Name: primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
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Este trabajo está respaldado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, Estados Unidos (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, subvención central de investigación de visión de la UW (NEI P30EY01730), donaciones del Mark Daily, MD Research Fund y el fondo de investigación Christopher y Alida Latham, una subvención departamental sin restricciones de Research to Prevent Blindness y un premio de desarrollo profesional de Research to Prevent Blindness (KP). El trabajo realizado en Bristol fue apoyado por fondos adicionales de Sight Research UK y The Underwood Trust.

Los autores no tienen conflictos financieros que revelar.

Los modelos animales de uveítis han sido fundamentales para comprender los mecanismos de inflamación ocular y homeostasis, así como para permitir la evaluación preclínica de terapias médicas y quirúrgicas para pacientes con uveítis37. Tanto las variantes de conejo como de rata del modelo PMU han demostrado su valor en la terapia preclínica a través de estudios de prueba de concepto38,39,40. Debido a la disponibilidad de una amplia gama de cepas transgénicas en ratones, el establecimiento del sistema modelo PMU de ratón ahora permite estudios mecanicistas más detallados para identificar tipos específicos de células, vías y genes que contribuyen a la patología de esta enfermedad.
Los modelos animales de uveítis pueden demostrar variabilidad animal a animal en la incidencia e intensidad de la inflamación41. En la cepa de ratón C57BL/6, la PMU se genera de forma fiable utilizando el protocolo descrito aquí. Se han reportado variaciones específicas de la cepa en el curso y la intensidad de la uveítis tanto para EAU como para EIU42,43. Si bien los impactos específicos de la cepa sobre la gravedad y el curso de PMU no se han medido experimentalmente, este modelo se ha utilizado en C57BL / 6J de tipo salvaje, así como en ratones albinos (B6 (Cg)-Tyrc-2J / J) y produjo respuestas inflamatorias similares. Al generar el modelo PMU, controlar las consideraciones enumeradas a continuación puede ayudar a los nuevos investigadores a limitar la variabilidad y producir la uveítis más consistente y reproducible.
Asegurar la consistencia en las inyecciones subcutáneas: Para proporcionar una inyección subcutánea consistente, asegúrese de que todas las burbujas de aire se eliminen de la emulsión. Las consideraciones incluyen una centrífuga corta (30 s a 400 x g) de la emulsión prefabricada antes de cargar la jeringa. Esto eliminará el aire atrapado en la emulsión. Además, al cargar la jeringa, invierta periódicamente (punta) y golpee la jeringa para eliminar cualquier burbuja de aire. Durante la inyección, no coloque la jeringa demasiado profundo para evitar la inyección intramuscular. Por el contrario, una inyección superficial (intradérmica) puede provocar la erosión de la emulsión a través de la piel. Recuerde hacer una breve pausa antes de retirar la jeringa del lugar de inyección para asegurar la inyección completa de la emulsión viscosa espesa y para evitar el reflujo de la piel.
Siete días después de colocar la inyección subcutánea, confirme la presencia de nódulos palpables a ambos lados de las patas traseras. Si no se pueden identificar nódulos, es posible que se haya inyectado aire en lugar de emulsión. En este caso, la inflamación aguda puede no ser tan robusta, y la inflamación crónica puede no desarrollarse.
Prevenir el desarrollo de endoftalmitis infecciosa: La endoftalmitis bacteriana o fúngica generará una variable de confusión si no se previene44. Para prevenir la endoftalmitis bacteriana, siempre practique una buena técnica aséptica al hacer la suspensión intravítrea, manipule y limpie todas las herramientas reutilizables que entrarán en contacto con el ojo. Es importante usar artículos estériles de un solo uso, esterilizarlos en autoclave o limpiarlos con lavados o toallitas con alcohol al 95%. El uso apropiado de betadina aplicada a la superficie ocular, los párpados y el pelaje periocular también ayudará a prevenir la endoftalmitis45. Es sencillo reconocer un ojo con infección, ya que las estructuras oculares serán borradas por una inflamación extrema durante el curso posterior a la inyección. Esto no es típico de PMU. La presencia de sangrado intraocular también puede sugerir endoftalmitis o traumatismo por la inyección. En tales casos, excluir a estos animales del estudio.
