Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

MLW utviklet en del av denne protokollen under sine postdoktorstudier med Dr. Robert Keenan ved University of Chicago.
Dette arbeidet er finansiert av NIH grant 1R35GM137904-01 til MLW.

1. Liposom forberedelse
<ol><li>Kombiner kloroformlagre av lipider i passende forhold for å etterligne den ytre mitokondriemembranen.<ol>
<li>Forbered 25 mg lipidblanding. Vi bruker en tidligere etablert blanding av lipider som etterligner mitokondriemembraner, bestående av en 48:28:10:10:4 molar forholdet mellom kyllingeggfosfatidyl kolin (PC), kyllingeggfosfatidyl etanolamin (PE), bovin leverfosfatidyl inositol (PI), syntetisk 1,2-dioleoyl--sn-glysero-3-fosfo-L-serin (DOPS) og syntetisk 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-gl...

Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust proteinkvalitetskontrollsystem. På grunn av iboende grenser i gjengivelsen av TA-proteinmålrettingsveiene, er feillokaliserte TA-proteiner en konstant kilde til stress for mitokondrier. En nøkkelkomponent i mitokondrieproteostasenettverket er Msp1, som er en membran forankret AAA + ATPase som fjerner feillokaliserte TA-proteiner fra OMM. Her har vi beskrevet hvordan du lager proteoliposomer, korekonstituerer Msp1 og et modell TA-protein, og utfører en ekstraksjonsanaly...

Riktig cellulær funksjon avhenger av en prosess som kalles proteostase, som sikrer at funksjonelle proteiner er i riktig konsentrasjon og cellulær plassering1. Feil i proteostase fører til kompromittert organellefunksjon og er forbundet med mange nevrodegenerative sykdommer2,3,4. Membranproteiner gir unike utfordringer for proteostasenettverket, da de må målrettes mot riktig membran samtidig som de unngår aggregering fra de hydrofobe transmembrandomenene (TMDs)5. Følgelig har spesialiserte maskiner utviklet seg for å beskytte den hydrofobe TMD fra cytosolen og lette målretting og innsetting i riktig cellulær membran6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitokondrier er cellens metabolske nav og er involvert i mange viktige cellulære prosesser som: oksidativ fosforylering, jern-svovelklyngegenerering og apoptotisk regulering16,17. Disse endosymbiotiske organellene inneholder to membraner, referert til som den indre mitokondriemembranen (IMM) og den ytre mitokondriemembranen (OMM). Over 99% av de 1500 humane mitokondrieproteinene er kodet i atomgenomet og må omfordeles over en eller to forskjellige membraner18,19. Riktig mitokondriefunksjon avhenger derfor av et robust proteostasenettverk for å korrigere eventuelle feil i proteinmålretting eller translokasjon.
Laboratoriet vårt fokuserer på en undergruppe av mitokondriemembranproteiner kalt hale-forankrede (TA) proteiner, som har et enkelt transmembrandomene ved selve C-terminus20,21,22,23,24. TA-proteiner er involvert i en rekke essensielle prosesser, for eksempel apoptose, vesicle transport og proteintranslokasjon25. Den unike topologien til TA-proteiner krever post-translasjonell innsetting, som forekommer i endoplasmic retikulum (ER) ved guided entry of Tail-anchored (GET) eller Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) veier eller inn i OMM av en dårlig karakterisert sti20,26,27,28. De biofysiske egenskapene til TMD er nødvendige og tilstrekkelige til å lede TA-proteiner til riktigmembran 29. Anerkjennelsen av biofysiske egenskaper i stedet for et definert sekvensmotiv begrenser gjengivelsen av målrettingsveiene5. Dermed er feillokalisering av TA-proteiner et vanlig stress for proteostasenettverkene. Cellulært stress, som hemming av GET-banen, forårsaker en økning i protein feillokalisering til OMM og mitokondrie dysfunksjon med mindre disse proteinene fjernes raskt30,31.
