Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

MLW ontwikkelde een deel van dit protocol tijdens zijn postdoctorale studies met Dr. Robert Keenan aan de Universiteit van Chicago.
Dit werk wordt gefinancierd door NIH-subsidie 1R35GM137904-01 aan MLW.

1. Liposoom voorbereiding
<ol><li>Combineer chloroformvoorraden lipiden in geschikte verhoudingen om het buitenste mitochondriale membraan na te bootsen.<ol>
<li>Bereid 25 mg lipidenmengsel. We gebruiken een eerder vastgesteld mengsel van lipiden die mitochondriale membranen nabootsen, bestaande uit een 48:28:10:10:4 molaire verhouding van kippenei fosfatidyl choline (PC), kippenei fosfatidyl ethanolamine (PE), runder lever fosfatidyl inositol (PI), synthetische 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (DOPS), en synth...

Een goede mitochondriale functie is afhankelijk van een robuust eiwitkwaliteitscontrolesysteem. Vanwege inherente limieten in de getrouwheid van de TA-eiwitgerichte routes, zijn verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten een constante bron van stress voor mitochondriën. Een belangrijk onderdeel van het mitochondriale proteostasenetwerk is Msp1, een membraan verankerd AAA + ATPase dat verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten uit de OMM verwijdert. Hier hebben we beschreven hoe proteoliposomen te bereiden, Msp1 en een model TA-eiwit ...

Een goede cellulaire functie hangt af van een proces dat proteostase wordt genoemd, dat ervoor zorgt dat functionele eiwitten zich op de juiste concentratie en cellulaire locatie bevinden1. Mislukkingen in proteostase leiden tot een gecompromitteerde organelfunctie en worden geassocieerd met veel neurodegeneratieve ziekten2,3,4. Membraaneiwitten vormen unieke uitdagingen voor het proteostasenetwerk, omdat ze op het juiste membraan moeten worden gericht, terwijl aggregatie van de hydrofobe transmembraandomeinen (TMD's) wordt vermeden5. Bijgevolg zijn gespecialiseerde machines geëvolueerd om de hydrofobe TMD te beschermen tegen het cytosol en het richten en inbrengen in het juiste celmembraan6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15te vergemakkelijken.
Mitochondriën zijn de metabole hub van de cel en zijn betrokken bij tal van essentiële cellulaire processen zoals: oxidatieve fosforylering, ijzer-zwavel clustergeneratie en apoptotische regulatie16,17. Deze endosymbiotische organellen bevatten twee membranen, aangeduid als het binnenste mitochondriale membraan (IMM) en het buitenste mitochondriale membraan (OMM). Meer dan 99% van de 1.500 menselijke mitochondriale eiwitten zijn gecodeerd in het nucleaire genoom en moeten worden getransloceerd over een of twee verschillende membranen18,19. Een goede mitochondriale functie is dus afhankelijk van een robuust proteostasenetwerk om eventuele fouten in eiwittargeting of translocatie te corrigeren.
Ons laboratorium richt zich op een subset van mitochondriale membraaneiwitten genaamd staart-verankerde (TA) eiwitten, die een enkel transmembraandomein hebben op het C-eindpunt20,21,22,23,24. TA-eiwitten zijn betrokken bij een aantal essentiële processen, zoals apoptose, vesikeltransport en eiwittranslocatie25. De unieke topologie van TA-eiwitten vereist posttranslationele insertie, die optreedt in het endoplasmatisch reticulum (ER) door de Guided Entry of Tail-anchored (GET) of Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) pathways of in de OMM door een slecht gekarakteriseerde pathway20,26,27,28. De biofysische eigenschappen van de TMD zijn noodzakelijk en voldoende om TA-eiwitten naar het juiste membraan te leiden29. De herkenning van biofysische kenmerken in plaats van een gedefinieerd sequentiemotief beperkt de getrouwheid van de richtroutes5. Mislokalisatie van TA-eiwitten is dus een veel voorkomende stress voor de proteostasenetwerken. Cellulaire stress, zoals remming van de GET-route, veroorzaakt een toename van eiwitmislokalisatie naar de OMM en mitochondriale disfunctie, tenzij deze eiwitten onmiddellijk worden verwijderd30,31.