Asegurar la consistencia en la inyección intravítrea: La inyección intravítrea es un paso crítico en la inducción de inflamación confiable y reproducible en PMU. Proporcionar una cantidad constante de suspensión de Mtb con cada inyección, evitar traumatismos y prevenir el reflujo de la suspensión son factores que deben considerarse al realizar las inyecciones. Para garantizar una suspensión consistente, aplique un vórtice a fondo la suspensión de la culata al descongelarla y antes de cargarla en la jeringa. Dado que este extracto de Mtb utilizado no forma una solución, la suspensión puede sufrir sedimentación con el tiempo. Para asegurar una concentración uniforme del extracto de Mtb en cada inyección, use o expulse y vuelva a cargar la jeringa dentro de los 15 minutos posteriores a la carga. La fenilefrina se usa para la dilatación para proporcionar un campo de visión más amplio al ojo posterior y reducir el riesgo de traumatismo en el ojo durante la inyección. Esta caída genera una retracción natural del párpado y una ligera proptosis del globo, permitiendo una buena visualización del área 1-2 mm posterior al limbo sin necesidad de agarrar el ojo con fórceps. El uso de fórceps para restringir el ojo podría causar un trauma potencial y aumentar transitoriamente la presión intraocular y el riesgo de reflujo de la suspensión Mtb. El trauma también puede ser causado por intentar inyectar demasiado volumen en el ojo. El volumen de inyección se limita a 2 μL para evitar una elevación significativa y prolongada de la presión intraocular y un traumatismo en el ojo. Además, los animales más jóvenes tendrán ojos que son más pequeños que los ratones adultos. Normalmente, los ratones de 6-8 semanas (20-25 g) proporcionan un tamaño de ojo uniforme y aseguran una mayor consistencia en la inflamación después de la inyección de Mtb. Se observó una mayor frecuencia de reflujo posterior a la inyección de la suspensión micobacteriana en ratones más pequeños. Esto, a su vez, conduce a una inflamación aguda menos de lo esperado. Se utiliza una solución de fluoresceína diluida para proporcionar al inyector novato información visual sobre el éxito de su técnica de inyección. La dilatación en el momento de la inyección permitirá la visualización directa del material inyectado en la cavidad vítrea y la oportunidad de observar cualquier evidencia de traumatismo del cristalino. En el caso de un traumatismo del cristalino, puede causar un cambio en la claridad del cristalino que causará una catarata que se puede visualizar en la OCT. En el caso de traumatismo ocular, los ojos deben ser excluidos del estudio debido a la posibilidad de uveítis inducida por el cristalino46. Recomendamos hacer una pausa de 10 s antes de retirar la jeringa del ojo para permitir la dispersión de la suspensión Mtb dentro del ojo y disminuir el reflujo.
El modelo PMU se puede modificar para cambiar la intensidad de la inflamación aguda variando la concentración del Mtb en la inyección intravítrea. Diferentes dosis que van desde 2.5 μg / μL a 15 μg / μL se han probado previamente en nuestro laboratorio. Sin embargo, se encontró que dosis superiores a 10 μg / μL causan daño ocular severo, incluida la ruptura espontánea del cristalino, edema corneal severo y cicatrización, e hifema. Este grado de gravedad no es típico en pacientes humanos con uveítis postinfecciosa y, por lo tanto, no se recomiendan estas concentraciones. Se encontró que una dosis de 5 μg / μL produce de manera confiable inflamación aguda leve a moderada y uveítis crónica leve; la dosis de 10 μg/μL produce una enfermedad aguda fiable de moderada a grave y una enfermedad crónica más notable. Por lo tanto, variar la concentración intravítrea puede proporcionar gravedades alternativas de la enfermedad para su uso según sea necesario en función de la pregunta experimental. Los controles deben seleccionarse para garantizar que los resultados se deban a la respuesta a la tuberculosis magnética y no al trauma asociado con las inyecciones subcutáneas o intravítreas. En los controles de inyección simulada, PBS se puede utilizar en lugar del extracto de mTB. Para las comparaciones con animales no expuestos, se deben considerar las verdaderas muestras ingenuas, ya que los ojos compañeros no siempre son equivalentes.
