Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

MLW utvecklade en del av detta protokoll under sina postdoktorala studier med Dr. Robert Keenan vid University of Chicago.
Detta arbete finansieras av NIH-anslag 1R35GM137904-01 till MLW.

1. Liposomberedning
<ol><li>Kombinera kloroformlager av lipider i lämpliga förhållanden för att efterlikna det yttre mitokondriella membranet.<ol>
<li>Förbered 25 mg lipidblandning. Vi använder en tidigare etablerad blandning av lipider som efterliknar mitokondriella membran, bestående av ett molarförhållande på 48:28:10:10:4 molar av kycklingäggfosforylkolin (PC), kycklingägg fosfatidyletanolamin (PE), bovin leverfosftidyl inositol (PI), syntetisk 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) och synte...

Korrekt mitokondriell funktion beror på ett robust proteinkvalitetskontrollsystem. På grund av inneboende gränser i troheten hos TA-proteinets inriktningsvägar är fellokaliserade TA-proteiner en konstant källa till stress för mitokondrier. En viktig komponent i mitokondriell proteostas nätverk är Msp1, som är ett membran förankrat AAA + ATPase som tar bort mislocalized TA proteiner från OMM. Här har vi beskrivit hur man förbereder proteoliposomer, co-reconstitute Msp1 och en modell TA protein, och utföra e...

Korrekt cellulär funktion beror på en process som kallas proteostas, vilket säkerställer att funktionella proteiner är vid rätt koncentration och cellulär plats1. Misslyckanden i proteostas leder till komprometterad organellfunktion och är associerade med många neurodegenerativa sjukdomar2,3,4. Membranproteiner innebär unika utmaningar för proteostasnätverket eftersom de måste riktas mot rätt membran samtidigt som aggregering undviks från de hydrofoba transmembrandomänerna (TMDs)5. Följaktligen har specialiserade maskiner utvecklats för att skydda den hydrofoba TMD från cytosolen och underlätta inriktning och införande i rätt cellmembran6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitokondrier är cellens metaboliska nav och är involverade i många viktiga cellulära processer som: oxidativ fosforylering, järn-svavelklustergenerering och apokatotisk reglering16,17. Dessa endosymbiotiska organeller innehåller två membran, så kallade inre mitokondriella membran (IMM) och det yttre mitokondriella membranet (OMM). Över 99% av de 1 500 mänskliga mitokondriella proteinerna är kodade i kärngenomet och måste omplaceras över ett eller två olika membran18,19. Korrekt mitokondriell funktion beror således på ett robust proteosasnätverk för att korrigera eventuella fel i proteininriktning eller flyttning.
Vårt labb fokuserar på en delmängd av mitokondriella membranproteiner som kallas tail-anchored (TA) proteiner, som har en enda transmembran domän vid mycket C-terminus20,21,22,23,24. TA-proteiner är involverade i ett antal väsentliga processer, såsom apoptos, blåsbandstransport och proteinflyttning25. Den unika topologin hos TA-proteiner kräver post-translationell insättning, som förekommer i endoplasmiskt retikulum (ER) genom guidad ingång av tail-förankrad (GET) eller endoplasmiskt retikulummembranproteinkomplex (EMC) eller in i OMM av en dåligt karakteriserad väg20,26,27,28. De biofysiska egenskaperna hos TMD är nödvändiga och tillräckliga för att styra TA-proteiner till rätt membran29. Erkännandet av biofysiska egenskaper snarare än ett definierat sekvensmotiv begränsar troheten hos inriktningsvägarna5. Således är mislocalization av TA-proteiner en vanlig stress för proteostasnätverken. Cellulär stress, såsom hämning av GET-vägen, orsakar en ökning av protein mislocalization till OMM och mitokondriell dysfunktion om inte dessa proteiner omedelbart avlägsnas30,31.
