Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
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MLWは、シカゴ大学のロバート・キーナン博士との博士後期研究中に、このプロトコルの一部を開発しました。
この作業は、NIH助成金1R35GM137904-01 MLWに資金を提供しています。

1. リポソーム製剤
<ol><li>適切な比率で脂質のクロロホルムストックを組み合わせて、外のミトコンドリア膜を模倣します。<ol>
<li>脂質混合物の25mgを調製します。ミトコンドリア膜を模倣する脂質の既に確立された混合物を使用し、 鶏卵ホスファチジルコリン(PC)、鶏卵ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ウシ肝臓ホスファチジルイノシトール(PI)、合成1,2-ジオレオイルの48:28:10:10:4モル比?...

適切なミトコンドリア機能は、堅牢なタンパク質の品質管理システムに依存します。TAタンパク質ターゲティング経路の忠実度に固有の限界のために、誤局化TAタンパク質はミトコンドリアのストレスの一定の源です。ミトコンドリアプロテオスタシスネットワークの重要な成分はMsp1であり、これはOMMから誤局的なTAタンパク質を除去する膜固定AAA+ATPaseである。ここでは、プロテオリポソー?...

適切な細胞機能は、機能的タンパク質が正しい濃度と細胞位置1であることを保証するプロテオスタシスと呼ばれるプロセスに依存します。プロテオスタシスの障害は、オルガネラ機能の低下を招き、多くの神経変性疾患2、3、4に関連している。膜タンパク質は、疎水性膜貫通ドメイン(TM)5からの凝集を避けながら、正しい膜を標的としなければならないプロテオスタシスネットワークに固有の課題を提示する。その結果、特殊化された機械は、疎水性TMDをサイトゾルから保護し、適切な細胞膜6、7、8、9、10、11、12、13、14、15への標的化と挿入を容易にするために進化しました。
ミトコンドリアは細胞の代謝ハブであり、酸化リン酸化、鉄硫黄クラスター生成、アポトーシスレギュレーション16、17など、数多くの必須細胞プロセスに関与している。これらの子宮内生体オルガネラは、ミトコンドリア膜(IMM)および外ミトコンドリア膜(OMM)と呼ばれる2つの膜を含む。1,500個のヒトミトコンドリアタンパク質の99%以上が核ゲノムにコードされており、1つまたは2つの異なる膜18、19に渡ってトランスロケーションする必要がある。したがって、適切なミトコンドリア機能は、タンパク質ターゲティングまたは転座の誤差を修正するために、堅牢なプロテオスタシスネットワークに依存します。
私たちの研究室では、非常にC末に20、21、22、23、24の単一の膜貫通ドメインを有する、尾アンカー(TA)タンパク質と呼ばれるミトコンドリア膜タンパク質のサブセットに焦点を当てています。TAタンパク質は、アポトーシス、小胞輸送、およびタンパク質転座25などの多くの必須プロセスに関与している。TAタンパク質のユニークなトポロジーは、尾アンカー(GET)またはエンドパラムレチラム膜タンパク質複合体(EMC)経路によって導付入り(GET)によって小胞体(ER)で起こる、または十分に特徴付けの経路20、26、27、28によってOMMに起こる翻訳後挿入を必要とする。TMDの生物物理学的性質は、TAタンパク質を正しい膜29に導くために必要であり、十分である。定義された配列モチーフではなく生物物理学的特徴の認識は、標的経路5の忠実さを制限する。したがって、TAタンパク質の誤局在化は、プロテオスタシスネットワークに対する一般的なストレスである。細胞ストレスは、GET経路の阻害などの、これらのタンパク質が速やかに除去されない限りOMMおよびミトコンドリア機能障害に対するタンパク質の誤局在化の増加を引き起こす30,31。
膜プロテオスタシスの一般的なテーマは、AAA+ (細胞A ctivitiesでソシエ化されたTPase A)タンパク質を使用して、脂質二重層1、32、33、34、35、36、37、38から古い、損傷した、または誤局化したタンパク質を除去することです。 .AAA+タンパク質は、六方体環を形成し、基板を改造するためにATP依存的な動きを受ける分子モーターであり、しばしば狭い軸孔39、40を通して転位することによって。AAA+ATPasesによる膜タンパク質の抽出の研究には多大な努力が必要であったが、再構成は複雑であるか、脂質と洗剤41,42の混合物を含み、脂質二重層からの基質抽出のメカニズムを調べる実験力を制限する。
Msp1は、OMMおよびペルオキシソームに固定された高度に保存されたAAA+ATPaseであり、誤局化したTAタンパク質43、44、45、46、47を除去することによって膜プロテオスタシスにおいて重要な役割を果たす。Msp1は、OMM48を横断する転座の間に失速する膜タンパク質を除去することによって、ミトコンドリアタンパク質のインポートストレスを軽減することも最近示された。Msp1またはヒトホモログATAD1の喪失は、ミトコンドリア断片化、酸化リン酸化の障害、発作、脳卒中後の傷害の増加、および早期死亡31、49、50、51、52、53、54、55、56をもたらす。
我々は、TAタンパク質をMsp1と共再構成し、脂質二重層57からの抽出を検出することが可能であることを示した。この簡略化されたシステムは、完全に精製されたタンパク質を、OMM(図1)58、59を模倣する定義されたリポソームに再構成して使用する。このレベルの実験的制御は、他のAAA+タンパク質を含むより複雑な再構成で実験的に難解な基質抽出の詳細な機械学的な質問に対処することができます。ここでは、リポソーム調製法、膜タンパク質再構成法、抽出アッセイの方法を詳述した実験的プロトコルを提供します。これらの実験の詳細が、膜プロテオスタシスの本質的だが十分に理解されていないプロセスのさらなる研究を促進することを期待しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

