Name: reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

MLW, chicago Üniversitesi'nde Dr. Robert Keenan ile yaptığı doktora sonrası çalışmalar sırasında bu protokolün bir parçasını geliştirdi.
Bu çalışma MLW'ye NIH hibe 1R35GM137904-01 tarafından finanse edilir.

1. Lipozom Hazırlığı
<ol><li>Dış mitokondriyal zarı taklit etmek için lipitlerin kloroform stoklarını uygun oranlarda birleştirin.<ol>
<li>25 mg lipit karışımı hazırlayın. Mitokondriyal membranları taklit eden daha önce kurulmuş bir lipit karışımı kullanıyoruz, 48:28:10:10:4 azı dişi tavuk yumurtası fosfatidyl kolin (PC), tavuk yumurtası fosfatidil etanolamin (PE), sığır karaciğer fosfatidil inositol (PI), sentetik 1,2-dioleoyl-s'den oluşur ve sentetik 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glisero...

Uygun mitokondriyal fonksiyon sağlam bir protein kalite kontrol sistemine bağlıdır. TA protein hedefleme yollarının doğruluğundaki doğal sınırlar nedeniyle, yanlış hesaplanan TA proteinleri mitokondri için sürekli bir stres kaynağıdır. Mitokondriyal proteostaz ağının önemli bir bileşeni, yanlış etiketlenmiş TA proteinlerini OMM'den uzaklaştıran bir membran bağlantılı AAA + ATPase olan Msp1'dir. Burada, proteolipozomların nasıl hazırlanacağını, Msp1 ve bir model TA proteinini nasıl ye...

