Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
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MLW ha sviluppato parte di questo protocollo durante i suoi studi post-dottorato con il Dr. Robert Keenan presso l'Università di Chicago.
Questo lavoro è finanziato dalla sovvenzione NIH 1R35GM137904-01 a MLW.

1. Preparazione dei liposomi
<ol><li>Combinare le scorte di cloroformio dei lipidi in rapporti appropriati per imitare la membrana mitocondriale esterna.<ol>
<li>Preparare 25 mg di miscela lipidica. Utilizziamo una miscela precedentemente stabilita di lipidi che imitano le membrane mitocondriali, costituita da un rapporto molare 48:28:10:10:4 di fosfatidilcolina (PC) uovo di gallina, fosfatidil etanolammina (PE) dell'uovo di gallina, fosfatidil-inositolo (PI) del fegato bovino, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina ...

La corretta funzione mitocondriale dipende da un robusto sistema di controllo della qualità delle proteine. A causa dei limiti intrinseci nella fedeltà delle vie di targeting delle proteine TA, le proteine TA mal localizzate sono una fonte costante di stress per i mitocondri. Un componente chiave della rete di proteostasi mitocondriale è Msp1, che è una membrana ancorata AAA + ATPasi che rimuove le proteine TA mal localizzate dall'OMM. Qui, abbiamo descritto come preparare i proteoliposomi, co-ricostituire Msp1 e una...

La corretta funzione cellulare dipende da un processo chiamato proteostasi, che assicura che le proteine funzionali siano alla corretta concentrazione e posizione cellulare1. I fallimenti nella proteostasi portano a compromissione della funzione degli organelli e sono associati a molte malattie neurodegenerative2,3,4. Le proteine di membrana presentano sfide uniche per la rete di proteostasi in quanto devono essere mirate alla membrana corretta evitando l'aggregazione dai domini transmembrana idrofobici (TMD)5. Di conseguenza, macchinari specializzati si sono evoluti per proteggere la TMD idrofobica dal citosol e facilitare il targeting e l'inserimento nella corretta membrana cellulare6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.
I mitocondri sono il fulcro metabolico della cellula e sono coinvolti in numerosi processi cellulari essenziali quali: fosforilazione ossidativa, generazione di cluster ferro-zolfo e regolazione apoptotica16,17. Questi organelli endosimbiotici contengono due membrane, denominate membrana mitocondriale interna (IMM) e membrana mitocondriale esterna (OMM). Oltre il 99% delle 1.500 proteine mitocondriali umane sono codificate nel genoma nucleare e devono essere traslocate attraverso una o due diverse membrane18,19. La corretta funzione mitocondriale dipende quindi da una robusta rete di proteostasi per correggere eventuali errori nel targeting o nella traslocazione delle proteine.
Il nostro laboratorio si concentra su un sottoinsieme di proteine di membrana mitocondriale chiamate proteine ancorate alla coda (TA), che hanno un singolo dominio transmembrana al C-terminus20,21,22,23,24. Le proteine TA sono coinvolte in una serie di processi essenziali, come l'apoptosi, il trasporto delle vescicole e la traslocazione delle proteine25. La topologia unica delle proteine TA richiede l'inserimento post-traduzionale, che avviene nel reticolo endoplasmatico (ER) da parte del Guided Entry of Tail-anchored (GET) o delle vie EMC (EMC) del reticolo endoplasmatico o nell'OMM da una via scarsamente caratterizzata20,26,27,28. Le proprietà biofisiche della TMD sono necessarie e sufficienti per guidare le proteine TA alla corretta membrana29. Il riconoscimento delle caratteristiche biofisiche piuttosto che di un motivo di sequenza definito limita la fedeltà delle vie di targeting5. Pertanto, l'errata localizzazione delle proteine TA è uno stress comune per le reti di proteostasi. Lo stress cellulare, come l'inibizione della via GET, provoca un aumento della mislocalizzazione proteica all'OMM e disfunzione mitocondriale a meno che queste proteine non vengano prontamente rimosse30,31.