酸化リン酸化とアポトーシス調節の中心として、ミトコンドリアは人間の健康に重要な役割を果たします。適切なミトコンドリア機能は、タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)を維持するための堅牢な品質管理システムに依存します。ミトコンドリアプロテオスタシスの低下は、癌、老化、神経変性、および他の多くの疾患に関連している。Msp1は、ミトコンドリア外膜に固定されたAAA+ATPaseであり、誤局化したテールアンカータンパク質を除去することによってプロテオスタシスを維持します。精製した成分をプロテオリポソームに再構成し、Msp1が脂質二重層からモデルのテールアンカータンパク質を抽出するのに十分であることを示しました。当社の簡略化された再構成システムは、膜タンパク質抽出の詳細な研究を妨げている技術的障壁のいくつかを克服します。ここでは、リポソームの生成、膜タンパク質の再構成、Msp1抽出アッセイの詳細な方法を提供します。

結果を正しく解釈するには、染色フリーゲルとウェスタンブロットを一緒に見る必要があります。染色フリーゲルは、すべてのサンプルで等しい負荷を保証します。染色フリーゲルを見ると、シャペロン(GST-カルモドゥリンおよびGST-SGTA)がINPUT(I)およびELUTE(E)レーンに表示されます。これらのバンドの強度がすべての INPUT サンプルで均一であることを再確認します。同様に、輝度が ELUTE サン?...

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Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

