Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
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MLW desarrolló parte de este protocolo durante sus estudios postdoctorales con el Dr. Robert Keenan en la Universidad de Chicago.
Este trabajo está financiado por la subvención 1R35GM137904-01 de los NIH a MLW.

1. Preparación de liposomas
<ol><li>Combine las reservas de cloroformo de lípidos en proporciones apropiadas para imitar la membrana mitocondrial externa.<ol>
<li>Preparar 25 mg de mezcla lipídica. Utilizamos una mezcla previamente establecida de lípidos que imitan las membranas mitocondriales, que consiste en una proporción molar de 48:28:10:10:4 de fosfatidilcolina de huevo de gallina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) de huevo de gallina, fosfatidil inositol hepático bovino (PI), sintético 1,2-dioleoil-sn-glice...

La función mitocondrial adecuada depende de un sistema robusto de control de calidad de proteínas. Debido a los límites inherentes en la fidelidad de las vías de orientación de la proteína TA, las proteínas TA mal localizadas son una fuente constante de estrés para las mitocondrias. Un componente clave de la red de proteostasis mitocondrial es Msp1, que es una AAA+ ATPasa anclada a la membrana que elimina las proteínas TA mal localizadas de la OMM. Aquí, hemos descrito cómo preparar proteoliposomas, co-reconst...

La función celular adecuada depende de un proceso llamado proteostasis, que asegura que las proteínas funcionales estén en la concentración y ubicación celularcorrectas 1. Las fallas en la proteostasis conducen a una función orgánulo comprometida y se asocian con muchas enfermedades neurodegenerativas2,3,4. Las proteínas de membrana presentan desafíos únicos para la red de proteostasis, ya que deben dirigirse a la membrana correcta, evitando al mismo tiempo la agregación de los dominios transmembrana hidrofóbicos (TMD)5. En consecuencia, la maquinaria especializada ha evolucionado para proteger el TMD hidrofóbico del citosol y facilitar la orientación y la inserción en la membrana celular adecuada6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Las mitocondrias son el centro metabólico de la célula y están involucradas en numerosos procesos celulares esenciales como: fosforilación oxidativa, generación de cúmulos de hierro-azufre y regulación apoptótica16,17. Estos orgánulos endosimbióticos contienen dos membranas, conocidas como la membrana mitocondrial interna (IMM) y la membrana mitocondrial externa (OMM). Más del 99% de las 1.500 proteínas mitocondriales humanas están codificadas en el genoma nuclear y necesitan ser translocadas a través de una o dos membranas diferentes18,19. Por lo tanto, la función mitocondrial adecuada depende de una red de proteostasis robusta para corregir cualquier error en la orientación o translocación de proteínas.
Nuestro laboratorio se centra en un subconjunto de proteínas de membrana mitocondrial llamadas proteínas ancladas en la cola (TA), que tienen un solo dominio transmembrana en el extremo C20,21,22,23,24. Las proteínas TA están involucradas en una serie de procesos esenciales, como la apoptosis, el transporte de vesículas y la translocación de proteínas25. La topología única de las proteínas TA requiere la inserción post-traduccional, que ocurre en el retículo endoplásmico (ER) por la entrada guiada de las vías del complejo proteico de membrana (EMC) anclada en la cola (GET) o en el retículo endoplásmico (EMC) o en el OMM por una vía mal caracterizada20,26,27,28. Las propiedades biofísicas del TMD son necesarias y suficientes para guiar las proteínas TA a la membrana correcta29. El reconocimiento de características biofísicas en lugar de un motivo de secuencia definido limita la fidelidad de las vías de orientación5. Por lo tanto, la localización errónea de las proteínas TA es un estrés común para las redes de proteostasis. El estrés celular, como la inhibición de la vía GET, causa un aumento en la mala localización de proteínas a la OMM y disfunción mitocondrial a menos que estas proteínas se eliminen rápidamente30,31.
