Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

تم توفير التمويل من قبل أكاديمية بنسلفانيا للعلوم، وكومنولث علماء الأحياء في بنسلفانيا، وجامعة إنديانا في بنسلفانيا (كلية الدراسات العليا والبحوث، وقسم البيولوجيا، وصندوق سينثيا سوشاك للبيولوجيا الجامعية للتميز). تم توفير خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا من قبل الدكتور نيل هوكريدي (جامعة بيتسبرغ).

تمت الموافقة على استخدام يرقات ويرقات حمار وحشي من قبل IUP IACUC (البروتوكول رقم 02-1920، #08-1920). يتم سرد تفاصيل محتوى الحل في جدول المواد.
1. تربية اليرقات
ملاحظة: يستغرق رفع اليرقات والأحداث إلى مرحلة الاهتمام ما يصل إلى 21 يوما أو أكثر.
<ol><li>إعداد حمار وحشي ا?...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

تهدف طريقة التهجين في الموقع الموصوفة هنا إلى دراسة تطوير الميكونيفروس. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه لدراسة تطور الأنسجة والأعضاء الأخرى أثناء التحول ، مثل الأمعاء والجهاز العصبي والمقاييس والتصبغ14. يمكن إنشاء مسابير للجينات الذاتية أو علامات الفلورسنت في خطوط معدلة وراثيا.</p...

جنين حمار وحشي هو نموذج مهم لدراسة تطور الأنسجة بسبب صغر حجمه وشفافيته وأدواته المتاحة وبقائه دون تغذية لمدة تصل إلى خمسة أيام1,2. وقد ساهم بشكل كبير في فهم نمو الكلى والحفاظ على بين حمار وحشي والثدييات3،4،5. تلعب الكلية دورا أساسيا في الحفاظ على التوازن السائل ، وتصفية الدم ، وإفراز النفايات6. وتتألف الكلية، وهي الوحدة الوظيفية للكلى، من فلتر دم متصل بأنابيب طويلة. في حمار وحشي، اثنين من هياكل الكلى تشكل طوال حياتها. تتشكل الفروس (الكلية الجنينية المؤقتة) أولا أثناء النمو المبكر. وهو يتألف من اثنين من الكلية التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي ويصبح وظيفيا في حوالي 2 أيام بعد الإخصاب (dpf). تكمن فائدة الفروس في بساطته ، حيث يبدأ اثنان فقط من الكليرونات التي هي في الغالب خطية وسهلة التصور (على الرغم من أن أنبوب الأنبوب الملتوي القريب يبدأ في اللف عند ثلاثة dpf)3. وقد سهل هذا ليس فقط دراسات تطورها المبكر من mesoderm المتوسطة، ولكن أيضا نمط التقسيم وإصلاح أنبوبي7،8.
تصبح فائدة سمك الحمار الوحشي محدودة بعد خمسة dpf ، عندما يتضاءل الصفار وتعتمد اليرقات على التغذية في النظام المائي9. في حوالي 2 أسابيع من العمر ، تخضع اليرقات للتحول إلى أحداث ، حيث تتشكل أنسجة جديدة وتضيع الأنسجة القديمة و / أو إعادة تنظيم9. هذا هو أيضا عندما mesonephros (الكلى الكبار الدائم) تشكل10،11،12. يتشكل أول نييفرون بالغ بالقرب من السوسميت السادس ، ويندمج مع أنبوب الأنابيب المبكر البعيدة من النضال. تتم إضافة نييفرونات إضافية إلى هذا الموقف في البداية ، ولكن أيضا نحو الأمامي في وقت لاحق. تندمج الكليرونات الأولية في هذه الموجة الأولى في أنابيب التينفروس وتشترك في تجويف مشترك لإيداع نفاياتها. تتشكل الكلية الثانوية في الموجة التالية ويندمج في الكليرونات الأولية. هذه العملية تكرار يخلق mesonephros التي تتفرع، إلى حد ما أقرب إلى الكلى الثدييات. يفترض، وs pronephros يفقد في نهاية المطاف هويته أنبوبي ويصبح اثنين من قنوات جمع الرئيسية حيث جميع nephrons استنزاف النفايات الخاصة بهم13.
قبل تشكيل أول نسل نيفيرون بالغ ، تبدأ خلايا السلف المفردة في الظهور في يرقات ~4 مم (الطول الإجمالي) (~ 10 ديسيبل في البرونيل). هذه الخلايا، التي تم وضع علامة في خط TG (lhx1a-EGFP) المعدلة وراثيا، تلتزم المعرضة ويبدو أن الهجرة إلى مواقع مستقبلية من تولد الكلية. تتجمع الخلايا المفردة في مجموعات، والتي تفرق إلى nephrons12 جديدة. ومن غير الواضح أين تتواجد هذه الخلايا أو ما هي الجينات التي تعبر عنها قبل بداية تكوين الميسونيفروجين.
فهم تطور mesonephros يوفر رؤى في الكلى الثدييات بطرق لا يمكن أن المعرضة. وتشمل هذه تشكيل المجاميع الكلية من خلايا السلف واحد، والتكامل الوظيفي للنيفرونات الجديدة مع تلك الموجودة، والمورفوجين المتفرعة. ومع ذلك ، هناك قيود على دراسة التنمية بعد الطمث. اليرقات أقل شفافية بسبب حجمها الأكبر وجود تصبغ. والجدول الزمني للنمو غير متزامن بين فرادى الحيوانات ويعتمد اعتمادا كبيرا على العوامل البيئية، مثل التغذية والزحام 9،14. على الرغم من وجود الكواشف القاضية ، إلا أنها أقل فعالية في اليرقات مقارنة بالأجنة15. في هذا البروتوكول، يتم وصف طريقة التهجين في الموقع لتحديد التعبير الجيني أثناء تطوير سمك الحمار الوحشي mesonephros. يتم تحسين عدة خطوات لزيادة التصور من mesonephros والاختراق وغسل المسبار والأجسام المضادة. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا جنبا إلى جنب مع مسبار ل EGFP لتسمية خلايا السلف المفردة ، والمجاميع الكلية ، وأنابيب الكلية البعيدة من الكلية الوليدة. ستوفر هذه الطريقة فهما أعمق لتطوير mesonephros ونظرة ثاقبة في العلاجات التجديدية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

