצג מודל חייתי חדש של אובאיטיס שאינו תלוי בחיסון עם אנטיגנים עיניים ועשוי לסייע בהבהרת מנגנוני המחלה בחולים עם אובאיטיס כרונית. פרוטוקול זה מתווה את השיטות ליצירת PMU, ניטור המהלך הקליני של דלקת ואיסוף דגימות עיניים לניתוח לאחר המוות עם ציטומטריה של זרימה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-FLUOR</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed</td>
			<td>Akorn Animal Health, IL, USA</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Xylazine 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>8007-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide Needles -25 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide needle -30-G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond MAX, Bond Rx</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol ointment</td>
			<td>Martindale Pharma, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>1% w/w Chloramphenicol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG1150H</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2300</td>
			<td>Bioptigen/Leica</td>
			<td></td>
			<td>OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Incomplete Adjuvant</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>263910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye ointment</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra lyophilized Mycobacteria extract</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton RN Needle (33/12/2)S</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>7803-05(33/12/2)</td>
			<td>33 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>CAL7633-01</td>
			<td>5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td>Exel International, USA</td>
			<td>26029</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset</td>
			<td>Zoetis, USA</td>
			<td>377341</td>
			<td>Ketamine HCL 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA</td>
			<td></td>
			<td>Alternative Imaging/OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil 10 &#181;L syringe</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Intraocular Injection Kit</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>IO-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissection scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td>17478020115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>309602</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine 0.5%</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>1041544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek VIP series</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc.,CA.</td>
			<td></td>
			<td>Histology Tissue Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1%</td>
			<td>Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>Minims</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tylenol</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc, PA, USA</td>
			<td>NDC 50580-614-01</td>
			<td>Acetaminophen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK</td>
			<td></td>
			<td>Carbomer eye gel 0.2% w/w</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis

המונח 'אובאיטיס' מתאר קבוצה הטרוגנית של מצבים שכולם כוללים דלקת תוך עינית. באופן כללי, אובאיטיס מוגדרת על ידי אטיולוגיה: זיהום או אוטואימוניות. אובאיטיס זיהומית דורשת טיפול עם החומרים האנטי מיקרוביאליים המתאימים, בעוד אובאיטיס אוטואימונית דורשת טיפול עם סטרואידים או חומרים מדכאי חיסון אחרים. אובאיטיס פוסט-זיהומית היא צורה של אובאיטיס כרונית הדורשת סטרואידים כדי לשלוט בדלקת החיסונית לאחר ההדבקה הראשונית. אובאיטיס הקשורה לזיהום בשחפת Mycobacterium (Mtb) היא צורה מוכרת היטב של אובאיטיס פוסט-זיהומית, אך מנגנוני המחלה אינם מובנים במלואם. כדי להבין את התפקיד שממלאים אנטיגנים מיקובקטריאליים וליגנדות מולדות בגירוי דלקת עיניים כרונית בעקבות זיהום בשחפת, פותח המודל Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) לשימוש בעכברים. כתב יד זה מתאר את השיטות ליצירת PMU ולניטור המהלך הקליני של דלקת באמצעות פונדוס צבע והדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). PMU מושרה על ידי חיסון עם תמצית מיקובקטריאלית שנהרגה בחום ואחריה הזרקה תוך-גופית של אותה תמצית לעין אחת שבעה ימים לאחר מכן. דלקת עיניים מנוטרת לאורך באמצעות הדמיית in vivo ולאחר מכן איסוף דגימות למגוון רחב של בדיקות, כולל היסטולוגיה, ציטומטריה של זרימה, ניתוח ציטוקינים, qPCR או ריצוף mRNA. מודל העכבר של PMU הוא כלי חדש ושימושי לחקר תגובות העיניים ל- mTB, המנגנון של אובאיטיס כרונית, ולבדיקות יעילות פרה-קליניות של טיפולים אנטי דלקתיים חדשים.

Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לגרימת דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית (PMU) בעכברים. שיטה זו מתארת את השלבים שיעזרו לייצר דלקת עיניים אמינה וחזקה במערכת מודל העכבר. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו עיניים אוביטיות ועיניים של עמיתים לא מודלקים מחיות בודדות לצורך הערכה נוספת עם מבחנים אימונולוגיים, תעתיקיים ופרוטאומיים.

דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית ראשונית (PMU) כמודל לאובאיטיס פוסט-זיהומית

The term 'uveitis' describes a heterogeneous set of conditions that all feature intraocular inflammation. Broadly, uveitis is defined by etiology:  ...