Un tema común en la proteostasis de membrana es el uso de proteínas AAA+(ATPasa Associada con calidades Acelulares) para eliminar proteínas viejas, dañadas o mal localizadas de la bicapa lipídica1,32,33,34,35,36,37,38 . Las proteínas AAA+ son motores moleculares que forman anillos hexaméricos y sufren movimientos dependientes de ATP para remodelar un sustrato, a menudo por translocación a través de un estrecho poro axial39,40. Aunque se ha dedicado un gran esfuerzo a estudiar la extracción de proteínas de membrana por AAA+ ATPasas, las reconstituciones son complejas o implican una mezcla de lípidos y detergente41,42,lo que limita el poder experimental para examinar el mecanismo de extracción del sustrato a partir de la bicapa lipídica.
Msp1 es una AAA+ ATPasa altamente conservada anclada en la OMM y los peroxisomas que desempeña un papel crítico en la proteostasis de membrana al eliminar las proteínas TA mal localizadas43,44,45,46,47. Msp1 también se demostró recientemente que alivia el estrés de importación de proteínas mitocondriales al eliminar las proteínas de membrana que se estancan durante la translocación a través de la OMM48. La pérdida de Msp1 o el homólogo humano ATAD1 resulta en fragmentación mitocondrial, fallas en la fosforilación oxidativa, convulsiones, aumento de lesiones después de un accidente cerebrovascular y muerte prematura31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Hemos demostrado que es posible co-reconstituir proteínas TA con Msp1 y detectar la extracción de la bicapa lipídica57. Este sistema simplificado utiliza proteínas totalmente purificadas reconstituidas en liposomas definidos que imitan el OMM(Figura 1)58,59. Este nivel de control experimental puede abordar cuestiones mecanicistas detalladas de extracción de sustrato que son experimentalmente intratables con reconstituciones más complejas que involucran otras proteínas AAA +. Aquí, proporcionamos protocolos experimentales que detallan nuestros métodos para la preparación de liposomas, la reconstitución de proteínas de membrana y el ensayo de extracción. Esperamos que estos detalles experimentales faciliten un mayor estudio del proceso esencial pero poco comprendido de la proteostasis de la membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Como centro de fosforilación oxidativa y regulación apoptótica, las mitocondrias desempeñan un papel vital en la salud humana. La función mitocondrial adecuada depende de un sistema de control de calidad robusto para mantener la homeostasis de proteínas (proteostasis). Las disminuciones en la proteostasis mitocondrial se han relacionado con el cáncer, el envejecimiento, la neurodegeneración y muchas otras enfermedades. Msp1 es una AAA+ ATPasa anclada en la membrana mitocondrial externa que mantiene la proteostasis mediante la eliminación de proteínas mal localizadas ancladas en la cola. Utilizando componentes purificados reconstituidos en proteoliposomas, hemos demostrado que Msp1 es necesario y suficiente para extraer una proteína modelo anclada a la cola de una bicapa lipídica. Nuestro sistema reconstituido simplificado supera varias de las barreras técnicas que han obstaculizado el estudio detallado de la extracción de proteínas de membrana. Aquí, proporcionamos métodos detallados para la generación de liposomas, la reconstitución de proteínas de membrana y el ensayo de extracción Msp1.

