Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

MLW разработал часть этого протокола во время своих постдокторских исследований с доктором Робертом Кинаном в Чикагском университете.
Эта работа финансируется грантом NIH 1R35GM137904-01 для MLW.

1. Подготовка липосом
<ol><li>Объедините запасы хлороформа липидов в соответствующих соотношениях, чтобы имитировать внешнюю митохондриальную мембрану.<ol>
<li>Приготовить 25 мг липидной смеси. Мы используем ранее установленную смесь липидов, имитирующих митохондриальные мембраны, состоящ...

Правильная функция митохондрий зависит от надежной системы контроля качества белка. Из-за присущих ограничений в точности путей таргетирования белка TA, неправильно локализованные белки TA являются постоянным источником стресса для митохондрий. Ключевым компонентом сети митохондриал...

Правильная клеточная функция зависит от процесса, называемого протеостазом, который гарантирует, что функциональные белки находятся в правильной концентрации и клеточном расположении1. Сбои в протеостазе приводят к нарушению функции органелл и связаны со многими нейродегенеративными заболеваниями2,3,4. Мембранные белки представляют собой уникальные проблемы для сети протеостаза, поскольку они должны быть нацелены на правильную мембрану, избегая при этом агрегации из гидрофобных трансмембранных доменов (TMD)5. Следовательно, специализированные механизмы эволюционировали, чтобы защитить гидрофобную ВНЧС от цитозоля и облегчить нацеливание и введение в правильную клеточную мембрану6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Митохондрии являются метаболическим центром клетки и участвуют в многочисленных важных клеточных процессах, таких как: окислительное фосфорилирование, генерация железо-серного кластера и апоптотическая регуляция16,17. Эти эндосимбиотические органеллы содержат две мембраны, называемые внутренней митохондриальной мембраной (IMM) и внешней митохондриальной мембраной (OMM). Более 99% из 1 500 митохондриальных белков человека кодируются в ядерном геноме и должны быть перемещены через одну или две различные мембраны18,19. Таким образом, правильная функция митохондрий зависит от надежной сети протеостаза для исправления любых ошибок в нацеливании на белок или транслокации.
Наша лаборатория фокусируется на подмножестве белков митохондриальной мембраны, называемых белками хвостового якоря (TA), которые имеют один трансмембранный домен на самом С-конце20,21,22,23,24. Белки TA участвуют в ряде важных процессов, таких как апоптоз, транспорт пузырьков и транслокация белка25. Уникальная топология белков ТА требует посттрансляционной вставки, которая происходит в эндоплазматическом ретикулуме (ER) по направляющему входу хвостового якорного (GET) или эндоплазматического ретикулярного мембранного белкового комплекса (EMC) или в ОММ по плохо охарактеризованному пути20,26,27,28. Биофизические свойства ВНЧС необходимы и достаточны для направления белков ТА к правильной мембране29. Распознавание биофизических характеристик, а не определенного мотива последовательности, ограничивает точность путей нацеливания5. Таким образом, неправильная локализация белков ТА является общим стрессом для сетей протеостаза. Клеточный стресс, такой как ингибирование пути GET, вызывает увеличение неправильной локализации белка к ОММ и митохондриальную дисфункцию, если эти белки не будут быстро удалены30,31.
