Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

Finansiering blev ydet af Pennsylvania Academy of Science, og Commonwealth of Pennsylvania biologer, og Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, og Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgene Tg(lhx1a-EGFP) linje blev leveret af Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).

Brugen af zebrafisk larver og unger er godkendt af IUP IACUC (protokol # 02-1920, # 08-1920). Oplysninger om løsningsindholdet er angivet i materialetabellen.
1. Opdræt af larver
BEMÆRK: Det vil tage op til 21 dage eller mere at hæve larver og unger til det stadium af interesse.
<ol><li>Opsæt voksne zebrafisk til at parre ved at tilføje 1 mandlige og 1 kvindelige fisk i en parringstank i den sene eftermiddag efter deres sidste måltid. BE...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

Den in situ hybridisering metode beskrevet her har til formål at studere mesonephros udvikling. Men, Det kan anvendes til at studere udviklingen af andre væv og organer under metamorfose, såsom tarmen, nervesystemet, skalaer, og pigmentering14. Sonder kan genereres for endogene gener eller fluorescerende markører i transgene linjer.
Det er afgørende for larverne at forblive intakte for at observere organer og væv i deres oprindelige sammenhæng. For at be...

Zebrafiskembryo er en vigtig model til undersøgelse af vævsudvikling på grund af dets lille størrelse, gennemsigtighed, tilgængelige værktøjer og overlevelse uden fodring i op til fem dage1,2. Det har i høj grad bidraget til forståelsen af nyreudvikling og bevarelsen mellem zebrafisk og pattedyr3,4,5. Nyrerne spiller en væsentlig rolle i at opretholde flydende homøostase, filtrering af blodet, og udskille affald6. Nephron, den funktionelle enhed i nyrerne, består af et blodfilter forbundet med en lang tubule. I zebrafisk dannes to nyrestrukturer gennem hele sit liv. Pronephros (den midlertidige embryonale nyre) dannes først under den tidlige udvikling. Den består af to nephrons kører langs den forreste-posterior akse og bliver funktionel på omkring 2 dage efter befrugtning (dpf). Nytten af pronephros ligger i sin enkelhed, der kun har to nephrons, der er for det meste lineære og let at visualisere (selv om den proksimale indviklede tubule begynder at spole på tre dpf)3. Dette har lettet ikke kun undersøgelser af dens tidlige udvikling fra den mellemliggende mesoderm, men også segmenteringsmønsteret og tubule repair7,8.
Zebrafiskens nytte bliver begrænset efter fem dpf, når æggeblommen er formindsket, og larverne er afhængige af fodring i vandsystemet9. På omkring 2 uger gammel gennemgår larverne metamorfose til unger, hvor nye væv dannes og gammelt væv går tabt og / eller reorganiseret9. Dette er også, når mesonephros (den permanente voksne nyre) danner10,11,12. Den første voksne nephron danner nær den sjette somit, og smelter sammen med den distale tidlige tubule af pronephros. Yderligere nephrons tilføjes posterior til denne position i første omgang, men også mod den forreste senere. De primære jomfruer i denne første bølge smelter sammen med de tilbøjeligephros' tubules og deler en fælles lumen for at deponere deres affald. Sekundære jomfruer dannes i den næste bølge og smelter til primære jomfruer. Denne reiterative proces skaber en mesonephros, der er forgrenet, noget beslægtet med pattedyr nyre. Formentlig mister pronephros til sidst sin tubule identitet og bliver to store indsamling kanaler, hvor alle nephrons dræne deres affald13.
Før dannelsen af den første voksne nephron begynder enkelte stamceller at dukke op i ~ 4 mm (samlet længde) larver (~ 10 dpf). Disse celler, som er markeret i Tg(lhx1a-EGFP) transgene linje, klæber til pronephros og synes at migrere til fremtidige steder for nefrosese. De enkelte celler samles i klynger, som differentierer sig til nye jomfruer12. Det er uklart, hvor disse celler bor, eller hvilke gener de udtrykker før starten af mesonephrogenese.
Forståelse mesonephros udvikling giver indsigt i pattedyr nyre på måder, at pronephros ikke kan. Disse omfatter dannelsen af nefrogene aggregater fra enkelte stamfaderceller, funktionel integration af nye jomfruer med eksisterende og forgrening af morfogenese. Der er dog begrænsninger for at studere postembryonisk udvikling. Larverne er mindre gennemsigtige på grund af deres større størrelse og har pigmentering. Den udviklingsmæssige tidslinje er ikke synkron blandt de enkelte dyr og er meget afhængig af miljømæssige faktorer, såsom fodring og fortrængning9,14. Selvom knockdown reagenser eksisterer, er de mindre effektive i larver sammenlignet med embryoner15. I denne protokol beskrives en in situ hybridiseringsmetode til bestemmelse af genekspression under zebrafisk mesonephros udvikling. Flere trin er optimeret til at øge visualisering af mesonephros og penetration og vask af sonden og antistof. Den transgene Tg(lhx1a-EGFP) linje bruges sammen med en sonde til EGFP til at mærke enkelte stamfaderceller, nefrogene aggregater og de distale tubules af spirende jomfruer. Denne metode vil give en dybere forståelse af mesonephros udvikling og indsigt i regenerative behandlinger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