Et vanlig tema i membranproteostase er bruken av AAA+ (ATPase Associated med cellulære Activities) proteiner for å fjerne gamle, skadede eller feillokaliserte proteiner fra lipidbilayeren1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA+ proteiner er molekylære motorer som danner heksameriske ringer og gjennomgår ATP-avhengige bevegelser for å ombygge et substrat, ofte ved omplassering gjennom en smal aksial pore39,40. Selv om det har vært lagt stor innsats for å studere utvinning av membranproteiner av AAA + ATPases, er rekonstitueringene komplekse eller involverer en blanding av lipider og vaskemiddel41,42, som begrenser den eksperimentelle kraften til å undersøke mekanismen for substratutvinning fra lipidbilayeren.
Msp1 er en høyt bevart AAA + ATPase forankret i OMM og peroksisomer som spiller en kritisk rolle i membranproteostase ved å fjerne feilaliserte TA-proteiner43,44,45,46,47. Msp1 ble også nylig vist å lindre mitokondrieproteinimportstress ved å fjerne membranproteiner som stopper under translokasjon over OMM48. Tap av Msp1 eller den menneskelige homologEN ATAD1 resulterer i mitokondriefragmentering, svikt i oksidativ fosforylering, anfall, økt skade etter hjerneslag og tidlig død31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Vi har vist at det er mulig å co-rekonstituere TA-proteiner med Msp1 og oppdage utvinningen fra lipidbilayeren57. Dette forenklede systemet bruker fullt rensede proteiner rekonstituert i definerte liposomer som etterligner OMM (figur 1)58,59. Dette nivået av eksperimentell kontroll kan adressere detaljerte mekanistiske spørsmål om substratutvinning som er eksperimentelt intractable med mer komplekse rekonstitueringer som involverer andre AAA + proteiner. Her tilbyr vi eksperimentelle protokoller som beskriver våre metoder for liposompreparat, membranproteinrekonstituering og ekstraksjonsanalysen. Det er vårt håp at disse eksperimentelle detaljene vil lette videre studier av den essensielle, men dårlig forståtte prosessen med membranproteostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Som senter for oksidativ fosforylering og apoptotisk regulering spiller mitokondrier en viktig rolle i menneskers helse. Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust kvalitetskontrollsystem for å opprettholde protein homeostase (proteostase). Nedgang i mitokondrieproteostase har vært knyttet til kreft, aldring, nevrodegenerasjon og mange andre sykdommer. Msp1 er en AAA+ ATPase forankret i den ytre mitokondriemembranen som opprettholder proteostase ved å fjerne feilaliserte hale-forankrede proteiner. Ved hjelp av rensede komponenter rekonstituert i proteoliposomer, har vi vist at Msp1 er nødvendig og tilstrekkelig til å trekke ut et modell hale-forankret protein fra en lipid bilayer. Vårt forenklede rekonstituerte system overvinner flere av de tekniske barrierene som har hindret detaljert studie av membranproteinutvinning. Her gir vi detaljerte metoder for generering av liposomer, membranproteinrekonstituering og Msp1-ekstraksjonsanalysen.