Para interpretar correctamente los resultados, el gel libre de manchas y la mancha occidental deben verse juntos. El gel sin manchas garantiza una carga igual en todas las muestras. Al ver el gel libre de manchas, las chaperonas (GST-calmodulin y GST-SGTA) serán visibles en los carriles INPUT (I) y ELUTE (E). Verifique que la intensidad de estas bandas sea uniforme en todas las muestras input. Del mismo modo, asegúrese de que la intensidad sea uniforme en todas las muestras eluticas. El ELUTE es 5 veces más concentrad...

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Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados en proteoliposomas definidos.

Reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

El uso de AAA-ATPasas para eliminar proteínas de una bicapa lipídica es un tema común en el control de calidad de proteínas. Una comprensión mecanicista de este proceso esencial requiere un sistema reconstituido. La reconstitución previa con AAA-ATPasas fue compleja y heterogénea.Nuestro sistema es simple y está completamente definido. Esto nos permite manipular la AAA-ATPasa Msp1, el sustrato y el entorno lipídico. Para comenzar, agregue el tampón de reconstitución previamente preparado, las proteínas Msp1 y TA purificadas y los liposomas en un tubo de PCR, luego incube la mezcla en hielo durante 10 minutos.Durante la incubación, corte la punta de una punta de pipeta P200 a aproximadamente 1/8 de pulgada de diámetro. A continuación, vórtice el tubo que contiene BioBeads a fondo para obtener una mezcla uniforme. Luego, retire rápidamente la tapa y use la punta de pipeta P200 cortada para transferir un volumen apropiado de las perlas a un tubo de PCR vacío.Una vez que se complete la incubación de 10 minutos para la reconstitución, usando una punta de pipeta sin cortar, retire todo el líquido de las BioBeads. Luego, transfiera 100 microlitros de la reconstitución al tubo con los BioBeads y deje que gire sobre una rueda durante 16 horas. Al día siguiente, haga girar el tubo en un PicoFuge para peletizar las perlas, luego transfiera el material reconstituido a un tubo de PCR limpio y mantenga el tubo en hielo.Para eliminar las proteínas que no se reconstituyeron en los liposomas, equilibre las columnas de espín de glutatión con un tampón de extracción, que generalmente implica tres rondas de lavado con 400 microlitros de tampón, seguido de centrifugación para eliminar el tampón. A continuación, agregue cinco micromoles de cada chaperona al material reconstituido, seguido de 100 microlitros de tampón de extracción, lo que eleva el volumen a 200 microlitros. Agregue esta mezcla a las columnas de espín de glutatión equilibradas, luego tapone las columnas de espín y gírelas durante 30 minutos, permitiendo que las chaperonas se unan a la resina.Después de la rotación, gire las columnas brevemente. Recolectar el flujo a través, que es el material pre-limpiado agotado de proteínas agregadas. Colóquelo sobre hielo y proceda directamente al ensayo de extracción.Preparar tubos para el análisis SDS-PAGE. Agregue 45 microlitros de agua destilada doble al tubo de entrada, 40 microlitros de agua al tubo de flujo y 16.6 microlitros de búfer de carga 4X SDS-PAGE a cada tubo. Para el ensayo de extracción, prepare la reacción de extracción y eleve el volumen final a 200 microlitros con el tampón de extracción.Luego, precaliente el ensayo de extracción en un bloque de calor de 30 grados Celsius durante dos minutos. Para iniciar el ensayo, agregue ATP a una concentración final de dos milimoles. Gire el tubo durante cinco segundos en un PicoFuge e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos.Durante la incubación, tome una muestra de cinco microlitros de la reacción y agréguela al tubo de entrada. Además, equilibre una columna de espín de glutatión para cada muestra en el ensayo de extracción como se demostró anteriormente. Una vez que se complete la incubación de 30 minutos, agregue 200 microlitros de tampón de extracción al tubo, llevando el volumen total a 400 microlitros.Luego, agregue esta reacción a la resina de glutatión equilibrada y deje que gire durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la rotación, gire las columnas para recoger el flujo a través, luego tome una muestra de 10 microlitros para el tubo de flujo a través. Lave la resina dos veces con 400 microlitros de tampón de extracción, descartando el flujo después de cada lavado.Después del tercer lavado, mantenga el flujo y tome una muestra de 50 microlitros para el tubo de lavado. A continuación, prepare cinco mililitros de tampón de elución agregando glutatión reducido a una concentración final de cinco milimoles en el tampón de extracción. Agregue 200 microlitros del tampón de elución a la columna de centrifugado e incube durante cinco minutos.Luego, centrífuga la columna y recoge el flujo. Repita el paso de elución una vez más. Después de la segunda elución, tome una alícuota de 50 microlitros de la muestra de elución y agréguela al tubo elutorio.Después de ejecutar un western blot, la eficiencia de extracción se puede determinar comparando la cantidad de sustrato en la fracción elu con la fracción de entrada. La señal en el flujo muestra cierta variabilidad, pero generalmente es similar a la fracción de entrada, y no hay señal en la fracción de lavado. Por lo general, hay una eficiencia de extracción de aproximadamente el 10% para el control positivo y una eficiencia de extracción de uno a 2% para el control negativo.Cuando las condiciones de reconstitución no están optimizadas, los niveles de extracción son comparables entre las muestras positivas y negativas. Esta técnica permitió a nuestro laboratorio probar las propiedades biofísicas del reconocimiento del efecto del sustrato por Msp1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Investigación

Bioquímica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Caracterización totalmente autónoma y colección de datos de cristales de macromoléculas biológicas

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Captura de compuestos orgánicos volátiles microbianos producidos activamente a partir de muestras asociadas con humanos con extracción de sorbente asistida por vacío

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extracción y visualización de agregados proteicos después del tratamiento de Escherichia coli con un estresor proteotóxico

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...