Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

MLW udviklede en del af denne protokol under sine postdocstudier med Dr. Robert Keenan ved University of Chicago.
Dette arbejde er finansieret af NIH tilskud 1R35GM137904-01 til MLW.

1. Liposomforberedelse
<ol><li>Kombiner kloroform lagre af lipider i passende forhold til at efterligne den ydre mitokondriemembran.<ol>
<li>Forbered 25 mg lipidblanding. Vi bruger en tidligere etableret blanding af lipider, der efterligner mitokondriemembraner, bestående af et 48:28:10:10:4 molarforhold mellem kyllingægphosphatidyl cholin (PC), kyllingæg fosfatyl ethanolamin (PE), kvægleverphosphatidyl inositol (PI), syntetisk 1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-fosfo-L-serin (DOPS) og syntetisk 1',3'bis[1,2-dioleoyl-sn-gl...

Korrekt mitokondriefunktion afhænger af et robust proteinkvalitetskontrolsystem. På grund af iboende grænser i troskab ta protein målretning veje, mislocalized TA proteiner er en konstant kilde til stress for mitokondrier. En vigtig komponent i mitokondrie proteostase netværk er Msp1, som er en membran forankret AAA + ATPase, der fjerner fejllocalized TA proteiner fra OMM. Her har vi beskrevet, hvordan man forbereder proteoliposomes, co-rekonstrueret Msp1 og en model TA protein, og udføre en ekstraktion assay. Vi h...

Korrekt cellulær funktion afhænger af en proces kaldet proteostase, som sikrer, at funktionelle proteiner er i den korrekte koncentration og cellulære placering1. Fejl i proteostase fører til kompromitteret organellefunktion og er forbundet med mange neurodegenerative sygdomme2,3,4. Membranproteiner udgør unikke udfordringer for proteostasenetværket, da de skal målrettes mod den korrekte membran, samtidig med at man undgår sammenlægning fra hydrofobiske transmembrandomæner (TED'er)5. Derfor har specialiserede maskiner udviklet sig til at beskytte den hydrofobiske TMD fra cytosolen og lette målretning og indsættelse i den korrekte cellulæremembran 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitokondrier er cellens metaboliske knudepunkt og er involveret i mange væsentlige cellulære processer som: oxidativ fosforylering, jern-svovlklyngegenerering og apoptotisk regulering16,17. Disse endosymbiotiske organeller indeholder to membraner, kaldet den indre mitokondriemembran (IMM) og den ydre mitokondriemembran (OMM). Over 99% af de 1.500 humane mitokondrieproteiner er kodet i det nukleare genom og skal omfordeles på tværs af en eller to forskellige membraner18,19. Korrekt mitokondriefunktion afhænger således af et robust proteostasenetværk for at rette eventuelle fejl i proteinmålretning eller translokation.
Vores laboratorium fokuserer på en delmængde af mitokondriemembranproteiner kaldet haleforankrede (TA) proteiner, som har et enkelt transmembrandomæne på selve C-terminus20,21,22,23,24. TA proteiner er involveret i en række væsentlige processer, såsom apoptose, vesikel transport, og protein translokation25. Den unikke topologi af TA proteiner kræver post-translationel indsættelse, som forekommer i endoplasmisk reticulum (ER) ved Guided Entry of Tail-forankret (GET) eller Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) veje eller ind i OMM af en dårligt karakteriseret vej20,26,27,28. TMD'ens biofysiske egenskaber er nødvendige og tilstrækkelige til at lede TA-proteiner til den korrektemembran 29. Anerkendelsen af biofysiske egenskaber snarere end et defineret sekvensmotiv begrænser troskaben af målretningsvejene5. Således er fejllocalization af TA proteiner en fælles stress for proteostase netværk. Cellulær stress, såsom hæmning af GET-stien, forårsager en stigning i proteinfejllocalisering til OMM og mitokondrie dysfunktion, medmindre disse proteiner straks fjernes30,31.