Un tema comune nella proteostasi di membrana è l'uso di proteine AAA+(ATPasi Associate con attività cellulari A)per rimuovere proteine vecchie, danneggiate o mal localizzate dal doppio strato lipidico1,32,33,34,35,36,37,38 . Le proteine AAA+ sono motori molecolari che formano anelli esamerici e subiscono movimenti dipendenti dall'ATP per rimodellare un substrato, spesso per traslocazione attraverso uno stretto poro assiale39,40. Sebbene grande sforzo sia stato dedicato allo studio dell'estrazione di proteine di membrana da parte delle ATPasi AAA+, le ricostituzioni sono complesse o coinvolgono una miscela di lipidi e detergente41,42,che limita il potere sperimentale di esaminare il meccanismo di estrazione del substrato dal doppio strato lipidico.
Msp1 è un'ATPasi AAA+ altamente conservata ancorata nell'OMM e nei perossisomi che svolge un ruolo critico nella proteostasi di membrana rimuovendo le proteine TA43, 44,45,46,47,erroneamente non localizzate. Msp1 ha anche recentemente dimostrato di alleviare lo stress da importazione di proteine mitocondriali rimuovendo le proteine di membrana che si bloccano durante la traslocazione attraverso l'OMM48. La perdita di Msp1 o dell'omologo umano ATAD1 provoca frammentazione mitocondriale, fallimenti nella fosforilazione ossidativa, convulsioni, aumento delle lesioni a seguito di ictus e morte precoce31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Abbiamo dimostrato che è possibile co-ricostituire le proteine TA con Msp1 e rilevare l'estrazione dal doppio strato lipidico57. Questo sistema semplificato utilizza proteine completamente purificate ricostituite in liposomi definiti che imitano l'OMM (Figura 1)58,59. Questo livello di controllo sperimentale può affrontare dettagliate questioni meccanicistiche di estrazione del substrato che sono sperimentalmente intrattabili con ricostituzioni più complesse che coinvolgono altre proteine AAA +. Qui, forniamo protocolli sperimentali che descrivono in dettaglio i nostri metodi per la preparazione dei liposomi, la ricostituzione delle proteine di membrana e il test di estrazione. La nostra speranza è che questi dettagli sperimentali facilitino ulteriori studi sul processo essenziale ma poco compreso della proteostasi di membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Come centro per la fosforilazione ossidativa e la regolazione apoptotica, i mitocondri svolgono un ruolo vitale nella salute umana. La corretta funzione mitocondriale dipende da un robusto sistema di controllo della qualità per mantenere l'omeostasi proteica (proteostasi). Il declino della proteostasi mitocondriale è stato collegato al cancro, all'invecchiamento, alla neurodegenerazione e a molte altre malattie. Msp1 è un'ATPasi AAA+ ancorata nella membrana mitocondriale esterna che mantiene la proteostasi rimuovendo le proteine non localizzate ancorate alla coda. Utilizzando componenti purificati ricostituiti in proteoliposomi, abbiamo dimostrato che Msp1 è necessario e sufficiente per estrarre una proteina modello ancorata alla coda da un doppio strato lipidico. Il nostro sistema ricostituito semplificato supera molte delle barriere tecniche che hanno ostacolato lo studio dettagliato dell'estrazione delle proteine di membrana. Qui, forniamo metodi dettagliati per la generazione di liposomi, la ricostituzione delle proteine di membrana e il test di estrazione Msp1.

