Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
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MLW entwickelte einen Teil dieses Protokolls während seines Postdoc-Studiums bei Dr. Robert Keenan an der University of Chicago.
Diese Arbeit wird durch den NIH-Zuschuss 1R35GM137904-01 an MLW finanziert.

1. Liposomen-Vorbereitung
<ol><li>Kombinieren Sie Chloroform-Bestände von Lipiden in geeigneten Verhältnissen, um die äußere mitochondriale Membran nachzuahmen.<ol>
<li>Bereiten Sie 25 mg Lipidmischung vor. Wir verwenden eine zuvor etablierte Mischung von Lipiden, die mitochondriale Membranen nachahmen, bestehend aus einem molaren Verhältnis von 48:28:10:10:4 aus Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Hühnerei-Phosphatidylethanolamin (PE), Rinderleberphosphatidyl-Inositol (PI), synthetischem 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3...

Die richtige mitochondriale Funktion hängt von einem robusten Proteinqualitätskontrollsystem ab. Aufgrund inhärenter Grenzen in der Genauigkeit der TA-Protein-Targeting-Pfade sind falsch lokalisierte TA-Proteine eine ständige Stressquelle für Mitochondrien. Eine Schlüsselkomponente des mitochondrialen Proteostasenetzwerks ist Msp1, eine membranverankerte AAA + ATPase, die fehllokalisierte TA-Proteine aus dem OMM entfernt. Hier haben wir beschrieben, wie man Proteoliposomen herstellt, Msp1 und ein Modell-TA-Protein ...