Et fælles tema i membran proteostase er brugen af AAA +(ATPase Associated med cellulære Activities) proteiner til at fjerne gamle, beskadigede eller fejllokerede proteiner fra lipid bilayer1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA + proteiner er molekylære motorer, der danner hexameriske ringe og gennemgår ATP-afhængige bevægelser for at ombygge et substrat, ofte ved translokation gennem en smal aksial pore39,40. Selv om der er gjort en stor indsats for at studere udvindingen af membranproteiner af AAA + ATPases, er rekonstitutionerne komplekse eller involverer en blanding af lipider og vaskemiddel41,42, hvilket begrænser den eksperimentelle kraft til at undersøge mekanismen for substratudvinding fra lipid-bilayeren.
Msp1 er en meget bevaret AAA + ATPase forankret i OMM og peroxisomes, der spiller en afgørende rolle i membran proteostase ved at fjerne fejllokaliserede TA proteiner43,44,45,46,47. Msp1 blev også for nylig vist sig at lindre mitokondrie protein import stress ved at fjerne membran proteiner, stall under translokation på tværs af OMM48. Tab af Msp1 eller den menneskelige homolog ATAD1 resulterer i mitokondrie fragmentering, svigt i oxidativ fosforylering, anfald, øget skade efter slagtilfælde, og tidlig død31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Vi har vist, at det er muligt at co-rekonstruere TA proteiner med Msp1 og opdage ekstraktionen fra lipid bilayer57. Dette forenklede system anvender fuldt rensede proteiner rekonstitueret i definerede liposomer , der efterligner OMM (Figur 1)58,59. Dette niveau af eksperimentel kontrol kan løse detaljerede mekanistiske spørgsmål om substratudvinding, der er eksperimentelt uhåndterlige med mere komplekse rekonstitutioner, der involverer andre AAA+ proteiner. Her leverer vi eksperimentelle protokoller, der beskriver vores metoder til liposompræparat, membranproteinkonstitution og ekstraktionsanalysen. Det er vores håb, at disse eksperimentelle detaljer vil lette yderligere undersøgelse af den væsentlige, men dårligt forstået proces med membran proteostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Som centrum for oxidativ fosforylering og apoptotisk regulering spiller mitokondrier en afgørende rolle i menneskers sundhed. Korrekt mitokondriefunktion afhænger af et robust kvalitetskontrolsystem for at opretholde protein homøostase (proteostase). Fald i mitokondrie proteostase har været forbundet med kræft, aldring, neurodegeneration, og mange andre sygdomme. Msp1 er en AAA+ ATPase forankret i den ydre mitokondriemembran, der opretholder proteostase ved at fjerne fejllokerede haleforankrede proteiner. Ved hjælp af rensede komponenter rekonstitueret i proteoliposomes, har vi vist, at Msp1 er nødvendig og tilstrækkelig til at udtrække en model hale-forankret protein fra en lipid bilayer. Vores forenklede rekonstituerede system overvinder flere af de tekniske barrierer, der har hindret detaljeret undersøgelse af membranproteinudvinding. Her giver vi detaljerede metoder til generering af liposomer, membranprotein rekonstitution, og Msp1 ekstraktion assay.