Общей темой в мембранном протеостазе является использование белков AAA+(ATPase A,ссоциированная с клеточными активами A)для удаления старых, поврежденных или неправильно локализованных белков из липидного бислоя1,32,33,34,35,36,37,38 . Белки AAA+ представляют собой молекулярные двигатели, которые образуют гексамерные кольца и подвергаются АТФ-зависимым движениям для ремоделирования субстрата, часто путем транслокации через узкую осевую пору39,40. Хотя большие усилия были посвящены изучению экстракции мембранных белков AAA+ ATPases, реконструкции являются сложными или включают смесь липидов и моющего средства41,42,что ограничивает экспериментальную способность исследовать механизм экстракции субстрата из липидного бислоя.
Msp1 представляет собой высококонсервативную ААА+ АТФазу, закрепленную в ОММ и пероксисомах, которая играет решающую роль в мембранном протеостазе путем удаления неправильно локализованных белков ТА43,44,45,46,47. Недавно было также показано, что Msp1 облегчает стресс импорта митохондриальных белков путем удаления мембранных белков, которые останавливаются во время транслокации через OMM48. Потеря Msp1 или человеческого гомолога ATAD1 приводит к фрагментации митохондрий, сбоям в окислительном фосфорилировании, судорогам, увеличению травматизма после инсульта и ранней смерти31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Мы показали, что можно совместно воссоздать белки ТА с Msp1 и обнаружить экстракцию из липидного бислоя57. Эта упрощенная система использует полностью очищенные белки, преобразованные в определенные липосомы, которые имитируют OMM(Рисунок 1)58,59. Этот уровень экспериментального контроля может решить подробные механистические вопросы экстракции субстрата, которые экспериментально трудноразрешимы с более сложными восстановлениями с участием других белков AAA+. Здесь мы предоставляем экспериментальные протоколы, подробно описывающие наши методы получения липосом, восстановления мембранного белка и экстракционного анализа. Мы надеемся, что эти экспериментальные детали облегчат дальнейшее изучение существенного, но плохо изученного процесса мембранного протеостаза.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Являясь центром окислительного фосфорилирования и апоптотической регуляции, митохондрии играют жизненно важную роль в здоровье человека. Правильная функция митохондрий зависит от надежной системы контроля качества для поддержания белкового гомеостаза (протеостаза). Снижение митохондриального протеостаза было связано с раком, старением, нейродегенерацией и многими другими заболеваниями. Msp1 представляет собой АТФазу AAA+, закрепленную во внешней митохондриальной мембране, которая поддерживает протеостаз путем удаления неправильно локализованных хвостовых белков. Используя очищенные компоненты, преобразованные в протеолипосомы, мы показали, что Msp1 необходим и достаточен для извлечения модельного хвостового белка из липидного бислоя. Наша упрощенная восстановленная система преодолевает несколько технических барьеров, которые препятствовали детальному изучению экстракции мембранного белка. Здесь мы предоставляем подробные методы генерации липосом, восстановления мембранного белка и экстракционного анализа Msp1.

