Name: primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

이 연구는 미국 메릴랜드주 베데스다에 있는 국립 보건원(KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW 비전 연구 핵심 보조금(NEI P30EY01730), Mark Daily, MD 연구 기금 및 Christopher and Alida Latham 연구 기금의 선물, 실명 예방 연구의 무제한 부서 보조금, 실명 예방 연구(KP)의 경력 개발 상. 브리스톨에서 수행 된 작업은 Sight Research UK와 The Underwood Trust의 추가 자금으로 지원되었습니다.

저자는 공개 할 재정적 갈등이 없습니다.

포도막염의 동물 모델은 안구 염증 및 항상성의 메커니즘을 이해하고 포도막염 환자에 대한 의료 및 수술 요법의 전임상 평가를 가능하게 하는 데 중요한 역할을 했습니다37. PMU 모델의 토끼 및 래트 변이체 모두 개념 증명 연구 38,39,40을 통해 전임상 치료에서 그 가치를 입증했습니다. 마우스에서 다양한 범위의 형질전환 균주를 사용할 수 있기 때문에 마우스 PMU 모델 시스템을 구축하면 이제 이 질병의 병리에 기여하는 특정 세포 유형, 경로 및 유전자를 식별하기 위한 보다 상세한 기계론적 연구가 가능합니다.
포도막염의 동물 모델은 염증의 발생률 및 강도에서 동물 대 동물 가변성을 입증할 수 있다(41). C57BL/6 마우스 균주에서 PMU는 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 안정적으로 생성됩니다. 포도막염 경과 및 강도의 균주 별 변화는 EAU 및 EIU42,43 모두에 대해보고되었습니다. PMU의 중증도 및 경과에 대한 균주 특이적 영향은 실험적으로 측정되지 않았지만 이 모델은 야생형 C57BL/6J와 알비노 마우스(B6(Cg)-Tyrc-2J/J)에서 사용되어 유사한 염증 반응을 일으켰습니다. PMU 모델을 생성할 때 아래 나열된 고려 사항을 제어하면 새로운 연구원이 변동성을 제한하고 가장 일관되고 재현 가능한 포도막염을 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다.
피하 주사의 일관성 보장 : 일관된 피하 주사를 제공하려면 에멀젼에서 모든 기포가 제거되었는지 확인하십시오. 고려 사항에는 주사기를 로드하기 전에 미리 만들어진 에멀젼의 짧은 원심분리기(400 x g에서 30초)가 포함됩니다. 이렇게하면 에멀젼에 갇힌 공기가 제거됩니다. 또한 주사기를 넣을 때 주기적으로 뒤집어 (tip-up) 주사기를 두드려 기포를 제거하십시오. 주사하는 동안 근육 주사를 피하기 위해 주사기를 너무 깊게 두지 마십시오. 반대로, 얕은(피내) 주사는 피부를 통한 에멀젼의 침식을 초래할 수 있다. 두꺼운 점성 에멀젼을 완전히 주입하고 피부에서 역류를 방지하기 위해 주사 부위에서 주사기를 제거하기 전에 잠시 멈추는 것을 잊지 마십시오.
피하 주사를 놓은 지 7 일 후, 뒷다리의 양쪽에 만져지는 결절이 있는지 확인하십시오. 결절을 확인할 수 없으면 에멀젼이 아닌 공기가 주입되었을 가능성이 있습니다. 이 경우 급성 염증이 강력하지 않을 수 있으며 만성 염증이 발생하지 않을 수 있습니다.
감염성 안구 내염의 발병을 예방하십시오 : 박테리아 또는 진균성 안구내염은 예방되지 않으면 교란 변수를 생성합니다44. 세균성 안구내염을 예방하려면 유리체내 현탁액을 만들 때 항상 좋은 무균 기술을 연습하고, 눈에 닿을 모든 재사용 가능한 도구를 취급하고 청소하십시오. 멸균 일회용 품목을 사용하거나 오토클레이브를 하거나 95% 알코올 세척 또는 물티슈로 청소하는 것이 중요합니다. 안구 표면, 눈꺼풀 및 안구 주위 모피에 적용된 베타딘의 적절한 사용은 또한 안구내염45를 예방하는 데 도움이 됩니다. 주사 후 과정에서 극심한 염증으로 안구 구조가 지워지기 때문에 감염된 눈을 인식하는 것은 간단합니다. PMU에서는 일반적이지 않습니다. 안내 출혈의 존재는 또한 주사로 인한 안구 내염 또는 외상을 암시 할 수 있습니다. 그러한 경우이 동물들을 연구에서 제외하십시오.