Debido al pequeño tamaño del ojo del ratón, la OCT puede ser un ensayo más sensible para detectar inflamación en la cámara anterior que la visualización directa o la fotografía microscópica de campo brillante. El trabajo previo con PMU en ratas25 determinó que se pueden detectar más células por histología que por OCT, pero que existe una buena correlación entre las dos modalidades. La OCT tiene la ventaja añadida de que se puede utilizar para controlar la inflamación longitudinalmente en el mismo animal. Otros modelos importantes de uveítis en ratones, como EAU y EIU, también han empleado OCT para el análisis cuantitativo 12,47,48. En el modelo PMU de ratones, las células de la cámara anterior solo son visibles en OCT y no se pueden ver en exámenes clínicos a menos que haya un gran hipopión. La inflamación vítrea (vitritis) se puede observar con imágenes de fondo de ojo en color, pero la detección de cambios cuantitativos solo es posible con imágenes de OCT. Otros aspectos del modelo, como la inflamación vascular retiniana y el daño retiniano, se pueden identificar fácilmente con OCT y fotografía microscópica de fondo de ojo de campo claro.
Cuando se usa OCT, es importante considerar cómo las imágenes localizadas pueden verse afectadas por las diferencias regionales en el grado de inflamación. Informes anteriores han identificado una distribución desigual de células en la cámara anterior de los seres humanos, con más células localizadas inferiormente49. En ratones, una predisposición similar es común. Por lo tanto, las exploraciones verticales o radiales a través del aire acondicionado ayudarán a garantizar imágenes que capturen el rango de inflamación. Además, la realización de imágenes en el mismo lugar también proporcionará consistencia a las imágenes recogidas en el mismo ojo longitudinalmente. Para obtener imágenes en la misma parte del ojo, utilice puntos de referencia estables y un enfoque sistemático. Para las imágenes de la cámara anterior, la imagen se centra inmediatamente adyacente al ápice de la córnea y se orienta verticalmente para que se pueda detectar la presencia de un hipopión en el ángulo inferior. Para las imágenes del segmento posterior, la imagen se centra en el nervio óptico. Se recomienda considerar el uso de al menos 3 escaneos de línea para la puntuación para garantizar que se capture la variabilidad regional. En los casos en que la inflamación se limita a ubicaciones periféricas, la adquisición de exploraciones de volumen puede ser útil. La recopilación de escaneos de volumen también puede ayudar a capturar variaciones regionales, pero aumentará los requisitos de almacenamiento de datos.
Otros ensayos in vivo que se pueden utilizar para caracterizar la inflamación en el modelo de ratón PMU incluyen imágenes de bioluminiscencia13,35. Se pueden realizar ensayos post mortem, como el análisis citométrico de flujo multiparamétrico, para identificar y cuantificar poblaciones infiltrantes de tipo de células inmunes en la cámara acuosa y posterior del ojo12,26. En el modelo PMU, la inflamación aguda se caracteriza por una respuesta innata con un infiltrado de neutrófilos predominante, seguido de una respuesta adaptativa crónica y persistente dominante de células T que persiste durante más de un mes35. Otros ensayos de la función inmune que se pueden realizar en tejidos post-mortem incluyen el análisis de citoquinas del líquido ocular. Además, otros ensayos posteriores, como la secuenciación del ARNm y las imágenes de inmunofluorescencia, se pueden utilizar para evaluar los patrones de expresión de genes y proteínas de las poblaciones de células inmunes de la retina en la uveítis50,51.
El modelo PMU se puede replicar en otros sistemas de roedores utilizando adaptaciones apropiadas para las diferentes especies. El modelo PMU ha sido utilizado previamente en ratas y conejos38,39,40. En ratas, la panuveítis aguda se desarrolla después de la inyección intravítrea que se resuelve espontáneamente durante 14 días sin desarrollar signos de inflamación crónica por histología24. En conejos, la inducción de la uveítis utiliza dos rondas de inyección subcutánea antes de la inyección intravítrea, pero también genera una panuveítis robusta. Una de las ventajas de usar el modelo de ratón es la disponibilidad inmediata de numerosas cepas transgénicas y knockout que pueden ayudar a comprender el mecanismo básico de la uveítis52. Todos los modelos de roedores se pueden usar para pruebas de terapia preclínica si el agente se administra sistémicamente o como una gota tópica. Sin embargo, debido a su mayor tamaño, los ojos de rata y conejo son mejores modelos para su uso en estudios preclínicos de opciones de tratamiento de inyección implantable o local para la uveítis.
En resumen, este protocolo proporciona a los investigadores interesados en estudiar los mecanismos de la inflamación ocular crónica una nueva herramienta que no depende de la inmunización previa con antígenos oculares.