Zebrafisken danner to nyrestrukturer i sin levetid. Pronephros (embryonale nyre) dannes under embryonal udvikling og begynder at fungere ved 2 dage efter befrugtning. Bestående af kun to jomfruer, pronephros tjener som den eneste nyre i larve liv, indtil mere nyrefunktion er påkrævet på grund af den stigende kropsmasse. For at klare denne højere efterspørgsel begynder mesonephros (voksen nyre) at danne sig under metamorfose. De nye primære tåger smelter sammen med de udsattephros og danner forbundne lumen. Derefter smelter sekundære jomfruer til primære (og så videre) for at skabe et forgreningsnetværk i mesonephros. Langt størstedelen af forskningen er fokuseret på pronephros på grund af den lethed at bruge embryoner. Der er således behov for at udvikle teknikker til at studere ældre og større larver og ungfisk for bedre at forstå mesonephros udvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokol til genekspressionsanalyse optimeret til sondeindtrængning, vask af sonder og antistoffer og blegning af pigmenter for bedre at visualisere mesonephros. Den transgene Tg(lhx1a-EGFP) linje bruges til at mærke stamfaderceller og de distale tubules af spirende jomfruhroner. Denne protokol udfylder et hul i mesonephros forskning. Det er en afgørende model for at forstå, hvordan nye nyrevæv dannes og integreres med eksisterende jomfruer og giver indsigt i regenerative behandlinger.

Ved hjælp af Tg(lhx1a-EGFP) transgene linje, blev det påvist, at denne in situ hybridisering protokol er effektiv til mærkning nyre stamfader celler og forskellige nephron strukturer under mesonephros udvikling. Som forventet er centralnervesystemet også mærket i denne transgene linje (ikke vist). Den oprindelige mesonephric nephron danner på ca 5,2 mm, dorsal til pronephros (Figur 2A), og den distale tubule af denne nephron er mærket af EGFP10,12</...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Zebrafisken er en vigtig model for forståelse af nyreudvikling. Her er en in situ hybridisering protokol optimeret til at opdage genekspression i zebrafisk larver og unge under mesonephros udvikling.