유리체 내 주사의 일관성 보장 : 유리체내 주사는 PMU에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 염증을 유도하는 데 중요한 단계입니다. 각 주사로 일정한 양의 Mtb 현탁액을 제공하고, 외상을 피하고, 현탁액의 역류를 방지하는 것은 주사를 수행할 때 고려해야 하는 모든 요소입니다. 일관된 현탁액을 보장하려면 해동 시 그리고 주사기에 넣기 전에 스톡 현탁액을 완전히 와동하십시오. 사용된 이 Mtb 추출물은 용액을 형성하지 않기 때문에, 현탁액은 시간이 지남에 따라 침강될 수 있다. 각 주사에서 Mtb 추출물의 균일한 농도를 보장하려면 로딩 후 15분 이내에 주사기를 사용하거나 배출하고 다시 로드하십시오. Phenylephrine은 뒤쪽 눈에 더 큰 시야를 제공하고 주사 중 눈에 대한 외상의 위험을 줄이기 위해 확장에 사용됩니다. 이 방울은 자연스러운 눈꺼풀 수축과 지구의 약간의 돌출을 생성하여 집게로 눈을 잡을 필요없이 윤부 뒤쪽 1-2mm 영역을 잘 시각화 할 수 있습니다. 눈을 억제하기 위해 집게를 사용하면 잠재적인 외상을 유발할 수 있으며 일시적으로 안압을 높이고 Mtb 현탁액의 역류 위험을 높일 수 있습니다. 외상은 또한 눈에 너무 많은 양을 주입하려고 시도함으로써 발생할 수 있습니다. 주사량은 2μL로 제한되어 안압의 현저하고 장기간의 상승과 눈의 외상을 방지합니다. 또한 어린 동물은 성인 생쥐보다 작은 눈을 갖습니다. 일반적으로 6-8 주 마우스 (20-25g)는 균일 한 눈 크기를 제공하고 Mtb 주사 후 염증에서 더 큰 일관성을 보장합니다. 마이코박테리아 현탁액의 주사 후 역류의 더 높은 빈도가 더 작은 마우스에서 관찰되었습니다. 이것은 차례로 예상보다 적은 급성 염증을 유발합니다. 희석된 fluorescein 용액은 초보자 주입기에게 주입 기술의 성공에 대한 시각적 피드백을 제공하는 데 사용됩니다. 주사시 팽창은 유리체강에 주입 된 물질을 직접 시각화하고 렌즈 외상의 증거를 기록 할 수있는 기회를 제공합니다. 수정체 외상의 경우 수정체 선명도가 변화하여 백내장이 발생하여 OCT에서 시각화할 수 있습니다. 안구 외상의 경우, 렌즈로 유발 된 포도막염46의 가능성 때문에 눈을 연구에서 제외해야합니다. 눈에서 주사기를 제거하기 전에 10초 동안 일시 중지하여 눈 안에 Mtb 현탁액이 분산되고 역류를 줄이는 것이 좋습니다.
PMU 모델은 유리체내 주사에서 Mtb의 농도를 변화시킴으로써 급성 염증의 강도를 변화시키도록 수정될 수 있다. 2.5 μg/μL에서 15 μg/μL에 이르는 다양한 용량이 이전에 당사 실험실에서 테스트되었습니다. 그러나 10μg/μL보다 높은 용량은 자발적인 수정체 파열, 심한 각막 부종 및 흉터, hyphema를 포함한 심각한 눈 손상을 유발하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 정도의 중증도는 감염 후 포도막염이있는 인간 환자에게는 전형적이지 않으므로 이러한 농도는 권장되지 않습니다. 5 μg / μL 용량은 경증에서 중등도의 급성 염증 및 경증 만성 포도막염을 안정적으로 생성하는 것으로 밝혀졌습니다. 10 μg/μL 용량은 신뢰할 수 있는 중등도에서 중증의 급성 질환 및 더 주목할만한 만성 질환을 생성합니다. 따라서, 유리체내 농도를 변화시키는 것은 실험적 질문에 기초하여 필요에 따라 사용하기 위한 대안적인 질환 중증도를 제공할 수 있다. 결과가 피하 또는 유리체 내 주사와 관련된 외상이 아닌 mTB에 대한 반응으로 인한 것인지 확인하기 위해 대조군을 선택해야 합니다. 가짜 주사 대조군에서는 mTB 추출물 대신 PBS를 사용할 수 있습니다. 노출되지 않은 동물과의 비교를 위해, 동료 눈이 항상 동등하지는 않기 때문에 진정한 순진한 샘플을 고려해야합니다.
