Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

Financiering werd verstrekt door de Pennsylvania Academy of Science, en het Gemenebest van Pennsylvania Biologen, en de Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, en het Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). De Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn werd geleverd door Dr. Neil Hukriede (Universiteit van Pittsburgh).

Het gebruik van zebravislarven en juvenielen is goedgekeurd door de IUP IACUC (protocol #02-1920, #08-1920). Details van de inhoud van de oplossing worden vermeld in de tabel met materialen.
1. Larven grootbrengen
OPMERKING: Het duurt tot 21 dagen of langer om larven en juvenielen op te kweken tot het stadium van interesse.
<ol><li>Stel volwassen zebravissen in om te paren door 1 mannetje en 1 vrouwtje toe te voegen in een paringstank in de late n...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

De hier beschreven in situ hybridisatiemethode is gericht op het bestuderen van de ontwikkeling van mesonephros. Het kan echter worden toegepast om de ontwikkeling van andere weefsels en organen tijdens metamorfose te bestuderen, zoals de darm, het zenuwstelsel, schubben en pigmentatie14. Probes kunnen worden gegenereerd voor endogene genen of fluorescerende markers in transgene lijnen.
Het is van cruciaal belang dat de larven intact blijven om de organen en we...

Het zebravisembryo is een belangrijk model voor het bestuderen van weefselontwikkeling vanwege zijn kleine omvang, transparantie, beschikbare hulpmiddelen en overleving zonder voeding gedurende maximaal vijf dagen1,2. Het heeft sterk bijgedragen aan het begrip van nierontwikkeling en het behoud tussen zebravissen en zoogdieren3,4,5. De nier speelt een essentiële rol bij het handhaven van vloeibare homeostase, het filteren van het bloed en het uitscheiden van afval6. Het nefron, de functionele eenheid van de nier, bestaat uit een bloedfilter dat is verbonden met een lange buis. Bij zebravissen vormen zich gedurende zijn hele leven twee nierstructuren. De pronephros (de tijdelijke embryonale nier) vormt zich het eerst tijdens de vroege ontwikkeling. Het bestaat uit twee nefronen die langs de voorste-achterste as lopen en wordt functioneel rond 2 dagen na de bevruchting (dpf). Het nut van de pronephros ligt in zijn eenvoud, met slechts twee nefronen die meestal lineair en gemakkelijk te visualiseren zijn (hoewel de proximale ingewikkelde tubulus begint te spoelen bij drie dpf)3. Dit heeft niet alleen studies van de vroege ontwikkeling van het intermediaire mesoderm vergemakkelijkt, maar ook het segmentatiepatroon en tubulusherstel7,8.
Het nut van zebravissen wordt beperkt na vijf dpf, wanneer de dooier wordt verminderd en de larven afhankelijk zijn van voeding in het aquatische systeem9. Op ongeveer 2 weken oud ondergaan de larven een metamorfose tot juvenielen, waarbij nieuwe weefsels ontstaan en oude weefsels verloren gaan en/of gereorganiseerd worden9. Dit is ook wanneer de mesonephros (de permanente volwassen nier) zich vormt10,11,12. Het eerste volwassen nefron vormt zich in de buurt van de zesde somiet en versmelt met de distale vroege tubulus van de pronephros. Extra nefronen worden in eerste instantie aan deze positie toegevoegd, maar later ook naar de voorste. De primaire nefronen in deze eerste golf fuseren met de tubuli van de pronephros en delen een gemeenschappelijk lumen om hun afval af te zetten. Secundaire nefronen vormen zich in de volgende golf en fuseren met primaire nefronen. Dit reiteratieve proces creëert een mesonephros die vertakt is, enigszins verwant aan de zoogdiernier. Vermoedelijk verliest de pronephros uiteindelijk zijn tubulusidentiteit en worden het twee grote verzamelkanalen waar alle nefronen hun afval afvoeren13.
Voorafgaand aan de vorming van het eerste volwassen nefron, beginnen enkelvoudige voorlopercellen te verschijnen in larven van ~ 4 mm (totale lengte) (~ 10 dpf). Deze cellen, die zijn gemarkeerd in de Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn, hechten zich aan de pronephros en lijken te migreren naar toekomstige plaatsen van nefroese. De afzonderlijke cellen smelten samen tot clusters, die differentiëren tot nieuwe nefronen12. Het is onduidelijk waar deze cellen zich bevinden of welke genen ze tot expressie brengen vóór het begin van mesonefogenese.
Inzicht in de ontwikkeling van mesonephros geeft inzicht in de nier van zoogdieren op manieren die de pronephros niet kunnen. Deze omvatten de vorming van nefrogene aggregaten uit cellen met één voorloper, functionele integratie van nieuwe nefronen met bestaande en vertakkende morfogenese. Er zijn echter beperkingen aan het bestuderen van postembryonische ontwikkeling. De larven zijn minder transparant vanwege hun grotere formaat en pigmentatie. De ontwikkelingstijdlijn loopt niet synchroon tussen individuele dieren en is sterk afhankelijk van omgevingsfactoren, zoals voeding en drukte9,14. Hoewel knockdown-reagentia bestaan, zijn ze minder effectief in larven in vergelijking met embryo's15. In dit protocol wordt een in situ hybridisatiemethode beschreven om genexpressie te bepalen tijdens de ontwikkeling van mesonephros van zebravissen. Verschillende stappen zijn geoptimaliseerd om de visualisatie van de mesonephros en de penetratie en het wassen van de sonde en het antilichaam te vergroten. De Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn wordt gebruikt samen met een sonde voor EGFP om enkele voorlopercellen, nefrogene aggregaten en de distale tubuli van ontluikende nefronen te labelen. Deze methode zal een dieper inzicht geven in de ontwikkeling van mesonephros en inzicht geven in regeneratieve therapieën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