Ett vanligt tema i membranprotetas är användningen av AAA+(ATPase Associated with cellular Activities) proteiner för att ta bort gamla, skadade eller fellokaliserade proteiner från lipidbilayer1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA+ proteiner är molekylära motorer som bildar hexameriska ringar och genomgår ATP-beroende rörelser för att omforma ett substrat, ofta genom flyttning genom en smal axiell por39,40. Även om stor ansträngning har ägnats åt att studera extraktion av membranproteiner av AAA + ATPases, är rekonstitutionerna komplexa eller involverar en blandning av lipider och tvättmedel41,42, vilket begränsar den experimentella kraften att undersöka mekanismen för substratuttag från lipidbilayer.
Msp1 är en mycket bevarad AAA + ATPase förankrad i OMM och peroxisomer som spelar en kritisk roll i membranprotetas genom att ta bort fellokaliserade TA-proteiner43,44,45,46,47. Msp1 visade sig också nyligen lindra mitokondriell proteinimportstress genom att ta bort membranproteiner som stannar under flyttning över OMM48. Förlust av Msp1 eller den mänskliga homologen ATAD1 resulterar i mitokondriell fragmentering, misslyckanden i oxidativ fosforylering, anfall, ökad skada efter stroke och tidig död31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Vi har visat att det är möjligt att samrekonstituera TA-proteiner med Msp1 och upptäcka extraktionen från lipidbilayer57. Detta förenklade system använder helt renade proteiner som rekonstituerats till definierade liposomer som efterliknar OMM (figur 1)58,59. Denna nivå av experimentell kontroll kan ta itu med detaljerade mekanistiska frågor om substrat extraktion som är experimentellt svårbehandlade med mer komplexa rekonstitutioner som involverar andra AAA + proteiner. Här tillhandahåller vi experimentella protokoll som beskriver våra metoder för liposomberedning, membranproteinrekonstitution och extraktionsanalysen. Det är vår förhoppning att dessa experimentella detaljer kommer att underlätta ytterligare studier av den väsentliga men dåligt förstådda processen av membranprotetas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Som centrum för oxidativ fosforylering och apokatisk reglering spelar mitokondrier en viktig roll för människors hälsa. Korrekt mitokondriell funktion beror på ett robust kvalitetskontrollsystem för att upprätthålla proteinhomeostas (proteostas). Nedgångar i mitokondriell proteostas har kopplats till cancer, åldrande, neurodegeneration och många andra sjukdomar. Msp1 är en AAA + ATPase förankrad i det yttre mitokondriella membranet som upprätthåller proteostas genom att ta bort fellokaliserade svansförankrade proteiner. Med hjälp av renade komponenter rekonstituerade till proteoliposomer har vi visat att Msp1 är nödvändigt och tillräckligt för att extrahera ett modell svansförankrat protein från en lipidbilayer. Vårt förenklade rekonstituerade system övervinner flera av de tekniska hinder som har hindrat detaljerad studie av membranproteinutvinning. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för generering av liposomer, membranproteinrekonstitution och Msp1 extraktionsanalys.