פרוטוקול זה מתווה את השלבים לגרימת דלקת עיניים אמינה וחזקה באמצעות מיקובקטריה מומת בחום במודל העכבר. מודל זה של אובאיטיס מיקובקטריאלית יכול לעזור לחקור את המנגנונים של דלקת עיניים כרונית המתווכת על ידי מערכת החיסון המתפתחת לאחר זיהום מיקובקטריאלי. מודל זה של אובאיטיס כרונית אינו דורש שימוש בזני עכבר ספציפיים או חיסון עם אנטיגנים עיניים.מודל זה מקל על השימוש בקווי עכברים מהונדסים וגנים נוקאאוט במחקרים מכניסטיים של הפתוגנזה של דלקת עיניים. מודל PMU זה יעזור במחקרים הבודקים טיפולים חדשים לדלקת עיניים או אובאיטיס בבני אדם. טיפולים כגון טיפות עיניים חדשות או חומרים מווסתים חיסונית הניתנים באופן סיסטמי יכולים להיבדק ליעילות עם מודל זה.מודל זה יקל על חקר האופן שבו אנטיגנים מיקובקטריאליים המומתים מחום משנים את המיקרו-סביבה של איבר מיוחס למערכת החיסון כמו העין. התוצאות האלה יכולות גם לספק תובנות על האופן שבו סוגים אחרים של זיהום בעיניים משפיעים על העין, או על האופן שבו אתרים מיוחסים למערכת החיסון, כמו המוח, מגיבים לאנטיגנים מיקרובקטריאליים. כדי להתחיל, בטל את הידוק הגוף של יחידת הממיר של Sonicator ונקה את הבדיקה עם ספוגית 70% אלכוהול.לאחר מכן הפעל את Sonicator וכוונן את הגדרת צריכת החשמל לארבע על ידי סיבוב ידית בקרת החשמל. לאחר מכן, כדי ליצור תרחיף עדין של שחפת המיקרובקטריום H37Ra ב-PBS, טבלו את קצה הבדיקה לתוך אבקת המיקרובקטריאלים המכילה PBS. סונו את התערובת על קרח למשך 30 שניות, ואז השהו למשך 30 שניות וחזרו על הפעולה במשך חמש דקות בסך הכל כדי לפזר את האבקה במלואה לתרחיף אחיד מבלי לחמם את הנוזל.לאחר מכן, מוסיפים לתערובת 2.5 מיליליטר של אדג'ובנט לא שלם של פרוינד, וחוזרים על תהליך הסוניקציה על הקרח עד שהתחליב יוצר מרקם דמוי משחת שיניים. עבור הזרקה תת עורית, לטעון 200 עד 300 microliters של תחליב מיקרובקטריאלי במזרק מיליליטר אחד. מוציאים את האוויר מהמזרק וממשיכים למלא את המזרק בהיפוך והקשה לסירוגין עד למילוי.לאחר מכן, הנח את הזריקות התת עוריות על המשטח הגבי של הירכיים או על פני השטח הגחוניים של הרגליים פרוקסימליות לאזור בלוטות הלימפה המפשעות של עכבר C57 שחור 6J מורדם בן 6 עד 10 שבועות. בזהירות להחדיר את המחט, נזהר לא לחדור את השריר, ולהזריק 50 microliters של תחליב לתוך החלל תת עורית. אין להסיר את המחט באופן מיידי כדי לאפשר הזרקה מלאה של האמולסיה.כדי להכין את מלאי האנטיגן להזרקה intravitreal, סוניקו את H37Ra בתמיסת PBS כפי שהוכח קודם לכן, ולאחר מכן aliquot את התמיסה בנפחים של 100 מיקרוליטר ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס. ביום ההזרקה, לאחר אישור עומק ההרדמה הכללית, מרדימים את הקרנית בטיפה אחת של 0.5% טטרקאין ומרחיבים את האישון בטיפה אחת של 2.5% פנילפרין. לאחר סילוק עודפי נוזלים, יש להוסיף טיפה אחת של 5% בטאדין לפני השטח של העין והשיער שמסביבה כדי להפחית את הסיכון לאנדופתלמיטיס.לאחר שתיים עד שלוש דקות, הסר את הבטאדין וכסה את העין בג'ל היפרומלוז 0.3% כדי למנוע יובש תחת הרדמה והיווצרות קטרקט. לאחר מכן, טען מזרק של 10 מיקרוליטר עם תערובת האנטיגן והפלואורסצין, ולאחר מכן הנח את העכבר במצב נוטה על הפלטפורמה והשתמש במוטות האוזן הימנית והשמאלית כדי לתקן את ראש העכבר. מקם וכיוון את העכבר מתחת לטווח כך שהיבט האף העליון של עין ימין נראה לעין.לאחר מכן, באמצעות מחט 30 מד, לעקור את הריסים, לחשוף את סקלרה, ולדמיין את הלימבוס ואת כלי הדם הרדיאלי. לאחר מכן, באמצעות מחט סטרילית 30 מד, לעשות חור מדריך בסקלרה אחד עד שני מילימטר אחורי ללימבוס. לאחר מכן, הכנס את מחט 34 המדידה המחוברת למחזיק ההזרקה לתוך העין, דרך חור המנחה, בזווית שתמנע את העדשה, אך הנח את קצה המחט לתוך חלל הזגוגית.