De zebravis vormt tijdens zijn leven twee nierstructuren. De pronephros (embryonale nier) vormt zich tijdens de embryonale ontwikkeling en begint te functioneren op 2 dagen na de bevruchting. De pronephros bestaat uit slechts twee nefronen en dient als enige nier tijdens het larvale leven totdat er meer nierfunctie nodig is vanwege de toenemende lichaamsmassa. Om aan deze hogere vraag te voldoen, begint de mesonephros (volwassen nier) zich te vormen tijdens metamorfose. De nieuwe primaire nefronen versmelten met de pronephros en vormen verbonden lumen. Vervolgens fuseren secundaire nefronen met primaire (enzovoort) om een vertakkend netwerk in de mesonephros te creëren. Het overgrote deel van het onderzoek is gericht op de pronephros vanwege het gemak van het gebruik van embryo's. Er is dus behoefte aan het ontwikkelen van technieken om oudere en grotere larven en jonge vissen te bestuderen om de ontwikkeling van mesonephros beter te begrijpen. Hier is een in situ hybridisatieprotocol voor genexpressieanalyse geoptimaliseerd voor sondepenetratie, wassen van sondes en antilichamen en bleken van pigmenten om de mesonephros beter te visualiseren. De Tg(lhx1a-EGFP) transgene lijn wordt gebruikt om voorlopercellen en de distale tubuli van ontluikende nefronen te labelen. Dit protocol vult een leemte in mesonephros-onderzoek. Het is een cruciaal model om te begrijpen hoe nieuwe nierweefsels zich vormen en integreren met bestaande nefronen en inzichten bieden in regeneratieve therapieën.