El término "uveítis" describe un conjunto heterogéneo de condiciones que presentan inflamación intraocular1. Los modelos animales de uveítis son importantes para comprender los mecanismos de la enfermedad y para las pruebas preclínicas de nuevas terapias. Se han establecido varios modelos animales de uveítis2. Los dos que se han estudiado más extensamente son la uveítis autoinmune experimental (o uveoretinitis; EAU) y uveítis inducida por endotoxinas (EIU). La EAU se genera típicamente por inmunización con antígenos oculares o puede ocurrir espontáneamente cuando la tolerancia central se interrumpe en ausencia del gen AIRE 3,4. Desde entonces, se han desarrollado otras variantes del modelo 5,6,7 para incluir diferentes péptidos uveitogénicos; Estos han sido revisados extensamente 8,9,10. EAU es el modelo primario para las formas de uveítis autoinmune dependiente de células T, como la enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada y la coriorretinitis en humanos. La EIU se genera por inyección sistémica o local de lipopolisacárido bacteriano (LPS)10,11. La EIU ha sido utilizada como modelo de uveítis aguda generada por la activación de vías de señalización inmune innata12. Ambos modelos han sido fundamentales para la comprensión actual de la inmunología ocular, pero ninguno es un modelo efectivo para la uveítis crónica postinfecciosa. Recientemente establecido en ratones, el modelo de uveítis micobacteriana (PMU) preparada ahora proporciona un enfoque para interrogar y evaluar los aspectos clínicos y celulares de esta forma de uveítis13.
Existe una alta prevalencia de infección micobacteriana en todo el mundo, con más de 10 millones de nuevos casos y más de 1,4 millones de muertes reportadas por la Organización Mundial de la Salud en 201914. La manifestación extrapulmonar de la infección activa de tuberculosis (TB) incluye uveítis y es una causa bien reconocida de uveítis infecciosa15,16. Las manifestaciones de la uveítis asociada a TB son proteicas, lo que probablemente refleja múltiples mecanismos distintos de la enfermedad para incluir infección ocular directa, así como inflamación inmunomediada menos conocida17,18,19. Los mecanismos propuestos para estas secuelas postinfecciosas incluyen una respuesta inflamatoria crónica estimulada por la persistencia de una infección pauci-bacilar en el epitelio pigmentario de la retina (EPR), una respuesta inflamatoria crónica estimulada por la presencia de patrones moleculares residuales asociados a patógenos (PAMP) de una infección ocular eliminada con éxito, y la activación inadecuada de la respuesta inmune adaptativa contra antígenos oculares a través de un proceso de mimetismo molecular o antígeno. diseminación causada por infección sistémicade TB 20,21,22,23.
Con el fin de obtener una mejor comprensión mecanicista de la uveítis postinfecciosa crónica y estudiar el papel de los antígenos micobacterianos en el inicio de la enfermedad, se desarrolló el modelo PMU para su uso en ratones13,24. En consecuencia, para provocar inflamación, el ratón primero recibe una inyección subcutánea de antígeno de la cepa H37Ra de Mycobacterium tuberculosis muerta por calor para imitar la infección sistémica, seguida siete días después por la inyección intravítrea del mismo antígeno administrado al ojo izquierdo o derecho para imitar la infección ocular local. La intensidad y la duración de la uveítis resultante se monitorizan mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) longitudinal in vivo e imágenes del ojo25. La PMU se caracteriza por una panuveítis aguda mieloide dominante que se convierte en una uveítis posterior crónica dominante de células T con vitritis, inflamación retiniana perivascular y áreas focales de daño retiniano externo26. La presencia de inflamación granulomatosa en el segmento posterior del ojo sugiere que el modelo PMU puede ser utilizado para estudiar algunas formas de uveítis anterior (granulomatosa y no granulomatosa) e intermedia, observada en pacientes con evidencia inmunológica de infección por Mtb pasada27. Además, se ha sugerido que los componentes