For å tolke resultatene riktig, må den flekkfrie gelen og den vestlige blot ses sammen. Den flekkfrie gelen sikrer lik lasting på tvers av alle prøver. Når du ser på den flekkfrie gelen, vil anstandene (GST-calmodulin og GST-SGTA) være synlige i INNGANGS- (I) og ELUTE (E)-banene. Dobbeltsjekk at intensiteten til disse båndene er jevn på tvers av alle INPUT-prøvene. På samme måte må du sørge for at intensiteten er jevn på tvers av ELUTE-prøvene. ELUTE er 5x mer konsentrert enn INPUT, og denne forskjellen i...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Her presenterer vi en detaljert protokoll for rekonstituering av Msp1 utvinning aktivitet med fullt rensede komponenter i definerte proteoliposomer.

Rekonstituering av msp1-ekstraksjonsaktivitet med fullstendig rensede komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Bruk av AAA-ATPases for å fjerne proteiner fra en lipid bilayer er et vanlig tema i proteinkvalitetskontroll. En mekanistisk forståelse av denne essensielle prosessen krever et rekonstituert system. Tidligere rekonstituering med AAA-ATPases var kompleks og heterogen.Vårt system er enkelt og fullt definert. Dette gjør at vi kan manipulere AAA-ATPase Msp1, substratet og lipidmiljøet. Til å begynne med, legg til tidligere forberedt rekonstitueringsbuffer, renset Msp1 og TA-proteiner og liposomer i et PCR-rør, og inkuber deretter blandingen på is i 10 minutter.Under inkubasjonen, kutt spissen av en P200 pipettespiss til ca. 1/8 av en tomme i diameter. Deretter virveler røret som inneholder BioBeads grundig for å oppnå en jevn blanding. Fjern deretter lokket raskt og bruk den kuttede P200 pipettespissen til å overføre et passende volum av perlene til et tomt PCR-rør.Når den 10-minutters inkubasjonen for rekonstituering er fullført, fjerner du all væske fra BioBeads ved hjelp av en uklippet pipettespiss. Overfør deretter 100 mikroliter av rekonstitueringen inn i røret med BioBeads og la den rotere på et hjul i 16 timer. Neste dag, spinn røret i en PicoFuge for å pellet perlene, og overfør deretter det rekonstituerte materialet til et rent PCR-rør og hold røret på is.For å fjerne proteiner som ikke klarte å rekonstituere i liposomene, likevekt glutathione spinn kolonner med ekstraksjon buffer, som vanligvis innebærer tre runder med vask med 400 mikroliter buffer, etterfulgt av sentrifugering for å fjerne bufferen. Deretter legger du til fem mikromoler av hver anstand til det rekonstituerte materialet, etterfulgt av 100 mikroliter ekstraksjonsbuffer, noe som bringer volumet opp til 200 mikroliter. Legg denne blandingen til de likevektede glutathione spinnkolonnene, koble deretter spinnkolonnene og roter dem i 30 minutter, slik at anstandene kan binde seg til harpiksen.Etter rotasjon, snurr kolonnene kort. Samle gjennomstrømningen, som er det forhåndsklarerte materialet utarmet av aggregerte proteiner. Legg den på isen og fortsett direkte til ekstraksjonsanalysen.Forbered rør for SDS-PAGE analyse. Tilsett 45 mikroliter dobbelt destillert vann til inngangsrøret, 40 mikroliter vann til gjennomstrømningsrøret og 16,6 mikroliter 4X SDS-PAGE lastebuffer til hvert rør. For ekstraksjonsanalysen, forbered ekstraksjonsreaksjonen og få opp det endelige volumet til 200 mikroliter med ekstraksjonsbufferen.Deretter forvarmer ekstraksjonsanalysen i en 30-graders Celsius varmeblokk i to minutter. For å starte analysen, legg ATP til en endelig konsentrasjon på to millimoles. Snurr røret i fem sekunder i en PicoFuge, og inkuber det ved 30 grader Celsius i 30 minutter.Under inkubasjonen, ta en fem mikroliterprøve av reaksjonen og legg den til inngangsrøret. Likevekt en glutathione spinnkolonne for hver prøve i ekstraksjonsanalysen som vist tidligere. Når den 30-minutters inkubasjonen er fullført, tilsett 200 mikroliter ekstraksjonsbuffer til røret, og bringer det totale volumet til 400 mikroliter.Legg deretter denne reaksjonen til den likevektede glutathioneharpiksen og la den rotere i 30 minutter ved fire grader Celsius. Etter rotasjon, snurr kolonnene for å samle gjennomstrømningen, og ta deretter en 10-mikroliterprøve for gjennomstrømningsrøret. Vask harpiksen to ganger med 400 mikroliter ekstraksjonsbuffer, og kast gjennomstrømningen etter hver vask.Etter den tredje vasken, hold gjennomstrømningen og ta en 50 mikroliterprøve til vaskerøret. Deretter forbereder du fem milliliter elutionbuffer ved å legge redusert glutathione til en endelig konsentrasjon på fem millimoler i utvinningsbufferen. Tilsett 200 mikroliter av elutionbufferen i spinnkolonnen og inkuber i fem minutter.Deretter sentrifugerer du kolonnen og samler gjennomstrømningen. Gjenta elution trinnet igjen. Etter den andre elutionen, ta en 50-mikroliter aliquot fra elution prøven og legg den til elute røret.Etter å ha kjørt en vestlig flekk, kan utvinningseffektiviteten bestemmes ved å sammenligne mengden substrat i elutefraksjonen med inngangsfraksjonen. Signalet i gjennomstrømningen viser en viss variasjon, men ligner generelt på inngangsfraksjonen, og det er ikke noe signal i vaskefraksjonen. Vanligvis er det en omtrent 10% utvinning effektivitet for den positive kontrollen og en en til 2% utvinning effektivitet for den negative kontrollen.Når rekonstitueringsforholdene ikke er optimalisert, er utvinningsnivåene sammenlignbare mellom de positive og negative prøvene. Denne teknikken tillot laboratoriet vårt å teste ut biofysiske egenskaper til substratet som påvirker anerkjennelsen av Msp1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analysering av proteinkinaseaktivitet med radiomerket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymatisk aktivitet og genuttrykk av koffein syntase fra anlegget celle suspensjoner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt selvstendig karakterisering og datainnsamling fra krystaller av biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Fange aktivt produserte mikrobielle flyktige organiske forbindelser fra human-assosierte prøver med vakuumassistert sorbentutvinning

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Ekstraksjon og visualisering av proteinaggregater etter behandling av Escherichia coli med en protetoksisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering av aktiv caenorhabditt elegans kjernefysisk ekstrakt og rekonstituering for in vitro transkripsjon

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...