تشكل سمكة الحمار الوحشي هيكلين للكلى في حياتها. تتشكل الفروس (الكلى الجنينية) أثناء النمو الجنيني وتبدأ في العمل بعد يومين من الإخصاب. تتكون من اثنين فقط من الكليفرونات ، يعمل الفروس ككلية وحيدة خلال حياة اليرقات حتى يلزم المزيد من وظائف الكلى بسبب زيادة كتلة الجسم. للتعامل مع هذا الطلب المرتفع ، يبدأ الموسونيفروس (الكلى البالغة) في التشكل أثناء التحول. الكلية الأولية الجديدة تنصهر إلى المعرضة وتشكل التجويفات المتصلة. ثم، تنصهر الكلية الثانوية إلى تلك الأولية (وهلم جرا) لإنشاء شبكة متفرعة في mesonephros. وتركز الغالبية العظمى من البحوث على المعرضة بسبب سهولة استخدام الأجنة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة اليرقات القديمة والأكبر والأسماك الأحداث لفهم أفضل لتطور الميكسونيفروس. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع لتحليل التعبير الجيني لاختراق المسبار ، وغسل المسابير والأجسام المضادة ، وتبييض الأصباغ لتصور أفضل للمسونيفروس. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا لتسمية خلايا السلف والأنابيب البعيدة من الكليرونات الوليدة. هذا البروتوكول يسد فجوة في أبحاث الميكسونفروس. وهو نموذج حاسم لفهم كيفية تشكل أنسجة الكلى الجديدة والاندماج مع الكلية الموجودة وتوفير رؤى في العلاجات التجديدية.