de la Mtb muerta por calor utilizados en el modelo PMU desencadenan respuestas inmunes subyacentes a los aspectos de la uveítis recurrente en pacientes con tuberculosis ocular que responden a la terapia antituberculosa (ATT)28. Debido a las diferencias en el inicio de la enfermedad y el curso inflamatorio en comparación con EAU y EIU, PMU representa un nuevo modelo animal de uveítis que no depende de la inmunización con antígenos oculares y puede ayudar a dilucidar los mecanismos de la enfermedad en pacientes con uveítis crónica. Este protocolo describe los métodos para generar PMU, monitorear el curso clínico de la inflamación y recolectar muestras oculares para el análisis post mortem con citometría de flujo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AK-FLUOR</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed</td>
			<td>Akorn Animal Health, IL, USA</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>Xylazine 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>8007-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide Needles -25 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-D Precision Glide needle -30-G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond MAX, Bond Rx</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Automated IHC staining system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol ointment</td>
			<td>Martindale Pharma, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>1% w/w Chloramphenicol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG1150H</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2300</td>
			<td>Bioptigen/Leica</td>
			<td></td>
			<td>OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s Incomplete Adjuvant</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>263910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye ointment</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra lyophilized Mycobacteria extract</td>
			<td>BD Difco, NJ, USA</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton RN Needle (33/12/2)S</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>7803-05(33/12/2)</td>
			<td>33 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>CAL7633-01</td>
			<td>5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td>Exel International, USA</td>
			<td>26029</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset</td>
			<td>Zoetis, USA</td>
			<td>377341</td>
			<td>Ketamine HCL 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA</td>
			<td></td>
			<td>Alternative Imaging/OCT Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil 10 &#181;L syringe</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Intraocular Injection Kit</td>
			<td>World Precision Instruments, FL, USA</td>
			<td>IO-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissection scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL</td>
			<td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td>
			<td>17478020115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RM2255</td>
			<td>Leica Biosystems, IL,USA</td>
			<td></td>
			<td>Tissue Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td>
			<td>309602</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracaine 0.5%</td>
			<td>Alcon, TX, USA</td>
			<td>1041544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek VIP series</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc.,CA.</td>
			<td></td>
			<td>Histology Tissue Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1%</td>
			<td>Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK</td>
			<td></td>
			<td>Minims</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tylenol</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc, PA, USA</td>
			<td>NDC 50580-614-01</td>
			<td>Acetaminophen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears</td>
			<td>Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK</td>
			<td></td>
			<td>Carbomer eye gel 0.2% w/w</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primed mycobacterial uveitis (pmu) as a model for post-infectious uveitis