In Situ Hybridisering i zebrafisk larver og unge under Mesonephros Udvikling

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Denne protokol er vigtig, fordi den gør det muligt at bestemmes genekspression i ældre zebrafisk larver og unge under metamorfose. Fordelen ved denne teknik er, at flere trin er blevet optimeret til sonde penetration og visualisering af nyrerne. Til at begynde med skal du oprette voksne zebrafisk til at parre ved at tilføje en han- og en hunfisk i en parringstank sidst på eftermiddagen efter deres sidste måltid.Den næste dag skal embryonerne samles i petriplader, der indeholder E3-medium. Fem dage efter befrugtning skal du placere en 400-mikrometer skærm i en 2,8-liters tank og fylde den med 2 centimeter systemvand. Tilsæt derefter larven fra en petriplade.For at fastgøre larven skal du fjerne en tank larve på det ønskede tidspunkt, så overfør larven til Petripladen ved hjælp af et net og overfør pipette med spidsen afskåret. Derefter tilsættes to milliliter på 2% tricain for at immobilisere larven. Efter immobilisering udskiftes tricainen med 20 milliliter fastgørelsesopløsning.Efter 30 minutter overføres larven til et 50-milliliterrør, der indeholder 25 milliliter frisk fastgørelsesopløsning. Derefter, at sikre, at hætten er stram, langsomt rock røret på fire grader Celsius i to dage. På dag tre skal du udskifte fastgørelsesopløsningen med 20 milliliter PBST og derefter overføre larven til en petriplade.For at måle larven skal du placere petripladen oven på en flad lineal under et dissekeringmikroskop, og flyt derefter hver larve på linealen ved hjælp af en øjenvippermanipulator for at måle dens samlede længde. Efter at have målt al larve, kombinere flere larve af lignende længder på en 5,5-milliliter glas hætteglas med PBST. For dehydrering skal du udskifte PBST i glasglasset med fire milliliter 100% methanol og derefter opbevare hætteglasset ved minus 20 grader Celsius i to dage.For rehydrering, erstatte 100% methanol med fire milliliter af en 75% methanol og 25% PBST løsning og rock hætteglasset i fem minutter. Derefter udskiftes methanol- og PBST-opløsningen med fire milliliter frisk PBST og rock hætteglasset igen i 10 minutter. For Proteinase K fordøjelse, erstatte PBST med to milliliter af en Proteinase K opløsning og rock hætteglasset ved stuetemperatur i 30 minutter.Dernæst overføres larven til en seks-brønds plade til blegning og erstatte PBST med tre milliliter frisk blegning. Efter den fuldstændige forsvinden af pigmentering langs mesonephros, overføre larven tilbage i et glas hætteglas, erstatte blegning opløsning med fire milliliter af PBST, og rock hætteglasset i 10 minutter. For pre-hybridisering skal du udskifte fastgørelsesopløsningen med fire milliliter PBST og klippe hætteglasset i 10 minutter, og udskift derefter PBST med fire milliliter Hyb-opløsning og sten i 10 minutter.Efter yderligere to inkubationer i Hyb-opløsningen udskiftes opløsningen med fire milliliter af Hyb+-opløsningen. Fortynd samtidig EGFP fluorescein sonde en til 100 i 500 mikroliter af hybridisering plus opløsning, og inkubere hætteglasset og sonden ved 70 grader Celsius natten over. Den næste dag, for at hybridisere sonden, erstatte Hyb + opløsningen i hætteglasset med den forvarmede sonde og inkubere ved 70 grader Celsius natten over.Den følgende dag tilsættes 50 milliliter forvarmet 0,2 gange SSCT i et 50-milliliterrør. Indsæt derefter en 100-mikrometer cellesn si i toppen af røret, overfør larven fra glasglasset ind i cellesien og sikrer, at larven nedsænkes i bufferen, inkuberer hætteglasset ved 70 grader Celsius i to timer. Efter inkubationen overføres cellesienn til et nyt rør, der indeholder forvarmet 0,2 gange SSCT, og inkuberer igen ved 70 grader Celsius i to timer.Dernæst overføres larven til et nyt glasglas til en ny glasglas og lad den køle af til stuetemperatur. Derefter udskiftes 0,2 gange SSCT-opløsningen med fire milliliter af en 67%0,2 gange SSCT og 33% MABT-opløsning og rock hætteglasset ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter udskiftes SSCTT MABT-opløsningen med fire milliliter frisk MABT, og inkuberes hætteglasset på en rocker i 10 minutter.Derefter udskiftes MABT med fire milliliter blokeringsopløsning og inkuberer fire grader Celsius natten over. Den næste dag skal blokeringsopløsningen udskiftes med en antistofopløsning og inkuberes ved fire grader Celsius i to dage. Til antistofvask overføres larven til et 50-milliliterrør, tilsæt derefter 40 milliliter PBST2 og læg røret på siden til nattens inkubation ved fire grader Celsius.På dag 12, efter at have overført lavaen til en seks-brønds plade, skal pbst2 erstattes med tre milliliter farvningsbuffer. Efter en fem minutters inkubation på en rocker skal farvningsbufferen udskiftes med tre milliliter af farvningsopløsningen. Når den ønskede farvningsintensitet er nået, skal farvningsopløsningen udskiftes med tre milliliter af stopopløsningen og sten i 30 minutter.Overfør derefter larven til et nyt glasglas, udskift stopopløsningen med fire milliliter frisk fastgørelsesopløsning og inkuberes i en time ved stuetemperatur. Til billedbehandling skal du udskifte fastgørelsesopløsningen med fire milliliter frisk PBST. Efter en 10 minutters inkubation på en rocker overføres larven til en seks-brønds plade, og udskift derefter PBST med fire milliliter frisk PBST og rock pladen igen i 10 minutter.Derefter tilsættes tre milliliter på 50% glycerol i PBST og rock i 10 minutter, og derefter, ved hjælp af et dissekeringmikroskop, billede larven direkte i seks-brøndspladen. Denne in situ hybridisering protokol effektivt etiketter nyre stamfader celler og forskellige nephron strukturer ved hjælp af mesonephros udvikling. Den oprindelige mesonephric nephron former på ca 5,2 millimeter dorsal til pronephros.Klynger af stamfaderceller er til stede under mesonephros udvikling ud over enkelt stamfader celler. I større unger kan baggrundsfarvning forekomme i somitterne. Samlet set kan denne metode bruges til at studere andre væv, der dannes under metamorfose, ud over dissekerede voksne organer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forståelse Tidlig Organogenesis efter en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridization protokol<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Optagelse Tissue Repair i zebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i zebrafisk gennem en kombineret protokol af hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og immunfluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount i Situ hybridisering til Astyanax embryoner

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genoyping og kvantificering af In Situ Hybridization Farvning i Zebrafisk

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Mount Immunhistokemi i Zebrafish Embryoner og Larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende calciumimaging og efterfølgende In Situ Hybridisering for neuronal precursor karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...