마우스 눈의 크기가 작기 때문에 OCT는 직접 시각화 또는 현미경 명시야 사진보다 전방의 염증을 감지하는 데 더 민감한 분석이 될 수 있습니다. 쥐25에서 PMU에 대한 이전 연구는 OCT보다 조직학에 의해 더 많은 세포가 검출 될 수 있지만 두 양식 사이에 좋은 상관 관계가 있음을 결정했다. OCT는 동일한 동물에서 종방향으로 염증을 모니터링하는 데 사용할 수 있다는 추가적인 이점이 있습니다. EAU 및 EIU와 같은 포도막염의 다른 주요 마우스 모델도 정량 분석을 위해 OCT를 사용했습니다 12,47,48. 마우스의 PMU 모델에서 전방 세포는 OCT에서만 볼 수 있으며 큰 하이포피온이 존재하지 않는 한 임상 검사에서 볼 수 없습니다. 유리체 염증 (유리체염)은 컬러 안저 영상으로 관찰 할 수 있지만 정량적 변화를 감지하는 것은 OCT 영상에서만 가능합니다. 망막 혈관 염증 및 망막 손상과 같은 모델의 다른 측면은 OCT 및 현미경 명시야 안저 사진으로 쉽게 식별할 수 있습니다.
OCT를 사용할 때 국소 영상이 염증 정도의 지역적 차이에 의해 어떻게 영향을 받을 수 있는지 고려하는 것이 중요합니다. 이전 보고서에 따르면 인간의 전방에서 세포의 고르지 않은 분포가 확인되었으며 더 많은 세포가 열등하게 위치합니다49. 마우스에서는 비슷한 소인이 흔합니다. 따라서 AC를 통한 수직 또는 방사형 스캔은 염증 범위를 캡처하는 이미지를 보장하는 데 도움이 됩니다. 또한 동일한 위치에서 이미징을 수행하면 동일한 눈에서 세로로 수집된 이미지에 일관성이 제공됩니다. 눈의 같은 부분에서 이미지를 얻으려면 안정적인 랜드 마크와 체계적인 접근 방식을 사용하십시오. 전방 챔버 이미지의 경우, 이미지는 각막의 정점에 바로 인접한 중앙에 배치되고 수직으로 배향되어 열등한 각도에서 하이포 피온의 존재를 감지 할 수 있습니다. 후방 세그먼트 이미지의 경우 이미지는 시신경의 중심에 있습니다. 지역 변동성을 캡처하기 위해 점수 매기기에 최소 3개의 라인 스캔을 사용하는 것이 좋습니다. 염증이 주변 위치로 제한되는 경우 볼륨 스캔을 획득하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 볼륨 스캔 수집은 지역적 차이를 캡처하는 데 도움이 될 수 있지만 데이터 스토리지 요구 사항을 증가시킵니다.
PMU 마우스 모델에서 염증을 특성화하는데 사용될 수 있는 다른 생체내 분석은 생물발광 영상화13,35를 포함한다. 다중 파라미터 유세포 분석과 같은 사후 분석은 눈의 수성 및 후방에서 침윤하는 면역 세포 유형 집단을 식별하고 정량화하기 위해 수행 될 수 있습니다12,26. PMU 모델에서, 급성 염증은 우세한 호중구 침윤물을 갖는 선천적 반응을 특징으로 하며, 이어서 한 달 이상 지속되는 만성 및 지속적인 적응 T 세포 우성 반응이 뒤따른다35. 사후 조직에서 수행할 수 있는 면역 기능의 다른 분석에는 안구 유체 사이토카인 분석이 포함됩니다. 또한 mRNA 시퀀싱 및 면역 형광 이미징과 같은 다른 다운 스트림 분석을 사용하여 포도막염50,51에서 망막 면역 세포 집단의 유전자 및 단백질 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.
PMU 모델은 다른 종에 적합한 적응을 사용하여 다른 설치류 시스템에서 복제 될 수 있습니다. PMU 모델은 이전에 래트 및 토끼38,39,40에서 사용되었다. 쥐에서 급성 panuveitis는 조직학에 의한 만성 염증의 징후를 일으키지 않고 14 일 동안 자발적으로 해결되는 유리체 내 주사 후 발생합니다24. 토끼에서 포도막염 유도는 유리체 내 주사 전에 두 차례의 피하 주사를 사용하지만 강력한 범포도막염을 생성합니다. 마우스 모델 사용의 장점 중 하나는 포도막염52의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수있는 수많은 형질 전환 및 녹아웃 균주를 즉시 사용할 수 있다는 것입니다. 모든 설치류 모델은 제제가 전신적으로 또는 국소 적하로서 투여되는 경우 전임상 요법 시험에 사용될 수 있다. 그러나 크기가 크기 때문에 쥐와 토끼 눈은 포도막염에 대한 이식형 또는 국소 주사 치료 옵션에 대한 전임상 연구에 사용하기에 더 나은 모델입니다.
요약하면,이 프로토콜은 만성 안구 염증의 메커니즘을 연구하는 데 관심이있는 연구자에게 안구 항원에 대한 사전 면역에 의존하지 않는 새로운 도구를 제공합니다.