El término "uveítis" describe un conjunto heterogéneo de afecciones que presentan inflamación intraocular. En términos generales, la uveítis se define por la etiología: infección o autoinmunidad. La uveítis infecciosa requiere tratamiento con los agentes antimicrobianos apropiados, mientras que la uveítis autoinmune requiere tratamiento con corticosteroides u otros agentes inmunosupresores. La uveítis postinfecciosa es una forma de uveítis crónica que requiere corticosteroides para controlar la secuela inmune después de la infección inicial. La uveítis asociada con la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es una forma bien reconocida de uveítis postinfecciosa, pero los mecanismos de la enfermedad no se comprenden completamente. Para comprender el papel que desempeñan los antígenos micobacterianos y los ligandos innatos en la estimulación de la inflamación ocular crónica después de la infección por mTB, se desarrolló el modelo de uveítis micobacteriana (PMU) para su uso en ratones. Este manuscrito describe los métodos para generar PMU y monitorear el curso clínico de la inflamación utilizando imágenes de fondo de ojo en color y tomografía de coherencia óptica (OCT). La PMU es inducida por la inmunización con extracto micobacteriano muerto por calor seguido de la inyección intravítrea del mismo extracto en un ojo siete días después. La inflamación ocular se monitorea longitudinalmente utilizando imágenes in vivo y seguida de la recolección de muestras para una amplia gama de ensayos, que incluyen histología, citometría de flujo, análisis de citoquinas, qPCR o secuenciación de ARNm. El modelo de ratón de PMU es una nueva herramienta útil para estudiar las respuestas oculares a la mTB, el mecanismo de la uveítis crónica, y para las pruebas de eficacia preclínica de nuevas terapias antiinflamatorias.