ここでは、定義されたプロテオリポソームにおける完全に精製された成分を用いたMsp1抽出活性の再構成のための詳細なプロトコルを提示する。

完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

脂質二重層からタンパク質を除去するAAA-ATPasesの使用は、タンパク質の品質管理における一般的なテーマです。この本質的なプロセスの機械論的理解には、再構成されたシステムが必要です。AAA-ATPEsによる以前の再構成は複雑で異質であった。当社のシステムはシンプルで完全に定義されています。これにより、AAA-ATPase Msp1、基質、脂質環境を操作することができます。まず、以前に調製した再構成バッファー、精製 Msp1 および TA タンパク質およびリポソームを PCR チューブに加え、氷上で 10 分間インキュベートします。インキュベーション中に、P200ピペットチップの先端を直径約1/8インチに切ります。次に、バイオビーズを含むチューブを完全に渦液にして、均一な混合物を得る。次に、蓋を素早く取り外し、カットされたP200ピペットチップを使用して、適切な量のビーズを空のPCRチューブに移します。10分間の再構成用インキュベーションが完了したら、ノーカットピペットチップを使用して、Bioビーズからすべての液体を取り除きます。その後、再構成の100マイクロリットルをBioビーズでチューブに移し、車輪で16時間回転させます。翌日、ピコフュージでチューブを回転させてビーズをペレット化し、再構成した材料をクリーンなPCRチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。リポソームへの再構成に失敗したタンパク質を除去するために、グルタチオンスピンカラムを抽出バッファで平衡化し、通常は400マイクロリットルのバッファで3ラウンドの洗浄を行い、続いて遠心分離して緩衝液を除去する。次に、再構成された材料に各シャペロンの5マイクロモルを加え、その後に100マイクロリットルの抽出バッファーを加え、最大200マイクロリットルの体積を持ち込みます。この混合物を平衡化したグルタチオンスピンカラムに加え、スピンカラムを差し込んで30分間回転させ、シャペロンを樹脂に結合させます。回転後、列を短く回転させます。凝集したタンパク質の枯渇したクリア済み材料であるフロースルーを収集します。氷の上に置き、抽出アッセイに直接進みます。SDS-PAGE分析用のチューブを準備します。入力チューブに45マイクロリットルの二重蒸留水、フロースルーチューブに40マイクロリットルの水、各チューブに4X SDS-PAGEローディングバッファの16.6マイクロリットルを加えます。抽出アッセイの場合、抽出反応を調製し、抽出バッファーで最終容積を 200 マイクロリットルまで持ち出します。その後、抽出アッセイを摂氏30度の熱ブロックで2分間温めます。アッセイを開始するには、ATPを2ミリモルの最終濃度に加えます。ピコフュージで5秒間チューブを回転させ、30°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション中に、反応の5マイクロリットルのサンプルを取り、入力チューブに加えます。また、先に示したように抽出アッセイ中の各サンプルについて1つのグルタチオンスピンカラムを平衡化する。30分間のインキュベーションが完了したら、200マイクロリットルの抽出バッファーをチューブに加えて、合計容量を400マイクロリットルにします。次に、この反応を平衡グルタチオン樹脂に加え、摂氏4度で30分間回転させます。回転後、カラムを回転してフロースルーを集め、フロースルーチューブ用に10マイクロリットルのサンプルを取ります。400マイクロリットルの抽出バッファーで樹脂を2回洗浄し、洗浄後にフロースルーを廃棄します。3回目の洗浄後、フロースルーを維持し、洗浄チューブ用に50マイクロリットルのサンプルを取ります。次に、抽出バッファー内の 5 ミリモルの最終濃度に還元されたグルタチオンを加えることによって溶出バッファーの 5 ミリリットルを準備します。.200マイクロリットルの溶出バッファーをスピンカラムに加え、5分間インキュベートします。次に、カラムを遠心分離し、フロースルーを収集します。溶出のステップをもう一度繰り返します。2回目の溶出後、溶出サンプルから50マイクロリットルのアリコートを取り出し、それをエルテチューブに加えます。ウェスタンブロットを実行した後、抽出効率は、エルト分数中の基質の量を入力画分と比較することによって決定することができる。フロースルーの信号はある程度の変動性を示していますが、一般的には入力分数に似ており、洗浄端数には信号がありません。典型的には、陽性対照に対して約10%の抽出効率があり、負の対照には1〜2%の抽出効率がある。再構成条件が最適化されていない場合、抽出レベルは正サンプルと負サンプルの間で比較可能です。この技術により、私たちの研究室は、Msp1による認識に影響を与える基質の生物物理学的特性をテストすることができました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

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Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

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体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

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Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

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携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

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Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

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タンパク質毒性ストストレスマによる 大腸菌 治療後のタンパク質凝集体の抽出と可視化

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...