باستخدام خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا ، ثبت أن هذا البروتوكول التهجين في الموقع فعال في وضع العلامات على خلايا السلف الكلوي وهياكل الكلية المختلفة أثناء تطوير الميكسونفروس. كما هو متوقع، يتم تسمية الجهاز العصبي المركزي أيضا في هذا الخط المعدلة وراثيا (لا يظهر). أشكال الكلية mesonephric ا...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

الحمار الوحشي هو نموذج مهم لفهم نمو الكلى. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في يرقات حمار وحشي والأحداث أثناء تطور الميكسونفروس.

في سيتو التهجين في يرقات حمار وحشي والأحداث خلال تطوير Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بتحديد التعبير الجيني في يرقات سمك الحمار الوحشي القديمة والأحداث أثناء التحول. ميزة هذه التقنية هي أن العديد من الخطوات قد تم تحسينها لاختراق المسبار وتصور الكلى. للبدء، قم بإعداد سمك الحمار الوحشي البالغ للتزاوج عن طريق إضافة سمكة ذكر وسمكة واحدة في خزان تزاوج في وقت متأخر من بعد الظهر بعد وجبتهم الأخيرة.في اليوم التالي، جمع الأجنة في لوحات بيتري التي تحتوي على E3 المتوسطة. خمسة أيام بعد الإخصاب، ضع شاشة 400 ميكرومتر في خزان سعة 2.8 لتر وملئه بسنتيمترين من مياه النظام. ثم أضف اليرقة من طبق بيتري واحد.لإصلاح اليرقة ، قم بإزالة خزان يرقة في النقطة الزمنية المطلوبة ، ثم ، باستخدام شبكة ونقل ماصة مع قطع طرفها ، قم بنقل اليرقة إلى لوحة بيتري. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من 2٪ tricaine لشل حركة اليرقة. بعد الجمود، استبدل tricaine ب 20 ملليلتر من حل الإصلاح.بعد 30 دقيقة ، قم بنقل اليرقة إلى أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 25 ملليلتر من محلول التثبيت الطازج. ثم، وضمان أن الغطاء ضيق، صخرة ببطء الأنبوب في أربع درجات مئوية لمدة يومين. في اليوم الثالث ، استبدل محلول التثبيت ب 20 ملليلتر من PBST ثم نقل اليرقة إلى لوحة بيتري.لقياس اليرقة ، ضع لوحة بيتري فوق مسطرة مسطحة تحت مجهر تشريح ، ثم ، باستخدام مناور رمش ، قم بتحريك كل يرقة إلى المسطرة لقياس طولها الإجمالي. بعد قياس جميع اليرقات ، اجمع عدة يرقات ذات أطوال مماثلة على قارورة زجاجية واحدة سعة 5.5 ملليلتر مع PBST. للجفاف، استبدل الPBST في القارورة الزجاجية بأربعة ملليلترات من الميثانول بنسبة 100٪، ثم قم بتخزين القارورة عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة يومين.للإماهة، استبدل الميثانول بنسبة 100٪ بأربعة ملليلترات من الميثانول بنسبة 75٪ وحل PBST بنسبة 25٪، وهز القارورة لمدة خمس دقائق. ثم، استبدال الميثانول وPBST الحل مع أربعة ملليلتر من PBST الطازجة والصخور القارورة مرة أخرى لمدة 10 دقائق. بالنسبة لهضم Proteinase K ، استبدل PBST بمليلترين من محلول Proteinase K وهز القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك ، للتبييض ، قم بنقل اليرقة إلى لوحة من ستة آبار واستبدال PBST بثلاثة ملليلترات من محلول التبييض الطازج. بعد الاختفاء الكامل للتصبغ على طول mesonephros ، قم بنقل اليرقة مرة أخرى إلى قارورة زجاجية ، واستبدل محلول التبييض بأربعة ملليلترات من PBST ، وهز القارورة لمدة 10 دقائق. قبل التهجين، استبدل حل التثبيت بأربعة ملليلترات من PBST وهز القارورة لمدة 10 دقائق، ثم استبدل PBST بأربعة ملليلترات من محلول Hyb والصخور لمدة 10 دقائق.