Doğru hücresel fonksiyon, fonksiyonel proteinlerin doğru konsantrasyonda ve hücresel konumda olmasını sağlayan proteostaz adı verilen bir işleme bağlıdır1. Proteostazdaki başarısızlıklar organel fonksiyonlarının tehlikeye atmasına yol açar ve birçok nörodejeneratifhastalıklailişkilidir 2,3,4. Membran proteinleri, hidrofobik transmembran etki alanlarından (TMD'ler) toplanmaktan kaçınırken doğru zara hedeflenmeleri gerektiğinden proteostaz ağına benzersiz zorluklar sunar5. Sonuç olarak, özel makine hidrofobik TMD'yi sitozodan korumak ve uygun hücresel membran 6 , 7 , 8,9, 10,11,12,13,14,15'ehedeflemeyi ve yerleştirmeyi kolaylaştırmak için evrimleşmiştir.
Mitokondri hücrenin metabolik merkezidir ve oksidatif fosforilasyon, demir-kükürt kümesi üretimi ve apoptotik düzenleme16,17gibi çok sayıda temel hücresel işlemde yer almaktadır. Bu endosimbiyotik organeller, iç mitokondriyal membran (İbb) ve dış mitokondriyal membran (OMM) olarak adlandırılan iki membran içerir. 1.500 insan mitokondriyal proteininin %99'undan fazlası nükleer genomda kodlanmıştır ve bir veya iki farklı zarda yer değiştirmeleri gerekir18,19. Bu nedenle uygun mitokondriyal fonksiyon, protein hedefleme veya translokasyondaki hataları düzeltmek için sağlam bir proteostaz ağına bağlıdır.
Laboratuvarımız, çok C-terminus 20,21,22,23,24'tetek bir transmembranetki alanına sahip kuyruk bağlantılı (TA) proteinleri adı verilen mitokondriyal membran proteinlerinin bir alt kümesine odaklanmaktadır. TA proteinleri, apoptoz, vezikül taşınması ve protein translokasyonu25gibi bir dizi temel işlemde yer almaktadır. TA proteinlerinin benzersiz topolojisi, endoplazmik retikulumda (ER) Kuyruk bağlantılı (GET) veya Endoplazmik retikül Membran protein Kompleksi (EMC) yollarının Rehberli Girişi ile veya kötü karakterize edilmiş bir yol olan 20 , 26 ,27,28ile OMM'ye giren çeviri sonrası ekleme gerektirir. TMD'nin biyofiziksel özellikleri, TA proteinlerini doğru zara yönlendirmek için gerekli ve yeterlidir29. Tanımlanmış bir dizi motifi yerine biyofiziksel özelliklerin tanınması, hedefleme yollarının doğruluğunu sınırlar5. Bu nedenle, TA proteinlerinin yanlış hesaplanması proteostaz ağları için yaygın bir strestir. GET yolunun inhibisyonu gibi hücresel stres, bu proteinler derhal çıkarılmadığı sürece OMM'ye protein yanlış sapkalizasyonunda ve mitokondriyal disfonksiyonda artışa neden olur30,31.
Membran proteostazında ortak bir tema, lipid bilayer 1 , 32, 33 , 34 , 35 ,36,37,38'den eski, hasarlı veya yanlış tanımlanmış proteinleri çıkarmak için AAA+ (hücresel A eğilimleri ile ssociated bir TPase A)proteinlerinin kullanılmasıdır. . AAA+ proteinleri, altıgen halkalar oluşturan ve genellikle dar bir eksenel gözenek yoluyla translokasyon yoluyla bir substratı yeniden şekillendirmek için ATP bağımlı hareketlerinden geçen moleküler motorlardır39,40. AAA+ ATPases tarafından membran proteinlerinin ekstraksiyonunu incelemeye büyük çaba sarf edilmiş olsa da, rekonstrüzyonlar karmaşıktır veya lipid bilayerden substrat ekstraksiyon mekanizmasını incelemek için deneysel gücü sınırlayan lipit ve deterjan41,42karışımını içerir.
Msp1, OMM'ye bağlı yüksek oranda korunmuş bir AAA+ ATPaz ve yanlış tanımlanmış TA proteinleri43 , 44 , 45,46,47'yiçıkararak membran proteostazında kritik rol oynayan peroksiomlardır. Msp1'in ayrıca yakın zamanda OMM48'detranslokasyon sırasında duran membran proteinlerini çıkararak mitokondriyal protein ithalat stresini hafifletdiği gösterilmiştir. Msp1 veya insan homolog ATAD1 kaybı mitokondriyal parçalanma, oksidatif fosforilasyonda başarısızlıklar, nöbetler, inme sonrasında yaralanma artışı ve erken ölüm31,49,50 , 51,52,53,54,55,56ile sonuçlanır.
TA proteinlerini Msp1 ile birlikte yeniden inşa etmenin ve lipid bilayer57'denekstraksiyonu tespit etmenin mümkün olduğunu gösterdik. Bu basitleştirilmiş sistem, OMM'yi taklit eden tanımlanmış lipozomlara yeniden inşa edilmiş tamamen saflaştırılmış proteinler kullanır (Şekil 1)58,59. Bu deneysel kontrol seviyesi, diğer AAA+ proteinlerini içeren daha karmaşık rekonstrüzyonlarla deneysel olarak zor olan substrat ekstraksiyonunun ayrıntılı mekanistik sorularını ele alabilir. Burada, lipozom hazırlama, membran proteini rekonsupsiyonu ve ekstraksiyon tahlil yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklayan deneysel protokoller sunuyoruz. Bu deneysel detayların membran proteostazının temel ama iyi anlaşılmayan sürecinin daha fazla incelenmesini kolaylaştıracağını umuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biobeads</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver phosphatidyl inositol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840042C</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl choline</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051C</td>
			<td>PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken egg phosphatidyl ethanolamine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840021C</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Select western blotting detection reagent</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60910L-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione spin column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PI16103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC1050917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88518</td>
			<td>45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-FLAG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035C</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic 1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>710335C</td>
			<td>TOCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL, gas-tight</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of msp1 extraction activity with fully purified components