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Primed Mycobacterial Uveitis PMU as a Model for Post-Infectious Uveitis

Este protocolo describe los pasos para inducir la uveítis micobacteriana preparada (PMU) en ratones. Este método describe los pasos para ayudar a producir una inflamación ocular confiable y robusta en el sistema modelo de ratón. Usando este protocolo, generamos ojos uveíticos y ojos compañeros no inflamados de animales individuales para su posterior evaluación con ensayos inmunológicos, transcriptómicos y proteómicos.

Uveítis micobacteriana (PMU) preparada como modelo para la uveítis postinfecciosa

The term 'uveitis' describes a heterogeneous set of conditions that all feature intraocular inflammation. Broadly, uveitis is defined by etiology:  ...

Este protocolo describe los pasos para inducir una inflamación ocular confiable y robusta utilizando micobacterias muertas por calor en el modelo de ratón. Este modelo de uveítis micobacteriana preparada puede ayudar a estudiar los mecanismos de la inflamación ocular crónica mediada por el sistema inmune que se desarrolla después de una infección micobacteriana. Este modelo de uveítis crónica no requiere el uso de cepas específicas de ratón o inmunización con antígenos oculares.Este modelo facilita el uso de líneas de ratón transgénicas y genes knockout en estudios mecanicistas de la patogénesis de la inflamación ocular. Este modelo de PMU será útil en estudios que prueben nuevas terapias para la inflamación ocular o uveítis en humanos. Los tratamientos como las gotas para los ojos nuevos o los agentes inmunomoduladores administrados sistémicamente podrían probarse para determinar su eficacia con este modelo.Este modelo facilitará el estudio de cómo los antígenos micobacterianos muertos por calor alteran el microambiente de un órgano inmune privilegiado como el ojo. Estos resultados también podrían proporcionar información sobre cómo otros tipos de infección ocular afectan el ojo o cómo los sitios privilegiados inmunes, como el cerebro, responden a los antígenos microbacterianos. Para comenzar, dessujete el cuerpo de la unidad convertidora Sonicator y limpie la sonda con un hisopo con alcohol al 70%.A continuación, encienda el Sonicator y ajuste la configuración de energía a cuatro girando la perilla de control de alimentación. A continuación, para generar una suspensión fina de la microbacteria tuberculosis H37Ra en PBS, sumerja la punta de la sonda en el polvo microbacteriano que contiene PBS. Sonicar la mezcla en hielo durante 30 segundos, luego hacer una pausa durante 30 segundos y repetir durante un total de cinco minutos para dispersar completamente el polvo en una suspensión uniforme sin calentar el líquido.A continuación, agregue 2,5 mililitros de adyuvante incompleto de Freund a la mezcla y repita el proceso de sonicación en hielo hasta que la emulsión forme una consistencia similar a la pasta de dientes. Para la inyección subcutánea, cargue de 200 a 300 microlitros de la emulsión microbacteriana en una jeringa de un mililitro. Expulse el aire de la jeringa y continúe llenándola con inversión intermitente y golpeteo hasta que se llene.A continuación, coloque las inyecciones subcutáneas en la superficie dorsal de las caderas o en la superficie ventral de las piernas proximal a la región de los ganglios linfáticos inguinales de un ratón C57 negro 6J anestesiado de 6 a 10 semanas de edad. Inserte cuidadosamente la aguja, teniendo cuidado de no penetrar en el músculo, e inyecte 50 microlitros de la emulsión en el espacio subcutáneo. No retire la aguja inmediatamente para permitir que la emulsión espesa se inyecte completamente.Para preparar el stock de antígenos para la inyección intravítrea, sonicar el H37Ra en solución de PBS como se demostró anteriormente, luego alícuota la solución en volúmenes de 100 microlitros y almacenar a 20 grados centígrados. El día de la inyección, después de confirmar la profundidad de la anestesia general, anestesiar la córnea con una gota de 0,5% de tetracaína y dilatar la pupila con una gota de 2,5% de fenilefrina. Después de frotar el exceso de líquido, agregue una gota de 5% de betadina a la superficie del ojo y al cabello circundante para disminuir el riesgo de endoftalmitis.Después de dos o tres minutos, retire el Betadine y cubra el ojo con gel de hipromelosa al 0,3% para evitar la sequedad bajo anestesia y la formación de cataratas. A continuación, cargue una jeringa de 10 microlitros con la mezcla de antígeno y fluoresceína, luego coloque el mouse en posición prona en la plataforma y use las barras de oído derecha e izquierda para fijar la cabeza del mouse. Coloque y oriente el ratón debajo del endoscopio de modo que el aspecto nasal superior del ojo derecho sea visible.Luego, usando una aguja de calibre 30, desplace las pestañas, exponga la esclerótica y visualice el limbo y el vaso sanguíneo radial. Luego, usando una aguja estéril de calibre 30, haga un orificio guía en la esclerótica de uno a dos milímetros posterior al limbo. Luego, inserte la aguja de calibre 34 conectada al soporte de inyección en el ojo, a través del