Een gemeenschappelijk thema in membraanproteostase is het gebruik van AAA +(ATPase Associated met cellulaire A-ctivities) eiwitten om oude, beschadigde of verkeerd gelokaliseerde eiwitten uit de lipide bilayer1,32,33,34,35,36,37,38 te verwijderen . AAA + -eiwitten zijn moleculaire motoren die hexamere ringen vormen en ATP-afhankelijke bewegingen ondergaan om een substraat te hermodelleren, vaak door translocatie door een smalle axiale porie39,40. Hoewel er veel moeite is gedaan om de extractie van membraaneiwitten door AAA + ATPases te bestuderen, zijn de reconstituties complex of omvatten ze een mengsel van lipiden en wasmiddel41,42, wat de experimentele kracht beperkt om het mechanisme van substraatextractie uit de lipide bilayer te onderzoeken.
Msp1 is een zeer geconserveerde AAA + ATPase verankerd in de OMM en peroxisomen die een cruciale rol speelt in membraanproteostase door het verwijderen van verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten43,44,45,46,47. Msp1 bleek onlangs ook mitochondriale eiwitimportstress te verlichten door membraaneiwitten te verwijderen die vastlopen tijdens translocatie over de OMM48. Verlies van Msp1 of de menselijke homoloog ATAD1 resulteert in mitochondriale fragmentatie, falen in oxidatieve fosforylering, epileptische aanvallen, verhoogd letsel na een beroerte en vroege dood31,49,50,51,52,53,54,55,56.
We hebben aangetoond dat het mogelijk is om TA-eiwitten te co-reconstitueren met Msp1 en de extractie uit de lipide bilayer57 tedetecteren. Dit vereenvoudigde systeem maakt gebruik van volledig gezuiverde eiwitten gereconstitueerd in gedefinieerde liposomen die de OMM nabootsen (Figuur 1)58,59. Dit niveau van experimentele controle kan gedetailleerde mechanistische vragen van substraatextractie aanpakken die experimenteel onhandelbaar zijn met complexere reconstituties waarbij andere AAA + -eiwitten betrokken zijn. Hier bieden we experimentele protocollen met gedetailleerde informatie over onze methoden voor liposoompreparaat, membraaneiwitreconstructie en de extractietest. Het is onze hoop dat deze experimentele details verdere studie van het essentiële maar slecht begrepen proces van membraanproteostase zullen vergemakkelijken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Als centrum voor oxidatieve fosforylering en apoptotische regulatie spelen mitochondriën een vitale rol in de menselijke gezondheid. Een goede mitochondriale functie is afhankelijk van een robuust kwaliteitscontrolesysteem om eiwithomeostase (proteostase) te behouden. Dalingen in mitochondriale proteostase zijn in verband gebracht met kanker, veroudering, neurodegeneratie en vele andere ziekten. Msp1 is een AAA + ATPase verankerd in het buitenste mitochondriale membraan dat proteostase handhaaft door verkeerd gelokaliseerde staartverankerde eiwitten te verwijderen. Met behulp van gezuiverde componenten gereconstitueerd tot proteoliposomen, hebben we aangetoond dat Msp1 noodzakelijk en voldoende is om een model staart-verankerd eiwit uit een lipide bilayer te extraheren. Ons vereenvoudigde gereconstitueerde systeem overwint verschillende van de technische barrières die een gedetailleerde studie van membraaneiwitextractie hebben belemmerd. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het genereren van liposomen, membraaneiwitreconstructie en de Msp1-extractietest.