För att korrekt tolka resultaten måste den fläckfria gelén och den västra fläcken ses tillsammans. Den fläckfria gelen säkerställer lika belastning i alla prover. Vid visning av fläckfri gel kommer förklädena (GST-kalmodulin och GST-SGTA) att vara synliga i inmatningsbanorna (I) och ELUTE (E). Dubbelkolla att intensiteten hos dessa band är enhetlig över alla INPUT-prover. Se också till att intensiteten är enhetlig över ELUTE-proverna. ELUTE är 5x mer koncentrerad än INPUT och denna skillnad i intensite...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för rekonstitution av Msp1 extraktion verksamhet med helt renade komponenter i definierade proteoliposomer.

Rekonstitution av Msp1-extraktionsaktivitet med helt renade komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Användningen av AAA-ATPases för att ta bort proteiner från en lipidbilayer är ett vanligt tema i proteinkvalitetskontroll. En mekanistisk förståelse av denna viktiga process kräver ett ombildat system. Tidigare rekonstitution med AAA-ATPases var komplexa och heterogena.Vårt system är enkelt och fullständigt definierat. Detta gör att vi kan manipulera AAA-ATPase Msp1, substratet och lipidmiljön. Till att börja med tillsätt tidigare förberedd rekonstitutionsbuffert, renade Msp1- och TA-proteiner och liposomer i ett PCR-rör och inkubera sedan blandningen på is i 10 minuter.Skär under inkubationen spetsen på en P200 pipetterspets till ca 1/8 tum i diameter. Virvla sedan röret som innehåller BioBeads noggrant för att få en enhetlig blandning. Ta sedan snabbt bort locket och använd den skurna P200 pipetterspetsen för att överföra en lämplig volym av pärlorna till ett tomt PCR-rör.När inkubationen på 10 minuter för rekonstitution är klar, med hjälp av en oklippt pipettspets, avlägsnar du all vätska från BioBeads. Överför sedan 100 mikroliter av rekonstitutionen till röret med BioBeads och låt den rotera på ett hjul i 16 timmar. Följande dag snurrar du röret i en PicoFuge för att pelletera pärlorna, överför sedan det rekonstituerade materialet till ett rent PCR-rör och håll röret på is.För att avlägsna proteiner som inte rekonstituerade sig i liposomerna, balansera glutationspinnpelarna med extraktionsbuffert, vilket vanligtvis innebär tre omgångar tvätt med 400 mikroliter buffert, följt av centrifugering för att ta bort bufferten. Tillsätt sedan fem mikromol av varje förkläde till det rekonstituerade materialet, följt av 100 mikroliter extraktionsbuffert, vilket ger volymen upp till 200 mikroliter. Tillsätt denna blandning till de ekvilibrerade glutationens spinnpelare, anslut sedan spinnpelarna och rotera dem i 30 minuter, så att förklädena kan binda till hartset.Efter rotation snurrar du kolumnerna kort. Samla genom flödet, som är det förklarade materialet utarmat av aggregerade proteiner. Placera den på is och fortsätt direkt till extraktionsanalysen.Förbered rör för SDS-PAGE-analys. Tillsätt 45 mikroliter dubbeldestillerat vatten till ingångsröret, 40 mikroliter vatten till genomflödesröret och 16,6 mikroliter 4X SDS-PAGE-lastbuffert till varje rör. För extraktionsanalysen, förbered extraktionsreaktionen och ta upp den slutliga volymen till 200 mikroliter med extraktionsbufferten.Förvarna sedan extraktionsanalysen i ett 30-graders Celsius värmeblock i två minuter. För att initiera analysen, tillsätt ATP till en slutlig koncentration av två millimol. Snurra röret i fem sekunder i en PicoFuge och inkubera det vid 30 grader Celsius i 30 minuter.Under inkubationen, ta ett fem mikroliterprov av reaktionen och tillsätt det i ingångsröret. Ekvilibrera en glutionspinnkolonn för varje prov i extraktionsanalysen som visats tidigare. När inkubationen på 30 minuter är klar, tillsätt 200 mikroliter extraktionsbuffert till röret, vilket ger den totala volymen till 400 mikroliter.Tillsätt sedan denna reaktion på det ekvilibrerade glutionhartset och låt det rotera i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Efter rotationen snurrar du kolumnerna för att samla genom flödet och tar sedan ett 10-mikroliterprov för genomflödesröret. Tvätta hartset två gånger med 400 mikroliter extraktionsbuffert och kassera genomflödet efter varje tvätt.Efter den tredje tvätten, håll genomströmningen och ta ett 50 mikroliterprov för tvättröret. Förbered sedan fem milliliter elutionsbuffert genom att tillsätta minskad glution till en slutlig koncentration på fem millimol i extraktionsbufferten. Tillsätt 200 mikroliter av elutionsbufferten i spinnkolonnen och inkubera i fem minuter.Centrifugera sedan kolonnen och samla genom flödet. Upprepa elutionssteget en gång till. Efter den andra elutionen, ta en 50-mikroliter alikvot från elutionsprovet och tillsätt den till eluteröret.Efter att ha kört en västerländsk fläck kan extraktionseffektiviteten bestämmas genom att jämföra mängden substrat i den elute fraktionen med ingångsfraktionen. Signalen i genomströmningen visar viss variabilitet, men liknar i allmänhet ingångsfraktionen, och det finns ingen signal i tvättfraktionen. Vanligtvis finns det en cirka 10% extraktionseffektivitet för den positiva kontrollen och en 1 till 2% extraktionseffektivitet för den negativa kontrollen.När rekonstitutionsförhållandena inte optimeras är extraktionsnivåerna jämförbara mellan de positiva och negativa proverna. Denna teknik gjorde det möjligt för vårt labb att testa biofysiska egenskaper hos substratet påverka erkännandet av Msp1.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Beredning av Nukleosomer med differentiellt isotopmärkt Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymaktivitet och genuttryck av koffein syntas från växten cellsuspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt självständigt karakterisering och datainsamling från kristaller av biologiska makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Fånga aktivt producerade mikrobiella flyktiga organiska föreningar från humant associerade prover med vakuumassisterad sorbentextraktion

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraktion och visualisering av proteinaggregat efter behandling av Escherichia coli med proteotoxisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering av aktiv caenorhabditis elegans kärnextrakt och rekonstitution för in vitro-transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...