Per interpretare correttamente i risultati, il gel antimacchia e il western blot devono essere visti insieme. Il gel antimacchia garantisce un carico uguale su tutti i campioni. Quando si visualizza il gel antimacchia, gli accompagnatori (GST-calmodulina e GST-SGTA) saranno visibili nelle corsie INPUT (I) ed ELUTE (E). Ricontrollare che l'intensità di queste bande sia uniforme su tutti i campioni INPUT. Allo stesso modo, assicurarsi che l'intensità sia uniforme tra i campioni ELUTE. L'ELUTE è 5 volte più concentrato ...

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Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostituzione dell'attività di estrazione di Msp1 con componenti completamente purificati in proteolipolisi definiti.

Ricostituzione dell'attività estrattiva msp1 con componenti completamente purificati

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

L'uso di AAA-ATPasi per rimuovere le proteine da un doppio strato lipidico è un tema comune nel controllo della qualità delle proteine. Una comprensione meccanicistica di questo processo essenziale richiede un sistema ricostituito. La precedente ricostituzione con AAA-ATPasi era complessa ed eterogenea.Il nostro sistema è semplice e completamente definito. Questo ci permette di manipolare l'AAA-ATPasi Msp1, il substrato e l'ambiente lipidico. Per iniziare, aggiungere tampone di ricostituzione precedentemente preparato, proteine Msp1 e TA purificate e liposomi in un tubo PCR, quindi incubare la miscela su ghiaccio per 10 minuti.Durante l'incubazione, tagliare la punta di una punta della pipetta P200 a circa 1/8 di pollice di diametro. Quindi, ruotare accuratamente il tubo contenente BioBeads per ottenere una miscela uniforme. Quindi, rimuovere rapidamente il coperchio e utilizzare la punta della pipetta P200 tagliata per trasferire un volume appropriato delle perline in un tubo PCR vuoto.Una volta completata l'incubazione di 10 minuti per la ricostituzione, utilizzando una punta della pipetta non tagliata, rimuovere tutto il liquido dalle BioBeads. Quindi, trasferire 100 microlitri della ricostituzione nel tubo con le BioBeads e lasciarlo ruotare su una ruota per 16 ore. Il giorno seguente, ruotare il tubo in un PicoFuge per pellettare le perline, quindi trasferire il materiale ricostituito in un tubo PCR pulito e mantenere il tubo sul ghiaccio.Per rimuovere le proteine che non sono riuscite a ricostituirsi nei liposomi, equilibrare le colonne di spin del glutatione con il tampone di estrazione, che in genere comporta tre cicli di lavaggio con 400 microlitri di tampone, seguiti da centrifugazione per rimuovere il tampone. Quindi, aggiungere cinque micromoli di ciascun chaperone al materiale ricostituito, seguiti da 100 microlitri di tampone di estrazione, portando il volume fino a 200 microlitri. Aggiungere questa miscela alle colonne di spin del glutatione bilanciate, quindi tappare le colonne di spin e ruotarle per 30 minuti, consentendo agli accompagnatori di legarsi alla resina.Dopo la rotazione, ruotare brevemente le colonne. Raccogli il flow-through, che è il materiale pre-eliminato impoverito di proteine aggregate. Metterlo su ghiaccio e procedere direttamente al test di estrazione.Preparare i tubi per l'analisi SDS-PAGE. Aggiungere 45 microlitri di acqua distillata doppia al tubo di ingresso, 40 microlitri d'acqua al tubo passante e 16,6 microlitri di buffer di caricamento 4X SDS-PAGE a ciascun tubo. Per il test di estrazione, preparare la reazione di estrazione e portare il volume finale a 200 microlitri con il tampone di estrazione.Quindi, preriscaldare il test di estrazione in un blocco di calore a 30 gradi Celsius per due minuti. Per iniziare il test, aggiungere ATP a una concentrazione finale di due millimoli. Ruotare il tubo per cinque secondi in un PicoFuge e incubarlo a 30 gradi Celsius per 30 minuti.Durante l'incubazione, prelevare un campione di cinque microlitri della reazione e aggiungerlo al tubo di ingresso. Inoltre, equilibrare una colonna di spin del glutatione per ciascun campione nel test di estrazione, come dimostrato in precedenza. Una volta completata l'incubazione di 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di tampone di estrazione al tubo, portando il volume totale a 400 microlitri.Quindi, aggiungere questa reazione alla resina di glutatione equilibrata e lasciarla ruotare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la rotazione, ruotare le colonne per raccogliere il flusso passante, quindi prelevare un campione di 10 microlitri per il tubo passante. Lavare la resina due volte con 400 microlitri di tampone di estrazione, scartando il flusso dopo ogni lavaggio.Dopo il terzo lavaggio, mantenere il flusso e prelevare un campione di 50 microlitri per il tubo di lavaggio. Quindi, preparare cinque millilitri di tampone di eluizione aggiungendo glutatione ridotto a una concentrazione finale di cinque millimoli nel tampone di estrazione. Aggiungere 200 microlitri del tampone di eluizione alla colonna di spin e incubare per cinque minuti.Quindi, centrifugare la colonna e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere ancora una volta il passaggio di eluizione. Dopo la seconda eluizione, prelevare un'aliquota di 50 microlitri dal campione di eluizione e aggiungerla al tubo di eluizione.Dopo aver eseguito un western blot, l'efficienza di estrazione può essere determinata confrontando la quantità di substrato nella frazione eluta con la frazione di input. Il segnale nel flusso attraverso mostra una certa variabilità, ma è generalmente simile alla frazione di ingresso e non c'è segnale nella frazione di lavaggio. In genere, vi è un'efficienza di estrazione di circa il 10% per il controllo positivo e un'efficienza di estrazione da uno al 2% per il controllo negativo.Quando le condizioni di ricostituzione non sono ottimizzate, i livelli di estrazione sono comparabili tra i campioni positivi e negativi. Questa tecnica ha permesso al nostro laboratorio di testare le proprietà biofisiche del substrato influenzano il riconoscimento da parte di Msp1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

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Ricerca

Biochimica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

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Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

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In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

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Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

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Estrazione e visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento di Escherichia coli con un fattore di stress proteotossico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...