용어 '포도막염'은 모두 안구내 염증을 특징으로 하는 이질적인 일련의 상태를 설명합니다1. 포도막염의 동물 모델은 질병 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법의 전임상 테스트에 중요합니다. 포도막염의 많은 동물 모델이 확립되었다2. 가장 광범위하게 연구 된 두 가지는 실험적 자가면역 포도막염(또는 포도막염; EAU) 및 내 독소 유발 포도막염 (EIU). EAU는 일반적으로 안구 항원을 이용한 면역화에 의해 생성되거나 AIRE 유전자 3,4가 없을 때 중심 내성이 중단될 때 자발적으로 발생할 수 있습니다. 모델의 다른 변이체는 이후상이한 포도막 생성 펩티드를 포함하도록 5,6,7로 개발되었다; 이것들은 광범위하게 검토되었습니다 8,9,10. EAU는 인간에서 Vogt-Koyanagi-Harada 병 및 조류 화상 맥락 망막염과 같은 T 세포 의존성자가 면역 포도막염의 형태에 대한 주요 모델입니다. EIU는 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 전신 또는 국소 주사에 의해 생성됩니다 10,11. EIU는 선천성 면역 신호 전달 경로12의 활성화에 의해 생성되는 급성 포도막염의 모델로 사용되었습니다. 두 모델 모두 안구 면역학에 대한 현재의 이해에 중요한 역할을했지만 감염 후 만성 포도막염에 효과적인 모델은 아닙니다. 최근 마우스에서 확립 된 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU) 모델은 이제 이러한 형태의 포도막염13의 임상 적 및 세포 측면을 조사하고 평가하는 접근법을 제공합니다.
전 세계적으로 마이코박테리아 감염의 유병률이 높으며 2019년 세계보건기구(WHO)에서 보고한 1,000만 건 이상의 새로운 사례와 140만 명 이상의 사망자가 보고되었습니다14. 활동성 결핵 (TB) 감염의 폐외 증상은 포도막염을 포함하며 감염성 포도막염15,16의 잘 알려진 원인입니다. 결핵 관련 포도막염의 증상은 프로테아이며, 이는 직접적인 안구 감염뿐만 아니라 잘 이해되지 않은 면역 매개 염증17,18,19를 포함하는 질병의 여러 별개의 메커니즘을 반영할 가능성이 있습니다. 이러한 감염 후 후유증에 대해 제안된 메커니즘에는 망막 색소 상피(RPE)에서 파우시세균 감염의 지속성에 의해 자극되는 만성 염증 반응, 성공적으로 제거된 안구 감염으로부터 잔류 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)의 존재에 의해 자극되는 만성 염증 반응, 분자 모방 또는 항원 과정을 통한 안구 항원에 대한 적응 면역 반응의 부적절한 활성화가 포함됩니다. 전신 결핵 감염으로 인한 확산20,21,22,23.
만성 감염 후 포도막염에 대한 더 나은 기계론적 이해를 얻고 질병 시작에서 마이코박테리아 항원의 역할을 연구하기 위해 PMU 모델이 마우스13,24에서 사용하도록 개발되었습니다. 따라서, 염증을 유도하기 위해, 마우스는 먼저 전신 감염을 모방하기 위해 열 사멸된 결핵균 H37Ra 균주로부터 항원의 피하 주사를 받고, 이어서 7일 후 국소 안구 감염을 모방하기 위해 왼쪽 또는 오른쪽 눈에 투여된 동일한 항원의 유리체내 주사를 받는다. 이어지는 포도막염의 강도 및 지속 기간은 종방향 생체 내 광학 간섭 단층 촬영 (OCT) 및 눈의 기저 영상화에 의해 모니터링된다(25). PMU는 유리체염, 혈관주위 망막 염증 및 망막외 손상의 초점 영역을 동반한 만성 T 세포 우성 후방 포도막염으로 발전하는 급성 골수성 우성 범포도막염을 특징으로 합니다26. 눈의 후방 부분에서 육아 종성 염증의 존재는 PMU 모델이 과거 Mtb 감염의 면역 학적 증거가있는 환자에서 볼 수있는 일부 형태의 전방 (육아 종성 및 비 육아 종성) 및 중간 포도막염을 연구하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다27. 또한 PMU 모델에 사용 된 열 사멸 Mtb 성분은 항 결핵 요법 (ATT)28에 반응하는 안구 결핵 환자의 재발 성 포도막염 측면의 기저에있는 면역 반응을 유발하는 것으로 제안되었습니다. EAU 및 EIU와 비교할 때 질병 개시 및 염증 과정의 차이로 인해 PMU는 안구 항원 면역에 의존하지 않고 만성 포도막염 환자의 질병 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 포도막염의 새로운 동물 모델을 나타냅니다. 이 프로토콜은 PMU를 생성하고, 염증의 임상 경과를 모니터링하고, 유세포 분석을 통한 사후 분석을 위한 안구 샘플을 수집하는 방법을 간략하게 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-FLUOR</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed</td>