بعد احتضانين إضافيين في محلول Hyb، استبدل الحل بأربعة ملليلترات من محلول Hyb+. في وقت واحد تمييع مسبار الفلورسين EGFP 1-100 في 500 ميكرولتر من التهجين بالإضافة إلى الحل ، واحتضان القارورة والتحقيق في 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، لتهجين المسبار، استبدل محلول Hyb+في القارورة بالمسبار المحمى مسبقا واحتضنه عند 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، أضف 50 ملليلتر من SSCT مسخن 0.2 مرة في أنبوب 50 ملليلتر. ثم أدخل مصفاة خلايا سعة 100 ميكرومتر في الجزء العلوي من الأنبوب ، ونقل اليرقة من القارورة الزجاجية إلى مصفاة الخلية ، وضمان غمر اليرقة في العازلة ، واحتضان القارورة عند 70 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الحضانة، نقل مصفاة الخلية إلى أنبوب جديد يحتوي على سخن 0.2 مرات SSCT، واحتضان مرة أخرى في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين.بعد ذلك ، لمنع ، نقل اليرقة إلى قارورة زجاجية جديدة والسماح لها بالتبريد لدرجة حرارة الغرفة. ثم استبدل حل SSCT 0.2 مرة بأربعة ملليلترات من محلول SSCT 67٪0.2 مرة وحل MABT بنسبة 33٪ وهز القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، استبدل حل SSCTT MABT بأربعة ملليلترات من MABT الطازجة ، واحتضان القارورة على الروك لمدة 10 دقائق.ثم، استبدال MABT مع أربعة ملليلتر من حل حجب واحتضان أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استبدل محلول الحجب بمحلول للأجسام المضادة واحتضنه عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة يومين. لغسل الأجسام المضادة ، قم بنقل اليرقة إلى أنبوب 50 ملليلتر ، ثم أضف 40 ملليلتر من PBST2 ، ووضع الأنبوب على جانبه للحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية.في اليوم 12، بعد نقل الحمم البركانية إلى لوحة من ست آبار، استبدل PBST2 بثلاثة ملليلترات من العازلة تلطيخ. بعد حضانة لمدة خمس دقائق على الروك، واستبدال العازلة تلطيخ مع ثلاثة ملليلتر من محلول تلطيخ. عندما يتم الوصول إلى كثافة التلطيخ المطلوبة ، استبدل محلول التلطيخ بثلاثة ملليلترات من محلول التوقف والصخور لمدة 30 دقيقة.ثم، نقل اليرقة إلى قارورة زجاجية جديدة، واستبدال محلول وقف مع أربعة ملليلتر من محلول تحديد الطازجة، واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. للتصوير، استبدل حل التثبيت بأربعة ملليلترات من برنامج تلفزيوني جديد. بعد احتضان لمدة 10 دقائق على الروك ، نقل اليرقة إلى لوحة من ستة آبار ، ثم استبدال PBST بأربعة ملليلترات من PBST الطازجة والصخور لوحة مرة أخرى لمدة 10 دقائق.بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلترات من 50٪ من الجليسيرول في PBST والصخور لمدة 10 دقائق ، ثم ، باستخدام مجهر تشريح ، قم بتصوير اليرقة مباشرة في لوحة من ستة آبار. هذا في بروتوكول التهجين الموقعي التسميات على نحو فعال خلايا السلف الكلى ومختلف هياكل الكلية باستخدام تطوير mesonephros. تتشكل الكلية النسونيفية الأولية عند ظهرية 5.2 ملليمتر تقريبا إلى الفروس.مجموعات من الخلايا السلف موجودة أثناء تطوير mesonephros بالإضافة إلى خلايا السلف واحد. في الأحداث الأكبر ، يمكن أن يحدث تلطيخ الخلفية في السخام. وعموما، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الأنسجة الأخرى التي تتشكل أثناء التحول، بالإضافة إلى تشريح أعضاء البالغين.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...