For at fortolke resultaterne korrekt skal pletten fri gel og den vestlige blot ses sammen. Pletten fri gel sikrer lige belastning på tværs af alle prøver. Når du ser pletfri gel, vil chaperoner (GST-calmodulin og GST-SGTA) være synlige i INPUT (I) og ELUTE (E) baner. Dobbelttjek, at intensiteten af disse bånd er ensartet på tværs af alle INPUT-prøverne. På samme måde skal du sikre dig, at intensiteten er ensartet på tværs af ELUTE-prøverne. ELUTE er 5x mere koncentreret end INPUT, og denne intensitetsforske...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Her præsenterer vi en detaljeret protokol for rekonstitution af Msp1 ekstraktionsaktivitet med fuldt rensede komponenter i definerede proteolipoomer.

Rekonstitution af Msp1 udvindingsaktivitet med fuldt rensede komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Brugen af AAA-ATPases til at fjerne proteiner fra en lipid bilayer er et fælles tema i protein kvalitetskontrol. En mekanistisk forståelse af denne vigtige proces kræver et rekonstitueret system. Tidligere rekonstitution med AAA-ATPases var komplekse og heterogene.Vores system er enkelt og fuldt defineret. Dette giver os mulighed for at manipulere AAA-ATPase Msp1, substratet og lipidmiljøet. Til at begynde med tilsættes tidligere forberedt rekonstitutionbuffer, rensede Msp1- og TA-proteiner og liposomer i et PCR-rør og inkuberer derefter blandingen på is i 10 minutter.Under inkubationen skæres spidsen af en P200 pipettespids til ca. 1/8 af en tomme i diameter. Derefter hvirvle røret indeholder BioBeads grundigt for at opnå en ensartet blanding. Fjern derefter hurtigt låget og brug den afskårne P200 pipettespids til at overføre et passende volumen af perlerne til et tomt PCR-rør.Når den 10-minutters inkubation til rekonstitution er færdig, skal du fjerne al væske fra BioPerlerne ved hjælp af en usleben pipettespids. Overfør derefter 100 mikroliter af rekonstitutionen ind i røret med BioPerler og lad det rotere på et hjul i 16 timer. Den følgende dag, spin røret i en PicoFuge at pellet perlerne, derefter overføre rekonstitueret materiale til en ren PCR rør og holde røret på is.For at fjerne proteiner, der ikke kunne rekonstruere i liposomer, ekvilibrere glutathion spin kolonner med ekstraktion buffer, som typisk indebærer tre runder af vask med 400 mikroliter af buffer, efterfulgt af centrifugering for at fjerne bufferen. Derefter tilsættes fem mikromol af hver chaperone til det rekonstituerede materiale, efterfulgt af 100 mikroliter ekstraktionsbuffer, hvilket bringer lydstyrken op til 200 mikroliter. Tilsæt denne blanding til de ekvilibrerede glutathion spin kolonner, derefter tilslutte spin kolonner og rotere dem i 30 minutter, så chaperones at binde sig til harpiksen.Efter rotation drejes kolonnerne kort. Saml gennemstrømningen, som er det forklarede materiale udtømt af aggregerede proteiner. Placer det på is og gå direkte videre til udvindingsanalysen.Forbered rør til SDS-PAGE analyse. Tilsæt 45 mikroliter dobbeltdestilleret vand til indgangsrøret, 40 mikroliter vand til flow-through-røret og 16,6 mikroliter af 4X SDS-PAGE loading buffer til hvert rør. Til ekstraktionsanalysen forberedes ekstraktionsreaktionen, og det endelige volumen opslynges til 200 mikroliter med ekstraktionsbufferen.Derefter prewarm ekstraktion assay i en 30-graders Celsius varme blok i to minutter. For at starte analysen tilsættes ATP til en endelig koncentration af to millimol. Drej røret i fem sekunder i en PicoFuge, og inkuber det ved 30 grader Celsius i 30 minutter.Under inkubationen skal du tage en fem mikroliterprøve af reaktionen og tilføje den til indgangsrøret. Også, ekvilibrere en glutathion spin kolonne for hver prøve i ekstraktion assay som påvist tidligere. Når 30-minutters inkubation er færdig, tilsættes 200 mikroliter ekstraktionsbuffer til røret, hvilket bringer det samlede volumen til 400 mikroliter.Derefter tilsættes denne reaktion til den ekvilibrerede glutathionharpiks og lad den rotere i 30 minutter ved fire grader Celsius. Efter rotation skal du dreje kolonnerne for at opsamle flow-through, og tag derefter en 10-mikroliterprøve til flow-through-røret. Vask harpiksen to gange med 400 mikroliter ekstraktionsbuffer, kassér flow-through efter hver vask.Efter den tredje vask skal du holde flow-through og tage en 50 mikroliter prøve til vaskerøret. Derefter forberede fem milliliter af elution buffer ved at tilføje reduceret glutathion til en endelig koncentration af fem millimol i ekstraktion buffer. Tilsæt 200 mikroliter af elutionbufferen til spinkolonnen og inkuber i fem minutter.Derefter centrifugere kolonnen og indsamle flow-through. Gentag elutionstrinnet igen. Efter den anden udløsning skal du tage en 50-mikroliter aliquot fra elutionsprøven og tilsæt den til eluterøret.Efter at have kørt en vestlig blot kan ekstraktionseffektiviteten bestemmes ved at sammenligne mængden af substrat i elutefraktionen med inputfraktionen. Signalet i flow-through viser en vis variation, men er generelt ligner input brøken, og der er ikke noget signal i vaskefraktionen. Typisk er der en ca. 10% ekstraktionseffektivitet for den positive kontrol og en 1 til 2% ekstraktionseffektivitet for den negative kontrol.Når rekonstitutionsbetingelserne ikke optimeres, kan ekstraktionsniveauerne sammenlignes mellem de positive og negative prøver. Denne teknik gjorde det muligt for vores laboratorium at teste biofysiske egenskaber af substratet påvirke anerkendelse af Msp1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstituering af nucleosomer med differentielt isotopmærkede Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein udvinding, enzymatisk aktivitet og genekspression af koffein syntase fra plante celle suspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering af cellecyklus svingninger i Microemulsions af celle-fri Xenopus æg uddrag

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Fuldt autonome karakterisering og indsamling af Data fra krystaller af biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Indfangning af aktivt producerede mikrobielle flygtige organiske forbindelser fra humant associerede prøver med vakuumassisteret sorbentekstraktion

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Ekstraktion og visualisering af proteinaggregater efter behandling af Escherichia coli med en proteotoxisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering af aktiv caenorhabditis elegans nukleare ekstrakt og rekonstitution for In Vitro Transskription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...