			<td>Akorn Animal Health, IL, USA</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Xylazine 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>8007-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide Needles -25 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide needle -30-G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond MAX, Bond Rx</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol ointment</td>
			<td>Martindale Pharma, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>1% w/w Chloramphenicol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG1150H</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2300</td>
			<td>Bioptigen/Leica</td>
			<td></td>
			<td>OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Incomplete Adjuvant</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>263910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye ointment</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra lyophilized Mycobacteria extract</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton RN Needle (33/12/2)S</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>7803-05(33/12/2)</td>
			<td>33 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>CAL7633-01</td>
			<td>5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td>Exel International, USA</td>
			<td>26029</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset</td>
			<td>Zoetis, USA</td>
			<td>377341</td>
			<td>Ketamine HCL 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA</td>
			<td></td>
			<td>Alternative Imaging/OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil 10 &#181;L syringe</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Intraocular Injection Kit</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>IO-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissection scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td>17478020115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>309602</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine 0.5%</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>1041544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek VIP series</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc.,CA.</td>
			<td></td>
			<td>Histology Tissue Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1%</td>
			<td>Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>Minims</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tylenol</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc, PA, USA</td>
			<td>NDC 50580-614-01</td>
			<td>Acetaminophen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK</td>
			<td></td>
			<td>Carbomer eye gel 0.2% w/w</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis

'포도막염'이라는 용어는 모두 안내 내 염증을 특징으로하는 이질적인 일련의 상태를 설명합니다. 대체로 포도막염은 병인학에 의해 정의됩니다 : 감염 또는자가 면역. 감염성 포도막염은 적절한 항균제로 치료해야 하는 반면, 자가면역 포도막염은 코르티코스테로이드 또는 기타 면역억제제로 치료해야 합니다. 감염 후 포도막염은 초기 감염 후 면역 후유증을 조절하기 위해 코르티코스테로이드가 필요한 만성 포도막염의 한 형태입니다. 결핵균 (Mtb) 감염과 관련된 포도막염은 잘 알려진 형태의 감염 후 포도막염이지만 질병의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. mTB 감염 후 만성 안구 염증을 자극하는 데 마이코박테리아 항원과 선천성 리간드가 하는 역할을 이해하기 위해 마우스에 사용하기 위해 프라이밍된 마이코박테리아 포도막염(PMU) 모델이 개발되었습니다. 이 원고는 PMU를 생성하고 컬러 안저 및 광학 간섭 단층 촬영 (OCT) 영상을 사용하여 염증의 임상 경과를 모니터링하는 방법을 설명합니다. PMU는 열 사멸 마이코박테리아 추출물로 면역화한 후 7일 후 동일한 추출물을 한쪽 눈에 유리체내 주사하여 유도됩니다. 안구 염증은 생체 내 이미징을 사용하여 종단적으로 모니터링한 다음 조직학, 유세포분석, 사이토카인 분석, qPCR 또는 mRNA 시퀀싱을 포함한 광범위한 분석을 위한 샘플 수집을 수행합니다. PMU의 마우스 모델은 mTB에 대한 안구 반응, 만성 포도막염의 메커니즘을 연구하고 새로운 항염증 요법의 전임상 효과 테스트에 유용한 새로운 도구입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis at JoVE.com

Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis

이 프로토콜은 마우스에서 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU)을 유도하는 단계를 설명합니다. 이 방법은 마우스 모델 시스템에서 신뢰할 수 있고 강력한 안구 염증을 생성하는 데 도움이 되는 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 면역학, 전사 및 단백질체학 분석을 통한 추가 평가를 위해 단일 동물에서 포도막 눈과 염증이 없는 동료 눈을 생성했습니다.

감염 후 포도막염의 모델로서의 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 (PMU)

The term 'uveitis' describes a heterogeneous set of conditions that all feature intraocular inflammation. Broadly, uveitis is defined by etiology:  ...

이 프로토콜은 마우스 모델에서 열 사멸 마이코박테리아를 사용하여 신뢰할 수 있고 강력한 안구 염증을 유도하는 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 모델은 마이코 박테리아 감염 후 발생하는 만성 면역 매개 안구 염증의 메커니즘을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 만성 포도막염의이 모델은 특정 마우스 균주의 사용 또는 안구 항원 면역을 필요로하지 않습니다.이 모델은 안구 염증의 발병 기전에 대한 기계 론적 연구에서 트랜스 제닉 및 유전자 녹아웃 마우스 라인의 사용을 용이하게합니다. 이 PMU 모델은 인간의 안구 염증 또는 포도막염에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 연구에 도움이 될 것입니다. 새로운 안약 또는 전신 투여 면역 조절제와 같은 치료법은이 모델로 효능을 테스트 할 수 있습니다.이 모델은 열 사멸 마이코 박테리아 항원이 눈과 같은 면역 특권 기관의 미세 환경을 어떻게 변화시키는 지 연구하는 것을 용이하게 할 것입니다. 이러한 결과는 또한 다른 유형의 안구 감염이 눈에 어떤 영향을 미치는지 또는 뇌와 같은 면역 특권 부위가 미생물 항원에 어떻게 반응하는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 초음파 처리기 변환기 장치의 본체를 풀고 70 % 알코올 면봉으로 프로브를 청소하십시오.그런 다음 초음파 처리기를 켜고 전원 제어 노브를 돌려 전원 설정을 4로 조정합니다. 다음으로, PBS에서 결핵균 H37Ra의 미세 현탁액을 생성하려면 프로브의 팁을 PBS 함유 미생물 분말에 담그십시오. 혼합물을 얼음에 30 초 동안 초음파 처리 한 다음 30 초 동안 일시 중지하고 총 5 분 동안 반복하여 액체를 가열하지 않고 분말을 균일 한 현탁액으로 완전히 분산시킵니다.다음으로, 혼합물에 2.5 밀리리터의 Freund의 불완전 보조제를 첨가하고, 에멀젼이 치약과 같은 일관성을 형성 할 때까지 얼음에서 초음파 처리 과정을 반복하십시오. 피하 주사의 경우, 200 내지 300 마이크로리터의 마이크로박테리아 에멀젼을 1 밀리리터 주사기에 로딩한다. 주사기에서 공기를 배출하고 채워질 때까지 간헐적 인 반전 및 두드리기로 주사기를 계속 채 웁니다.다음으로, 마취된 6-10주령 C57 검정 6J 마우스의 사타구니 림프절 영역에 근접한 다리의 복부 표면 또는 엉덩이의 등쪽 표면 또는 다리의 복부 표면에 피하 주사를 놓습니다. 근육에 침투하지 않도록주의하면서 바늘을 조심스럽게 삽입하고 50 마이크로 리터의 에멀젼을 피하 공간에 주입하십시오. 두꺼운 에멀젼이 완전히 주입 될 수 있도록 바늘을 즉시 제거하지 마십시오.유리체 내 주사를 위한 항원 스톡을 준비하려면 이전에 시연된 대로 PBS 용액에서 H37Ra를 초음파 처리한 다음 용액을 100마이크로리터 부피로 분취하고 섭씨 20도에서 보관합니다. 주사 당일에 전신 마취의 깊이를 확인한 후 0.5 % 테트라 카인 한 방울로 각막을 마취시키고 2.5 % 페닐에 프린 한 방울로 동공을 확장시킵니다. 과도한 액체를 제거한 후 눈 표면과 주변 모발에 5% 베타딘 한 방울을 추가하여 안구내염의 위험을 줄입니다.2-3 분 후 Betadine을 제거하고 0.3 % 하이 프로 멜로 오스 젤로 눈을 덮어 마취 및 백내장 형성시 건조를 방지합니다. 그런 다음 항원과 플루오레세인 혼합물이 포함된 10마이크로리터 주사기를 로드한 다음 마우스를 플랫폼의 엎드린 위치에 놓고 오른쪽 및 왼쪽 이어바를 사용하여 마우스 헤드를 고정합니다. 오른쪽 눈의 상비강이 보이도록 마우스를 스코프 아래에 배치하고 방향을 지정합니다.