Met behulp van de Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn werd aangetoond dat dit in situ hybridisatieprotocol effectief is in het labelen van niervoorlopercellen en verschillende nefronstructuren tijdens de ontwikkeling van mesonephros. Zoals verwacht is het centrale zenuwstelsel ook gelabeld in deze transgene lijn (niet weergegeven). Het initiële mesonefrische nefron vormt zich op ongeveer 5,2 mm, dorsaal aan de pronephros (figuur 2A), en de distale tubulus van dit nefron wordt g...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

De zebravis is een belangrijk model voor het begrijpen van de nierontwikkeling. Hier wordt een in situ hybridisatieprotocol geoptimaliseerd om genexpressie in zebravislarven en juvenielen te detecteren tijdens de ontwikkeling van mesonephros.

In situ Hybridisatie in zebravislarven en juvenielen tijdens mesonephrosontwikkeling

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Dit protocol is belangrijk omdat het de bepaling van genexpressie in oudere zebravislarven en juvenielen tijdens metamorfose mogelijk maakt. Het voordeel van deze techniek is dat verschillende stappen zijn geoptimaliseerd voor sondepenetratie en visualisatie van de nier. Om te beginnen, stel volwassen zebravissen in om te paren door een mannelijke en een vrouwelijke vis toe te voegen in een paringstank in de late namiddag na hun laatste maaltijd.Verzamel de volgende dag de embryo's in petriplaten met E3-medium. Plaats vijf dagen na de bevruchting een scherm van 400 micrometer in een tank van 2,8 liter en vul deze met 2 centimeter systeemwater. Voeg vervolgens de larve van één petriplaat toe.Om de larve te fixeren, verwijdert u een tank met larve op het gewenste tijdstip en brengt u vervolgens met behulp van een net en pipet over met de afgesneden punt, de larve over naar de petriplaat. Voeg vervolgens twee milliliter 2% tricaïne toe om de larve te immobiliseren. Vervang na immobilisatie de tricaine door 20 milliliter bevestigingsoplossing.Breng de larve na 30 minuten over in een buis van 50 milliliter met 25 milliliter verse fixatieoplossing. Zorg er vervolgens voor dat de dop strak zit en schommel de buis langzaam op vier graden Celsius gedurende twee dagen. Vervang op dag drie de bevestigingsoplossing door 20 milliliter PBST en breng de larve over naar een petriplaat.Om de larve te meten, plaatst u de petriplaat op een platte liniaal onder een ontleedmicroscoop en verplaatst u vervolgens, met behulp van een wimpermanipulator, elke larve op de liniaal om de totale lengte te meten. Combineer na het meten van alle larven verschillende larven van vergelijkbare lengtes op één glazen injectieflacon van 5,5 milliliter met PBST. Vervang voor uitdroging de PBST in de glazen injectieflacon door vier milliliter 100% methanol en bewaar de injectieflacon vervolgens twee dagen bij min 20 graden Celsius.Vervang voor rehydratatie de 100% methanol door vier milliliter van een 75% methanol en 25% PBST-oplossing en laat de injectieflacon gedurende vijf minuten schommelen. Vervang vervolgens de methanol- en PBST-oplossing door vier milliliter verse PBST en laat de injectieflacon opnieuw gedurende 10 minuten schommelen. Vervang voor de vertering van Proteinase K de PBST door twee milliliter van een Proteinase K-oplossing en laat de injectieflacon gedurende 30 minuten op kamertemperatuur schommelen.Breng vervolgens voor het bleken de larve over op een plaat met zes putten en vervang de PBST door drie milliliter verse bleekoplossing. Na het volledig verdwijnen van pigmentatie langs de mesonephros, breng de larve terug in een glazen injectieflacon, vervang de bleekoplossing door vier milliliter PBST en laat de injectieflacon gedurende 10 minuten schommelen. Vervang voor pre-hybridisatie de bevestigingsoplossing door vier milliliter PBST en laat de injectieflacon gedurende 10 minuten schommelen