Die richtige zelluläre Funktion hängt von einem Prozess namens Proteostase ab, der sicherstellt, dass funktionelle Proteine in der richtigen Konzentration und zellulären Position sind1. Versagen in der Proteostase führen zu einer beeinträchtigten Organellenfunktion und sind mit vielen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden2,3,4. Membranproteine stellen einzigartige Herausforderungen an das Proteostasenetzwerk dar, da sie auf die richtige Membran ausgerichtet werden müssen, während die Aggregation aus den hydrophoben Transmembrandomänen (TMDs) vermieden wird5. Folglich hat sich eine spezielle Maschinerie entwickelt, um die hydrophobe TMD vom Zytosol abzuschirmen und das Zielen und Einsetzen in die richtige Zellmembran zu erleichtern6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitochondrien sind das metabolische Zentrum der Zelle und an zahlreichen essentiellen zellulären Prozessen beteiligt, wie zum Beispiel: oxidative Phosphorylierung, Eisen-Schwefel-Cluster-Erzeugung und apoptotische Regulation16,17. Diese endosymbiotischen Organellen enthalten zwei Membranen, die als innere mitochondriale Membran (IMM) und äußere mitochondriale Membran (OMM) bezeichnet werden. Über 99% der 1.500 menschlichen mitochondrialen Proteine sind im Kerngenom kodiert und müssen über eine oder zwei verschiedene Membranen transloziert werden18,19. Die richtige mitochondriale Funktion hängt daher von einem robusten Proteostasenetzwerk ab, um Fehler beim Protein-Targeting oder bei der Translokation zu korrigieren.
Unser Labor konzentriert sich auf eine Untergruppe von mitochondrialen Membranproteinen, die als schwanzverankerte (TA) Proteine bezeichnet werden und eine einzelne Transmembrandomäne am C-Terminus20,21,22,23,24haben. TA-Proteine sind an einer Reihe von essentiellen Prozessen beteiligt, wie Apoptose, Vesikeltransport und Proteintranslokation25. Die einzigartige Topologie von TA-Proteinen erfordert eine posttranslationale Insertion, die im endoplasmatischen Retikulum (ER) durch den geführten Eintritt von Tail-verankerten (GET) oder endoplasmatischen Retikulummembranproteinkomplex (EMC) -Signalwegen oder in das OMM durch einen schlecht charakterisierten Wegauftritt 20,26,27,28. Die biophysikalischen Eigenschaften des TMD sind notwendig und ausreichend, um TA-Proteine zur richtigen Membran zu führen29. Die Erkennung biophysikalischer Merkmale anstelle eines definierten Sequenzmotivs schränkt die Genauigkeit der Targeting-Pfade ein5. Daher ist die Fehllokalisierung von TA-Proteinen ein häufiger Stress für die Proteostase-Netzwerke. Zellulärer Stress, wie die Hemmung des GET-Signalwegs, verursacht eine Zunahme der Proteinfehllokalisierung zum OMM und mitochondriale Dysfunktion, es sei denn, diese Proteine werden sofort entfernt30,31.
Ein häufiges Thema in der Membranproteostase ist die Verwendung von AAA+(ATPase Associated with cellular Activities) Proteinen, um alte, beschädigte oder fehllokalisierte Proteine aus der Lipiddoppelschicht1,32,33,34,35,36,37,38 zu entfernen . AAA+-Proteine sind molekulare Motoren, die hexamere Ringe bilden und ATP-abhängigen Bewegungen unterzogen werden, um ein Substrat umzugestalten, oft durch Translokation durch eine schmale axiale Pore39,40. Obwohl große Anstrengungen unternommen wurden, um die Extraktion von Membranproteinen durch AAA + ATPasen zu untersuchen, sind die Rekonstitutionen komplex oder beinhalten eine Mischung aus Lipiden und Waschmittel41,42, was die experimentelle Kraft begrenzt, den Mechanismus der Substratextraktion aus der Lipiddoppelschicht zu untersuchen.
Msp1 ist eine hochkonservierte AAA+ ATPase, die im OMM und in den Peroxisomen verankert ist und eine entscheidende Rolle bei der Membranproteostase spielt, indem sie fehllokalisierte TA-Proteine43,44,45,46,47entfernt. Es wurde kürzlich auch gezeigt, dass Msp1 den mitochondrialen Proteinimportstress lindert, indem es Membranproteine entfernt, die während der Translokation über das OMM48zum Stillstand kommen. Der Verlust von Msp1 oder des menschlichen Homologs ATAD1 führt zu mitochondrialer Fragmentierung, Versagen bei der oxidativen Phosphorylierung, Krampfanfällen, erhöhten Verletzungen nach Schlaganfall und frühem Tod31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Wir haben gezeigt, dass es möglich ist, TA-Proteine mit Msp1 ko-rekonstituieren und die Extraktion aus der Lipiddoppelschicht57nachzuweisen. Dieses vereinfachte System verwendet vollständig gereinigte Proteine, die zu definierten Liposomen rekonstituiert sind, die das OMM nachahmen (Abbildung 1)58,59. Diese Ebene der experimentellen Kontrolle kann detaillierte mechanistische Fragen der Substratextraktion angehen, die experimentell unlösbar sind, mit komplexeren Rekonstitutionen, an denen andere AAA+ Proteine beteiligt sind. Hier stellen wir experimentelle Protokolle zur Verfügung, die unsere Methoden zur Liposomenpräparation, zur Membranproteinrekonstitution und zum Extraktionsassay beschreiben. Wir hoffen, dass diese experimentellen Details die weitere Untersuchung des wesentlichen, aber wenig verstandenen Prozesses der Membranproteostase erleichtern werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Als Zentrum für oxidative Phosphorylierung und apoptotische Regulation spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit. Die richtige mitochondriale Funktion hängt von einem robusten Qualitätskontrollsystem ab, um die Proteinhomöostase (Proteostase) aufrechtzuerhalten. Der Rückgang der mitochondrialen Proteostase wurde mit Krebs, Alterung, Neurodegeneration und vielen anderen Krankheiten in Verbindung gebracht. Msp1 ist eine AAA+ ATPase, die in der äußeren mitochondrialen Membran verankert ist und die Proteostase aufrechterhält, indem sie falsch lokalisierte schwanzverankerte Proteine entfernt. Unter Verwendung von gereinigten Komponenten, die zu Proteoliposomen rekonstituiert wurden, haben wir gezeigt, dass Msp1 notwendig und ausreichend ist, um ein modellhaftes schwanzverankertes Protein aus einer Lipiddoppelschicht zu extrahieren. Unser vereinfachtes rekonstituiertes System überwindet mehrere der technischen Barrieren, die eine detaillierte Untersuchung der Membranproteinextraktion behindert haben. Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Generierung von Liposomen, zur Membranproteinrekonstitution und zum Msp1-Extraktionsassay zur Verfügung.