그런 다음 30게이지 바늘을 사용하여 속눈썹을 옮기고 공막을 노출하고 윤부와 요골 혈관을 시각화합니다. 다음으로, 멸균 된 30 게이지 바늘을 사용하여 윤부 뒤쪽 1-2 밀리미터의 공막에 가이드 구멍을 만듭니다. 그런 다음 주입 홀더에 부착 된 34 게이지 바늘을 가이드 구멍을 통해 렌즈를 피할 수있는 각도로 눈에 삽입하되 바늘 끝을 유리체에 넣습니다.마이크로 주사기 펌프 컨트롤러를 사용하여 M.tuberculosis 추출물 1 마이크로 리터를 유리체에 조심스럽게 주입합니다. 지속적인 역류의 경우 적절한 용량 전달을 보장하기 위해 주입량을 1.5 마이크로 리터로 늘리십시오. 눈의 녹색 반사를 시각화하여 유리체 내 배치를 확인하고 10 초 후에 눈에서 바늘을 제거하십시오.마우스를 마취 한 후 2.5 % 페닐에 프린 한 방울로 동공을 확장시켜 과도한 물방울이 코 나 입에 들어 가지 않도록하십시오. 2-3 분 후, 여분의 액체를 두드리고 0.3 % 하이 프로 멜로 오스 젤로 눈을 덮으십시오. 그런 다음 마우스를 수술 용 거즈 층으로 감싸서 몸의 따뜻함을 유지 한 다음 마우스를 동물 카세트에 놓고 바이트 바가있는 머리를 놓습니다.광학 간섭 단층 촬영 또는 OCT 이미지를 얻으려면 OCT 이미징 시스템을 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 후방 챔버 이미징의 경우 OCT를 눈 표면에 가깝게 가져오고 렌즈 표면이 눈에 닿지 않도록 주의하십시오. 눈의 위치가 올바르게 지정되면 빠른 스캔을 중지하고 볼륨 스캔 프로토콜을 선택한 다음 조준 옵션으로 스캔을 활성화합니다.후방 세그먼트 이미지의 경우 시신경이 수평 B 스캔 정렬 이미지의 중앙에 있고 망막이 수직 정렬 축과 정렬될 때까지 조정합니다. 전방 세그먼트 이미지의 경우 수평 B-스캔 정렬 이미지와 수직 B-스캔 정렬 이미지 모두에서 각막의 정점을 중앙에 배치하도록 위치를 조정합니다. 마지막으로 Snapshot을 클릭하여 볼륨 스캔 이미지를 캡처한 다음 저장을 클릭합니다.유리체내 주사 24시간 후, 염증 세포는 수성 및 유리체에서 보인다. 각막 부종, hypopyon 및 여러 개의 자유 부유 염증 세포가 전방에서 보이고 후방에서 유리체염이 보입니다. 안구 염증의 정도는 이러한 OCT 이미지에서 점수를 매길 수 있습니다.0보다 크지만 2.5보다 작은 점수를 합친 것은 경미한 염증을 나타냅니다. 점수는 2.5보다 크지만 4.5보다 작습니다. 는 중등도의 염증을 나타내며 4.5보다 큰 점수는 심각한 염증을 나타냅니다.염증 점수는 또한 헤마톡실린 및 에오신 염색 섹션에서 볼 수 있는 5가지 특성을 사용하여 결정할 수 있습니다. 중증도 점수는 수성 및 유리체에서 염증 세포의 수를 세는 것에 의해 결정된다. 명시야 종단 안저 영상은 또한 망막 및 혈관 주위 염증을 식별할 수 있습니다.심하게 염증이 있는 눈은 망막에 여러 개의 흰색 침윤과 컬러 안저 영상에서 혈관 비틀림을 나타내며, 둘째 날에는 10월째에 치밀한 유리염과 망막 부종이 나타납니다. 경미하게 염증이있는 눈은 안저에서 점점 더 신중한 선형 병변을 보이고 유리체 공간에 많은 침투 세포를 나타냅니다. 피하 및 유리체 내 주사 중 일관성을 보장하고 감염성 안구 내염의 발병을 예방하기위한 적절한 조치를 취하는 것이이 모델을 성공적으로 복제하는 데 도움이되는 핵심 단계입니다.생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 염증을 특성화할 수 있으며, 다중 파라미터와 같은 사후 분석을 수행하여 침윤 면역 세포 유형 집단을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 사이토카인 분석, mRNA 시퀀싱 및 면역형광 이미징을 사용하여 포도막염에서 유전자 및 단백질 발현 패턴을 평가하거나 망막 면역 세포 집단을 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 미래의 연구자가 마우스의 유리체 내 공간에 접근하는 데 도움이 될 재현 가능한 무균 및 최소 외상 주사를 수행하는 방법을 보여줍니다.OCT는 또한 작은 실험 동물의 눈을 육안으로 검사하여 놓칠 수 있는 안구 염증을 감지하는 데 중요한 역할을 합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

연구

면역학 및 감염병학

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

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유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

기능 리포터 시스템으로 특정 진 균의 오 번역 비율 측정

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...