orificio guía, en un ángulo que evite la lente, pero coloque la punta de la aguja en la cavidad vítrea.Usando un controlador de bomba de micro jeringa, inyecte cuidadosamente un microlitro del extracto de M.tuberculosis en la cavidad vítrea. En caso de reflujo constante, aumente el volumen de inyección a 1,5 microlitros para garantizar la administración adecuada de la dosis. Confirme la colocación intravítrea visualizando un reflejo verdoso en el ojo y, después de 10 segundos, retire la aguja del ojo.Después de anestesiar al ratón, dilate la pupila con una gota de fenilefrina al 2,5%, evitando que el exceso de gotas entre en la nariz o la boca. Después de dos o tres minutos, aplique el exceso de líquido y cubra el ojo con gel de hipromelosa al 0,3%. A continuación, envuelva al ratón en una capa de gasa quirúrgica para mantener el calor corporal, luego coloque el ratón en el casete del animal y coloque la cabeza con la barra de mordida.Para adquirir la tomografía de coherencia óptica o las imágenes de OCT, encienda el sistema de imágenes de OCT y abra el software de imágenes. Para las imágenes de la cámara posterior, acerque la OCT a la superficie del ojo, teniendo cuidado de no poner la superficie del cristalino en contacto con el ojo. Una vez que el ojo esté correctamente posicionado, detenga el escaneo rápido, seleccione el protocolo de escaneo de volumen y active el escaneo con la opción Apuntar.Para las imágenes del segmento posterior, ajuste hasta que el nervio óptico esté centrado en la imagen de alineación de la gammagrafía B horizontal y la retina esté alineada con el eje de alineación vertical. Para las imágenes del segmento anterior, ajuste la posición para centrar el ápice de la córnea tanto en la imagen de alineación horizontal de la exploración B como en la imagen de alineación vertical de la exploración B. Finalmente, haga clic en Instantánea para capturar la imagen de escaneo de volumen, luego haga clic en guardar.24 horas después de la inyección intravítrea, se observan células inflamatorias en el acuoso y vítreo. El edema corneal, un hipopión y múltiples células inflamatorias flotantes se observan en la cámara anterior y vitritis en la cámara posterior. El grado de inflamación ocular se puede calificar en estas imágenes de OCT.Las puntuaciones combinadas mayores que cero pero inferiores a 2,5 representan una inflamación leve. Puntuaciones superiores a 2,5, pero inferiores a 4,5. representan inflamación moderada, y puntuaciones superiores a 4,5 identifican inflamación grave.Las puntuaciones de inflamación también se pueden determinar utilizando cinco características visibles en las secciones de tinción de hematoxilina y eosina. La puntuación de gravedad se determina contando el número de células inflamatorias en el acuoso y vítreo. Las imágenes longitudinales de fondo de ojo de campo claro también pueden identificar inflamación retiniana y perivascular.Los ojos severamente inflamados demuestran múltiples infiltrados blancos en la retina y tortuosidad vascular en las imágenes de fondo de ojo en color, así como vitritis densa y edema retiniano en OCT en el segundo día. Los ojos levemente inflamados demuestran menos lesiones lineales y más discretas en el fondo de ojo, y un número de células infiltrantes en el espacio vítreo. Asegurar la consistencia durante las inyecciones subcutáneas e intravítreas y tomar las medidas adecuadas para prevenir el desarrollo de endoftalmitis infecciosa son los pasos clave que ayudan a replicar con éxito este modelo.Las imágenes de bioluminiscencia in vivo se pueden utilizar para caracterizar la inflamación, mientras que los ensayos post mortem, como el análisis citométrico de flujo multiparamétrico, se pueden realizar para identificar y cuantificar poblaciones infiltrantes de tipo de células inmunes. El análisis de citoquinas, la secuenciación del ARNm y las imágenes de inmunofluorescencia se pueden utilizar para evaluar los patrones de expresión de genes y proteínas o identificar poblaciones de células inmunes de la retina en la uveítis. Este protocolo muestra cómo realizar inyecciones reproducibles, asépticas y mínimamente traumáticas que ayudarán a los futuros investigadores a acceder al espacio intravítreo en ratones.La OCT también desempeñará un papel importante en la detección de la inflamación ocular que de otro modo podría pasarse por alto mediante un examen visual de los ojos de pequeños animales de experimentación.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

El pez cebra como modelo para evaluar el potencial teratogénico de nitrito

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

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Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

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Profundo dérmico inyección como un modelo de infección de la piel Candida albicans para el análisis histológico

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

Medición de tasas de desconfianza micobacterianas específicas con sistemas de reportera de ganancia de función

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...