Um die Ergebnisse richtig zu interpretieren, müssen das fleckenfreie Gel und der Western Blot zusammen betrachtet werden. Das fleckenfreie Gel sorgt für eine gleichmäßige Belastung aller Proben. Bei der Betrachtung des fleckenfreien Gels sind die Chaperone (GST-Calmodulin und GST-SGTA) in den Spuren INPUT (I) und ELUTE (E) sichtbar. Überprüfen Sie, ob die Intensität dieser Bänder in allen INPUT-Samples einheitlich ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Intensität in den ELUTE-Proben gleichmäßig ist. Der E...

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Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten in definierten Proteoliposomen vor.

Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Die Verwendung von AAA-ATPasen zur Entfernung von Proteinen aus einer Lipiddoppelschicht ist ein häufiges Thema in der Proteinqualitätskontrolle. Ein mechanistisches Verständnis dieses wesentlichen Prozesses erfordert ein rekonstituiertes System. Die bisherige Rekonstitution mit AAA-ATPasen war komplex und heterogen.Unser System ist einfach und vollständig definiert. Dies ermöglicht es uns, die AAA-ATPase Msp1, das Substrat und die Lipidumgebung zu manipulieren. Um zu beginnen, fügen Sie zuvor vorbereiteten Rekonstitutionspuffer, gereinigte Msp1- und TA-Proteine und Liposomen in einem PCR-Röhrchen hinzu und inkubieren Sie dann die Mischung für 10 Minuten auf Eis.Schneiden Sie während der Inkubation die Spitze einer P200-Pipettenspitze auf einen Durchmesser von etwa 1/8 Zoll. Als nächstes das Röhrchen, das BioBeads enthält, gründlich schwenken, um eine gleichmäßige Mischung zu erhalten. Entfernen Sie dann schnell den Deckel und verwenden Sie die geschnittene P200-Pipettenspitze, um ein geeignetes Volumen der Perlen in ein leeres PCR-Röhrchen zu übertragen.Sobald die 10-minütige Inkubation zur Rekonstitution abgeschlossen ist, entfernen Sie mit einer ungeschnittenen Pipettenspitze die gesamte Flüssigkeit aus den BioBeads. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter der Rekonstitution mit den BioBeads in die Röhre und lassen Sie sie 16 Stunden lang auf einem Rad drehen. Drehen Sie am nächsten Tag das Röhrchen in einer PicoFuge, um die Perlen zu pelletieren, übertragen Sie dann das rekonstituierte Material in ein sauberes PCR-Rohr und halten Sie das Röhrchen auf Eis.Um Proteine zu entfernen, die sich nicht in die Liposomen rekonstituieren konnten, balancieren Sie die Glutathion-Spinsäulen mit Extraktionspuffer, was typischerweise drei Waschrunden mit 400 Mikrolitern Puffer beinhaltet, gefolgt von einer Zentrifugation, um den Puffer zu entfernen. Als nächstes fügen Sie fünf Mikromol jedes Chaperons in das rekonstituierte Material hinzu, gefolgt von 100 Mikroliter Extraktionspuffer, wodurch das Volumen auf 200 Mikroliter steigt. Fügen Sie diese Mischung zu den äquilibrierten Glutathion-Spinsäulen hinzu, stecken Sie dann die Spinsäulen ein und drehen Sie sie für 30 Minuten, damit sich die Chaperone an das Harz binden können.Drehen Sie die Spalten nach der Rotation kurz. Sammeln Sie den Durchfluss, bei dem es sich um das vorgereinigte Material handelt, das an aggregierten Proteinen erschöpft ist. Legen Sie es auf Eis und fahren Sie direkt mit dem Extraktionsassay fort.Bereiten Sie Röhrchen für die SDB-PAGE-Analyse vor. Fügen Sie 45 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in das