באמצעות בקר משאבת מזרק מיקרו, להזריק בזהירות מיקרוליטר אחד של תמצית M.tuberculosis לתוך חלל הזגוגית. במקרה של ריפלוקס עקבי, הגדל את נפח ההזרקה ל -1.5 מיקרוליטר כדי להבטיח מתן מינון הולם. אשר את המיקום intravitreal על ידי הדמיה רפלקס ירקרק בעין, ולאחר 10 שניות, להסיר את המחט מהעין.לאחר הרדמת העכבר, להרחיב את האישון עם טיפה אחת של 2.5% פנילפרין, הימנעות טיפות עודף נכנס לאף או לפה. לאחר 2-3 דקות, יש למרוח את עודפי הנוזלים ולכסות את העין בג'ל היפרומלוז של 0.3%. לאחר מכן, לעטוף את העכבר בשכבה של גזה כירורגית כדי לשמור על חום הגוף, ולאחר מכן להניח את העכבר על קלטת החיה ולמקם את הראש עם חטיף הנשיכה.כדי לרכוש טומוגרפיה קוהרנטית אופטית או תמונות OCT, הפעל את מערכת ההדמיה OCT ופתח את תוכנת ההדמיה. להדמיית החדר האחורי, קרבו את ה-OCT לפני השטח של העין, תוך הקפדה שלא להביא את פני השטח של העדשה במגע עם העין. לאחר שהעין ממוקמת כראוי, הפסק את הסריקה המהירה, בחר את פרוטוקול סריקת אמצעי האחסון והפעל את הסריקה באמצעות האפשרות מטרה.לתמונות מקטעים אחוריים, התאימו את עצמכם עד שעצב הראייה יהיה ממורכז בתמונת יישור הסריקה האופקית B, והרשתית תהיה מיושרת עם ציר היישור האנכי. לתמונות מקטע קדמי, התאימו את המיקום למרכז הקרנית הן בתמונת היישור האופקית של סריקת B והן בתמונת היישור האנכית של סריקת B. לבסוף, לחץ על Snapshot כדי ללכוד את תמונת סריקת עוצמת הקול, ולאחר מכן לחץ על שמור.24 שעות לאחר ההזרקה התוך-גופית, תאי דלקת נראים בזגוגית המימית והזגוגית. בצקת קרנית, היפופיון, ותאי דלקת רבים שצפים בחופשיות נראים בתא הקדמי, ודלקת ויטריטיס בתא האחורי. ניתן להבקיע את מידת הדלקת בעיניים בתמונות OCT אלה.ציונים משולבים גבוהים מאפס אך פחות מ-2.5 מייצגים דלקת קלה. ציונים גדולים מ-2.5, אך פחות מ-4.5. מייצגים דלקת מתונה, וציונים גבוהים מ-4.5 מזהים דלקת חמורה.ניתן לקבוע את ציוני הדלקת גם באמצעות חמישה מאפיינים הנראים במקטעי כתמי המטוקסילין ואאוזין. ציון החומרה נקבע על ידי ספירת מספר תאי הדלקת בזגוגית המימית והזגוגית. הדמיית פונדוס אורכית של ברייטפילד יכולה גם לזהות דלקת ברשתית ובכלי הדם.עיניים מודלקות קשות מדגימות חדירות לבנות מרובות ברשתית ובטורטואוז כלי הדם בהדמיית פונדוס צבע, כמו גם דלקת ויטריטיס צפופה ובצקת רשתית ב- OCT ביום השני. עיניים מודלקות קלות מדגימות פחות ויותר נגעים ליניאריים דיסקרטיים בפונדוס, ומספר תאים מסתננים בחלל הזגוגית. הבטחת עקביות במהלך זריקות תת עורית ו intravitreal ונקיטת אמצעים מתאימים כדי למנוע התפתחות של אנדופתלמיטיס זיהומיות הם הצעדים העיקריים המסייעים בהצלחה לשכפל מודל זה.ניתן להשתמש בהדמיית ביולומינסנציה in vivo כדי לאפיין דלקת בעוד שבדיקות שלאחר המוות, כמו ריבוי פרמטרים, ניתן לבצע ניתוח ציטומטרי של זרימה כדי לזהות ולכמת אוכלוסיות מסוג תאי חיסון מסתננים. ניתן להשתמש בניתוח ציטוקינים, ריצוף mRNA והדמיית אימונופלואורסצנציה כדי להעריך דפוסי ביטוי של גנים וחלבונים או לזהות אוכלוסיות של תאי חיסון ברשתית באובאיטיס. פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע זריקות הניתנות לשחזור, אספטי וטראומטי מינימלי שיסייעו לחוקרים עתידיים לגשת לחלל התוך-ויטריוני בעכברים.OCT גם ימלא תפקיד חשוב באיתור דלקת עיניים שאחרת עלולה להתפספס על ידי בדיקה חזותית של עיניהם של חיות ניסוי קטנות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

זיהום הניסיון עם<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...