Oksidatif fosforilasyon ve apoptotik regülasyon merkezi olarak mitokondri insan sağlığında hayati bir rol oynar. Uygun mitokondriyal fonksiyon, protein homeostazının (proteostaz) korunması için sağlam bir kalite kontrol sistemine bağlıdır. Mitokondriyal proteostazdaki düşüşler kanser, yaşlanma, nörodejenerasyon ve diğer birçok hastalıkla bağlantılıdır. Msp1, yanlış hesaplanmış kuyruk bağlantılı proteinleri çıkararak proteostaz koruyan dış mitokondriyal membrana tutturulmuş bir AAA+ ATPazdır. Proteolipozomlara yeniden inşa edilen saflaştırılmış bileşenleri kullanarak, Msp1'in bir lipid bilayerden model kuyruk bağlantılı bir protein çıkarmak için gerekli ve yeterli olduğunu gösterdik. Basitleştirilmiş yeniden inşa edilmiş sistemimiz, membran protein ekstraksiyonunun ayrıntılı çalışmasını engelleyen teknik engellerin birkaçını aşıyor. Burada lipozomların üretimi, membran proteini rekonsupsiyonu ve MSP1 ekstraksiyon tahlilleri için detaylı yöntemler sunuyoruz.

Sonuçları düzgün bir şekilde yorumlamak için lekesiz jel ve batı lekesi birlikte görülmelidir. Lekesiz jel, tüm numunelerde eşit yükleme sağlar. Lekesiz jeli görüntülerken, refakatçiler (GST-calmodulin ve GST-SGTA) INPUT (I) ve ELUTE (E) şeritlerinde görülebilir. Bu bantların yoğunluğunun tüm INPUT örneklerinde tekdüze olup olmadığını iki kez kontrol edin. Aynı şekilde, yoğunluğun ELUTE numuneleri boyunca düzgün olduğundan emin olun. ELUTE, Gİrİş'ten 5 kat daha konsantredir ve bu y...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components at JoVE.com