en vervang vervolgens de PBST door vier milliliter Hyb-oplossing en steen gedurende 10 minuten.Vervang na twee extra incubaties in de Hyb-oplossing de oplossing door vier milliliter van de Hyb+-oplossing. Verdun tegelijkertijd de EGFP-fluoresceïnesonde één tot 100 op 500 microliter hybridisatie plus oplossing en incubeer de injectieflacon en sonde 's nachts bij 70 graden Celsius. Vervang de volgende dag, om de sonde te hybridiseren, de Hyb + -oplossing in de injectieflacon door de voorverwarmde sonde en incubeer 's nachts bij 70 graden Celsius.Voeg de volgende dag 50 milliliter voorverwarmd 0,2 keer SSCT toe aan een buis van 50 milliliter. Plaats vervolgens een celzeef van 100 micrometer in de bovenkant van de buis, breng de larve van de glazen injectieflacon over in de celzeef en zorg ervoor dat de larve in de buffer wordt ondergedompeld, incubeer de injectieflacon bij 70 graden Celsius gedurende twee uur. Breng na de incubatie de celzeef over in een nieuwe buis met voorverwarmd 0,2 keer SSCT en incubeer opnieuw bij 70 graden Celsius gedurende twee uur.Breng vervolgens, om te blokkeren, de larve over naar een nieuwe glazen injectieflacon en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Vervang vervolgens de 0,2 keer SSCT-oplossing door vier milliliter van een 67% 0,2 keer SSCT- en 33% MABT-oplossing en laat de injectieflacon gedurende 10 minuten op kamertemperatuur schommelen. Vervang vervolgens de SSCTT MABT-oplossing door vier milliliter verse MABT en incubeer de injectieflacon gedurende 10 minuten op een rocker.Vervang vervolgens de MABT door vier milliliter blokkeeroplossing en incubeer 's nachts vier graden Celsius. Vervang de volgende dag de blokkerende oplossing door een antilichaamoplossing en incubeer gedurende twee dagen bij vier graden Celsius. Breng voor het wassen van antilichamen de larve over in een buis van 50 milliliter, voeg vervolgens 40 milliliter PBST2 toe en leg de buis op zijn kant voor nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.Vervang op dag 12, na het overbrengen van de lava naar een plaat met zes putten, de PBST2 door drie milliliter vlekkenbuffer. Vervang na een incubatietijd van vijf minuten op een wip de kleuringsbuffer door drie milliliter van de kleuringsoplossing. Wanneer de gewenste kleurintensiteit is bereikt, vervangt u de kleuringsoplossing door drie milliliter van de stopoplossing en rockt u gedurende 30 minuten.Breng vervolgens de larve over naar een nieuwe glazen injectieflacon, vervang de stopoplossing door vier milliliter verse bevestigingsoplossing en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Vervang voor beeldvorming de bevestigingsoplossing door vier milliliter verse PBST. Na een incubatie van 10 minuten op een rocker, breng je de larve over op een plaat met zes putten, vervang je de PBST door vier milliliter verse PBST en rock je de plaat opnieuw gedurende 10 minuten.Voeg vervolgens drie milliliter 50% glycerol toe aan PBST en rock gedurende 10 minuten en beeld vervolgens met behulp van een ontleedmicroscoop de larve rechtstreeks in de plaat met zes putten af. Dit in situ hybridisatieprotocol labelt effectief niervoorlopercellen en verschillende nefronstructuren met behulp van mesonephros-ontwikkeling. Het initiële mesonefrische nefron vormt zich op ongeveer 5,2 millimeter dorsaal naar de pronephros.Clusters van voorlopercellen zijn aanwezig tijdens de ontwikkeling van mesonephros naast enkelvoudige voorlopercellen. Bij grotere juvenielen kunnen achtergrondkleuringen optreden in de somites. Over het algemeen kan deze methode worden gebruikt om andere weefsels te bestuderen die zich vormen tijdens metamorfose, naast ontleedde volwassen organen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inductie van hypoxie in levende kikker en zebravis embryo&#39;s

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...