Чтобы правильно интерпретировать результаты, гель без пятен и вестерн-блот должны рассматриваться вместе. Гель без пятен обеспечивает одинаковую нагрузку на все образцы. При просмотре геля без пятен шапероны (GST-calmodulin и GST-SGTA) будут видны в полосах INPUT (I) и ELUTE (E). Дважды проверьте, что инте...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Здесь мы представляем подробный протокол восстановления экстракционной активности Msp1 с полностью очищенными компонентами в определенных протеолипосомах.

Восстановление экстракции Msp1 с полностью очищенными компонентами

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Использование AAA-АТФаз для удаления белков из липидного бислоя является общей темой в контроле качества белка. Механистическое понимание этого важнейшего процесса требует воссозданной системы. Предыдущая реконструкция с помощью AAA-ATPases была сложной и неоднородной.Наша система проста и полностью определена. Это позволяет нам манипулировать AAA-ATPase Msp1, субстратом и липидной средой. Для начала добавьте в ПЦР-трубку предварительно приготовленный восстановительный буфер, очищенные белки msp1 и TA и липосомы, затем инкубируйте смесь на льду в течение 10 минут.Во время инкубации отрежьте наконечник пипетки P200 примерно до 1/8 дюйма в диаметре. Затем тщательно вихрьте трубку, содержащую bioBeads, чтобы получить однородную смесь. Затем быстро снимите крышку и используйте вырезанный наконечник пипетки P200, чтобы перенести соответствующий объем шариков в пустую трубку ПЦР.Как только 10-минутная инкубация для восстановления будет завершена, используя неразрезанный наконечник пипетки, удалите всю жидкость из BioBeads. Затем переложите 100 микролитров восстановления в трубку с помощью BioBeads и позвольте ей вращаться на колесе в течение 16 часов. На следующий день вращайте трубку в PicoFuge, чтобы гранулировать бусины, затем перенесите восстановленный материал в чистую трубку ПЦР и держите трубку на льду.Для удаления белков, которые не смогли восстановиться в липосомах, уравновешивайте спиновые колонки глутатиона экстракционным буфером, который обычно включает в себя три раунда промывки с 400 микролитрами буфера с последующим центрифугированием для удаления буфера. Затем добавьте пять микромолей каждого шаперона к восстановленному материалу, а затем 100 микролитров экстракционного буфера, доведя объем до 200 микролитров. Добавьте эту смесь в уравновешенные спиновые колонки глутатиона, затем заткните спиновые колонны и вращайте их в течение 30 минут, позволяя шаперонам связываться со смолой.После вращения вращайте колонны ненадолго. Соберите сквозной поток, который представляет собой предварительно очищенный материал, обедненный агрегированными белками. Поместите его на лед и непосредственно приступайте к экстракционному анализу.Подготовьте трубки для анализа SDS-PAGE. Добавьте 45 микролитров двойной дистиллированной воды во входную трубку, 40 микролитров воды в проточную трубку и 16,6 микролитра 4X SDS-PAGE загрузочного буфера в каждую трубку. Для экстракционного анализа подготовьте реакцию экстракции и доведите конечный объем до 200 микролитров с помощью экстракционного буфера.Затем предварительно прогрейте экстракционный анализ в тепловом блоке с температурой 30 градусов Цельсия в течение двух минут. Чтобы начать анализ, добавляют АТФ к конечной концентрации в два миллимоля. Вращайте трубку в течение пяти секунд в PicoFuge и высиживайте ее при 30 градусах Цельсия в течение 30 минут.Во время инкубации возьмите пятимикролитровый образец реакции и добавьте его во входную трубку. Кроме того, уравновешивайте одну спиновую колонку глутатиона для каждого образца в экстракционном анализе, как показано ранее. После завершения 30-минутной инкубации добавьте в трубку 200 микролитров экстракционного буфера, доведя общий объем до 400 микролитров.Затем добавьте эту реакцию к уравновешенной глутатионной смоле и дайте ей вращаться в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После вращения раскрутите колонны, чтобы собрать сквозной поток, затем возьмите 10-микролитровый образец для проточной трубки. Промывайте смолу дважды 400 микролитрами экстракционного буфера, отбрасывая проточную поверхность после каждой промывки.После третьей промывки держите проточную и возьмите 50-микролитровый образец для промывочной трубки. Затем подготовьте пять миллилитров буфера элюирования, добавив восстановленный глутатион к конечной концентрации пяти миллимолей в буфере экстракции. Добавьте 200 микролитров буфера элюирования в спиновую колонку и высиживайте в течение пяти минут.Затем центрифугируйте колонну и соберите сквозной поток. Повторите шаг элюирования еще раз. После второго элюирования возьмите 50-микролитровую аликвоту из образца элюирования и добавьте ее в трубку элюда.После проведения вестерн-блот эффективности экстракции можно определить, сравнив количество субстрата в элютивной фракции с входной фракцией. Сигнал в проточном потоке показывает некоторую изменчивость, но в целом похож на входную фракцию, и в дроби промывки нет сигнала. Как правило, существует приблизительно 10% эффективность экстракции для положительного контроля и от одного до 2% эффективности экстракции для отрицательного контроля.Когда условия восстановления не оптимизированы, уровни экстракции сопоставимы между положительными и отрицательными образцами. Этот метод позволил нашей лаборатории проверить биофизические свойства субстрата, распознающего влияние Msp1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

В пробирке Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Восстановление клеточного цикла колебаний в микроэмульсий свободных клеток Xenopus яйцо экстрактов

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Улавливание активно производимых микробных летучих органических соединений из образцов, связанных с человеком, с помощью вакуумной экстракции сорбента

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...