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

AAA-ATPases'in proteinleri lipid bilayerden çıkarmak için kullanılması protein kalite kontrolünde yaygın bir temadır. Bu temel sürecin mekanistik bir anlayışı, yeniden inşa edilmiş bir sistem gerektirir. AAA-ATPases ile önceki rekonstruş karmaşık ve heterojendi.Sistemimiz basit ve tam olarak tanımlanmıştır. Bu, AAA-ATPase Msp1, substrat ve lipid ortamını manipüle etmemizi sağlar. Başlamak için, daha önce hazırlanmış yeniden yapılanma tamponu, saflaştırılmış Msp1 ve TA proteinlerini ve lipozomlarını bir PCR tüpüne ekleyin, ardından karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın.Kuluçka sırasında, bir P200 pipet ucunun ucunu bir inçin yaklaşık 1/8 çapındaki kısmına kesin. Daha sonra, düzgün bir karışım elde etmek için BioBeads içeren tüpü iyice girdaplayın. Ardından, kapağı hızlı bir şekilde çıkarın ve boncukların uygun bir hacmini boş bir PCR tüpüne aktarmak için kesilmiş P200 pipet ucunu kullanın.Yeniden yapılanma için 10 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, kesilmemiş bir pipet ucu kullanarak, biobeads'tan tüm sıvıyı çıkarın. Daha sonra, 100 mikrolitre rekonsiyel biobeads ile tüpe aktarın ve 16 saat boyunca bir tekerlek üzerinde dönmesine izin verin. Ertesi gün, boncukları peletmek için tüpü bir PicoFuge'da döndürün, ardından yeniden inşa edilen malzemeyi temiz bir PCR tüpüne aktarın ve tüpü buzda tutun.Lipozomlara yeniden inşa edemeyen proteinleri çıkarmak için, glutatyon spin sütunlarını ekstraksiyon tamponu ile dengeleyin, bu da tipik olarak 400 mikrolitre tamponla üç tur yıkamayı ve ardından tamponu çıkarmak için santrifüjlenmeyi içerir. Daha sonra, yeniden inşa edilen malzemeye her bir refakatçiden beş mikromol ekleyin, ardından 100 mikrolitre ekstraksiyon tamponu, hacmi 200 mikrolitreye kadar getirin. Bu karışımı dengelenmiş glutatyon spin sütunlarına ekleyin, ardından spin sütunlarını takın ve 30 dakika döndürerek refakatçilerin reçineye bağlanmasını bekleyin.Döndükten sonra sütunları kısa bir süre döndürün. Agrega proteinlerinin önceden temizlenmiş malzemesi olan akış toplayın. Buzun üzerine yerleştirin ve doğrudan çıkarma testine geçin.Tüpleri SDS-PAGE analizi için hazırlayın. Giriş tüpüne 45 mikrolitre çift damıtılmış su, akış tüpüne 40 mikrolitre su ve her tüpe 16,6 mikrolitre 4X SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin. Ekstraksiyon tahlil için ekstraksiyon reaksiyonu hazırlayın ve ekstraksiyon tamponu ile son hacmi 200 mikrolitreye getirin.Daha sonra, ekstraksiyon tahlilini 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda iki dakika boyunca ön ısıtma yapın. Tahlil başlatmak için, atp'yi iki milimol son konsantrasyona ekleyin. Tüpü bir PicoFuge'da beş saniye döndürün ve 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçka sırasında, reaksiyonun beş mikroliter örneğini alın ve giriş tüpüne ekleyin. Ayrıca, ekstraksiyon testinde her örnek için daha önce gösterildiği gibi bir glutatyon spin sütunu aşındırın. 30 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, tüpe 200 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve toplam hacmi 400 mikrolitreye getirin.Daha sonra, bu reaksiyonun dengelenmiş glutatyon reçinesine ekleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika dönmesine izin verin. Döndükten sonra, akış akışını toplamak için sütunları döndürün, ardından akış tüpü için 10 mikroliterlik bir örnek alın. Reçineyi 400 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra akıştan atın.Üçüncü yıkamadan sonra, akışı tutun ve yıkama tüpü için 50 mikroliter numune alın. Daha sonra, ekstraksiyon tamponunda beş milimollük son konsantrasyona azaltılmış glutatyon ekleyerek beş mililitrelik elüasyon tamponu hazırlayın. Spin sütununa 200 mikrolitre elution tamponu ekleyin ve beş dakika kuluçkaya yatırın.Ardından, sütunu santrifüj edin ve akışı toplayın. İfade adımını bir kez daha tekrarlayın. İkinci elutiondan sonra, elution örneğinden 50 mikroliter aliquot alın ve elute tüpüne ekleyin.Batı lekesi çalıştırılmasından sonra, ekstraksiyon verimliliği, elute fraksiyonundaki substrat miktarı ile giriş fraksiyonu karşılaştırılarak belirlenebilir. Akıştaki sinyal bazı değişkenlik gösterir, ancak genellikle giriş fraksiyonu ile benzer ve yıkama fraksiyonunda sinyal yoktur. Tipik olarak, pozitif kontrol için yaklaşık% 10 ekstraksiyon verimliliği ve negatif kontrol için% 1 ila% 2 ekstraksiyon verimliliği vardır.Yeniden yapılanma koşulları optimize edilmemişse, ekstraksiyon seviyeleri pozitif ve negatif numuneler arasında karşılaştırılabilir. Bu teknik, laboratuvarımızın alt tabakanın biyofiziksel özelliklerinin Msp1 tarafından tanınmasını etkilemesini test etmesine izin sağladı.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Vakum Yardımlı Sorbent Ekstraksiyonu ile İnsanla İlişkili Numunelerden Aktif Olarak Üretilen Mikrobiyal Uçucu Organik Bileşiklerin Yakalanması

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Proteotoksik Stresör ile Escherichia coli Tedavisinden Sonra Protein Agregalarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...