Om de resultaten goed te interpreteren, moeten de vlekvrije gel en de western blot samen worden bekeken. De vlekvrije gel zorgt voor een gelijke belasting over alle monsters. Bij het bekijken van de vlekvrije gel zullen de chaperones (GST-calmodulin en GST-SGTA) zichtbaar zijn in de INGANG (I) en ELUTE (E) rijstroken. Controleer nogmaals of de intensiteit van deze banden uniform is voor alle INPUT-samples. Zorg er ook voor dat de intensiteit uniform is over de ELUTE-monsters. De ELUTE is 5x geconcentreerder dan de INPUT ...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten in gedefinieerde proteoliposomen.

Reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Het gebruik van AAA-ATPases om eiwitten uit een lipide bilayer te verwijderen is een veel voorkomend thema in de kwaliteitscontrole van eiwitten. Een mechanistisch begrip van dit essentiële proces vereist een gereconstitueerd systeem. Eerdere reconstitutie met AAA-ATPasen was complex en heterogeen.Ons systeem is eenvoudig en volledig gedefinieerd. Dit stelt ons in staat om de AAA-ATPase Msp1, het substraat en de lipideomgeving te manipuleren. Voeg om te beginnen eerder bereide reconstitutiebuffer, gezuiverde Msp1- en TA-eiwitten en liposomen toe aan een PCR-buis en incubeer het mengsel vervolgens gedurende 10 minuten op ijs.Snijd tijdens de incubatie de punt van een P200-pipetpunt tot ongeveer 1/8 inch in diameter. Draai vervolgens de buis met BioBeads grondig om een uniform mengsel te verkrijgen. Verwijder vervolgens snel het deksel en gebruik de gesneden P200-pipetpunt om een geschikt volume van de kralen over te brengen naar een lege PCR-buis.Zodra de incubatie van 10 minuten voor reconstitutie is voltooid, verwijdert u met behulp van een ongesneden pipetpunt alle vloeistof uit de BioBeads. Breng vervolgens 100 microliter van de reconstitutie over in de buis met de BioBeads en laat deze gedurende 16 uur op een wiel draaien. Draai de volgende dag de buis in een PicoFuge om de kralen te pelleteren, breng vervolgens het gereconstitueerde materiaal over naar een schone PCR-buis en houd de buis op ijs.Voor het verwijderen van eiwitten die niet in de liposomen zijn gereconstitueerd, moet u de glutathion-spinkolommen in evenwicht brengen met extractiebuffer, wat meestal drie wasrondes met 400 microliter buffer omvat, gevolgd door centrifugatie om de buffer te verwijderen. Voeg vervolgens vijf micromol van elke chaperonne toe aan het gereconstitueerde materiaal, gevolgd door 100 microliter extractiebuffer, waardoor het volume op 200 microliter komt. Voeg dit mengsel toe aan de gebalanceerde glutathion spinkolommen, sluit vervolgens de spinkolommen aan en draai ze gedurende 30 minuten, zodat de chaperonnes zich aan de hars kunnen binden.Draai na het draaien de kolommen kort. Verzamel de doorstroming, het voorgeklaarde materiaal dat is uitgeput van geaggregeerde eiwitten. Leg het op ijs en ga direct verder met de extractietest.Bereid buizen voor op SDS-PAGE-analyse. Voeg 45 microliter dubbel gedestilleerd water toe aan de ingangsbuis, 40 microliter water aan de doorstroombuis en 16,6 microliter 4x SDS-PAGE-laadbuffer aan elke buis. Bereid voor de extractietest de extractiereactie voor en breng het uiteindelijke volume met de extractiebuffer op 200 microliter.Verwarm vervolgens de extractietest gedurende twee minuten in een warmteblok van 30 graden Celsius. Om de test te starten, voegt u ATP toe aan een eindconcentratie van twee millimol. Draai de buis vijf seconden in een PicoFuge en incubeer hem gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius.Neem tijdens de incubatie een monster van vijf microliter van de reactie en voeg dit toe aan de ingangsbuis. Breng ook één glutathion-spinkolom in evenwicht voor elk monster in de extractietest zoals eerder aangetoond. Zodra de incubatie van 30 minuten is voltooid, voegt u 200 microliter extractiebuffer toe aan de buis, waardoor het totale volume op 400 microliter komt.Voeg vervolgens deze reactie toe aan de gebalanceerde glutathionhars en laat deze 30 minuten draaien bij vier graden Celsius. Draai na het draaien de kolommen om de doorstroom te verzamelen en neem vervolgens een monster van 10 microliter voor de doorstroombuis. Was de hars tweemaal met 400 microliter extractiebuffer en gooi de doorstroming na elke wasbeurt weg.Houd na de derde wasbeurt de doorstroming en neem een monster van 50 microliter voor de wasbuis. Bereid vervolgens vijf milliliter elutiebuffer door gereduceerd glutathion toe te voegen aan een eindconcentratie van vijf millimol in de extractiebuffer. Voeg 200 microliter van de elutiebuffer toe aan de spinkolom en incubeer gedurende vijf minuten.Centrifugeer vervolgens de kolom en verzamel de doorstroming. Herhaal de elutiestap nogmaals. Neem na de tweede elutie een aliquot van 50 microliter uit het elutiemonster en voeg dit toe aan de eluutbuis.Na het uitvoeren van een western blot kan de extractie-efficiëntie worden bepaald door de hoeveelheid substraat in de elutefractie te vergelijken met de inputfractie. Het signaal in de doorstroming vertoont enige variabiliteit, maar is over het algemeen vergelijkbaar met de ingangsfractie en er is geen signaal in de wasfractie. Doorgaans is er een extractie-efficiëntie van ongeveer 10% voor de positieve regeling en een extractie-efficiëntie van één tot 2% voor de negatieve regeling.Wanneer de reconstitutieomstandigheden niet zijn geoptimaliseerd, zijn de extractieniveaus vergelijkbaar tussen de positieve en negatieve monsters. Met deze techniek kon ons lab biofysische eigenschappen van de substraateffectherkenning door Msp1 testen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Het vastleggen van actief geproduceerde microbiële vluchtige organische stoffen uit mens-geassocieerde monsters met vacuümondersteunde sorptie-extractie

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...