Eingangsrohr, 40 Mikroliter Wasser in das Durchflussrohr und 16,6 Mikroliter 4X SDS-PAGE-Ladepuffer in jedes Rohr hinzu. Bereiten Sie für den Extraktionsassay die Extraktionsreaktion vor und erhöhen Sie das Endvolumen mit dem Extraktionspuffer auf 200 Mikroliter.Dann wälzen Sie den Extraktionsassay in einem 30-Grad-Celsius-Hitzeblock für zwei Minuten vor. Um den Assay einzuleiten, geben Sie ATP in eine endgültige Konzentration von zwei Millimol hinzu. Drehen Sie die Röhre fünf Sekunden lang in einer PicoFuge und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius.Nehmen Sie während der Inkubation eine fünf Mikroliter schwere Probe der Reaktion und geben Sie sie in das Eingangsröhrchen. Gleichen Sie auch eine Glutathion-Spin-Säule für jede Probe im Extraktionsassay aus, wie zuvor gezeigt. Sobald die 30-minütige Inkubation abgeschlossen ist, fügen Sie dem Röhrchen 200 Mikroliter Extraktionspuffer hinzu, wodurch das Gesamtvolumen auf 400 Mikroliter erhöht wird.Dann fügen Sie diese Reaktion dem gleichgewichtigen Glutathionharz hinzu und lassen Sie es 30 Minuten bei vier Grad Celsius drehen. Drehen Sie nach der Rotation die Säulen, um den Durchfluss zu sammeln, und nehmen Sie dann eine 10-Mikroliter-Probe für das Durchflussrohr. Waschen Sie das Harz zweimal mit 400 Mikrolitern Extraktionspuffer und verwerfen Sie den Durchfluss nach jeder Wäsche.Nach der dritten Wäsche den Durchfluss beibehalten und eine 50-Mikroliter-Probe für das Waschrohr entnehmen. Als nächstes bereiten Sie fünf Milliliter Elutionspuffer vor, indem Sie reduziertes Glutathion zu einer Endgültigen Konzentration von fünf Millimol im Extraktionspuffer hinzufügen. 200 Mikroliter des Elutionspuffers in die Spinsäule geben und fünf Minuten lang inkubieren.Dann zentrifugieren Sie die Säule und sammeln Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie den Elutionsschritt noch einmal. Nach der zweiten Elution nehmen Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot aus der Elutionsprobe und geben Ihn in das Elutenröhrchen.Nach dem Ausführen eines Western Blot kann die Extraktionseffizienz bestimmt werden, indem die Substratmenge in der elutierten Fraktion mit der Eingangsfraktion verglichen wird. Das Signal im Durchfluss zeigt eine gewisse Variabilität, ähnelt aber im Allgemeinen der Eingangsfraktion, und es gibt kein Signal in der Waschfraktion. Typischerweise gibt es einen Extraktionswirkungsgrad von etwa 10 % für die Positivkontrolle und einen Extraktionswirkungsgrad von ein bis 2 % für die Negativkontrolle.Wenn die Rekonstitutionsbedingungen nicht optimiert sind, sind die Extraktionsmengen zwischen den positiven und negativen Proben vergleichbar. Diese Technik ermöglichte es unserem Labor, die biophysikalischen Eigenschaften des Substrats zu testen, die die Erkennung durch Msp1 beeinflussen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Forschung

Biochemie

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Gewinnung aktiv produzierter mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen aus humanassoziierten Proben mit vakuumgestützter Sorptionsmittelextraktion

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

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Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach Behandlung von Escherichia coli mit einem proteotoxischen Stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...