Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

Le financement a été fourni par la Pennsylvania Academy of Science, le Commonwealth of Pennsylvania Biologists et l’Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology et Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) a été fournie par le Dr Neil Hukriede (Université de Pittsburgh).

L’utilisation de larves et de juvéniles de poisson zèbre est approuvée par l’IUP IACUC (protocole #02-1920, #08-1920). Les détails du contenu de la solution sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Élever des larves
REMARQUE: Il faudra jusqu’à 21 jours ou plus pour élever les larves et les juvéniles au stade d’intérêt.
<ol><li>Installez le poisson-zèbre adulte pour qu’il s’accouple en ajoutant 1 poisson mâle et 1...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

La méthode d’hybridation in situ décrite ici vise à étudier le développement du mésonéphros. Cependant, il peut être appliqué pour étudier le développement d’autres tissus et organes pendant la métamorphose, tels que l’intestin, le système nerveux, les écailles et la pigmentation14. Des sondes peuvent être générées pour des gènes endogènes ou des marqueurs fluorescents dans des lignées transgéniques.
Il est essentiel que les larves r...

L’embryon de poisson-zèbre est un modèle important pour étudier le développement tissulaire en raison de sa petite taille, de sa transparence, des outils disponibles et de sa survie sans se nourrir jusqu’à cinq jours1,2. Il a grandement contribué à la compréhension du développement des reins et à la conservation entre le poisson-zèbre et les mammifères3,4,5. Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des fluides, la filtration du sang et l’excrétion des déchets6. Le néphron, l’unité fonctionnelle du rein, comprend un filtre sanguin relié à un long tubule. Chez le poisson-zèbre, deux structures rénales se forment tout au long de sa vie. Le pronephros (le rein embryonnaire temporaire) se forme d’abord au cours du développement précoce. Il se compose de deux néphrons courant le long de l’axe antérieur-postérieur et devient fonctionnel environ 2 jours après la fécondation (dpf). L’utilité du pronephros réside dans sa simplicité, n’ayant que deux néphrons qui sont pour la plupart linéaires et faciles à visualiser (bien que le tubule alambiqué proximal commence à s’enrouler à trois dpf)3. Cela a facilité non seulement l’étude de son développement précoce à partir du mésoderme intermédiaire, mais aussi le modèle de segmentation et la réparation des tubules7,8.
L’utilité du poisson-zèbre devient limitée après cinq dpf, lorsque le jaune est diminué et que les larves dépendent de l’alimentation du système aquatique9. Vers l’âge de 2 semaines, les larves subissent une métamorphose en juvéniles, où de nouveaux tissus se forment et d’anciens tissus sont perdus et/ou réorganisés9. C’est aussi à ce moment-là que le mésonéphros (le rein adulte permanent) se forme10,11,12. Le premier néphron adulte se forme près de la sixième somite et fusionne avec le tubule distal précoce du pronephros. Des néphrons supplémentaires sont ajoutés postérieurs à cette position dans un premier temps, mais aussi vers l’avant plus tard. Les néphrons primaires de cette première onde fusionnent avec les tubules des pronephros et partagent une lumière commune pour déposer leurs déchets. Les néphrons secondaires se forment dans l’onde suivante et fusionnent avec les néphrons primaires. Ce processus répétitif crée un mésonéphros ramifié, un peu semblable au rein de mammifère. Vraisemblablement, le pronephros finit par perdre son identité de tubule et devient deux canaux collecteurs majeurs où tous les néphrons drainent leurs déchets13.
Avant la formation du premier néphron adulte, des cellules progénitrices uniques commencent à apparaître chez les larves d’environ 4 mm (longueur totale) (~ 10 dpf). Ces cellules, qui sont marquées dans la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), adhèrent aux pronéphros et semblent migrer vers de futurs sites de néphrogenèse. Les cellules individuelles fusionnent en grappes, qui se différencient en nouveaux néphrons12. On ne sait pas où résident ces cellules ou quels gènes elles expriment avant le début de la mésonéphrogenèse.
Comprendre le développement des mésonéphros fournit des informations sur le rein des mammifères d’une manière que les pronéphros ne peuvent pas. Ceux-ci incluent la formation d’agrégats néphrogéniques à partir de cellules progénitrices uniques, l’intégration fonctionnelle de nouveaux néphrons avec les cellules existantes et la morphogenèse ramifiée. Cependant, il y a des limites à l’étude du développement postmbryonique. Les larves sont moins transparentes en raison de leur plus grande taille et de leur pigmentation. La chronologie du développement n’est pas synchrone entre les animaux individuels et dépend fortement de facteurs environnementaux, tels que l’alimentation et l’encombrement9,14. Bien qu’il existe des réactifs knockdown, ils sont moins efficaces chez les larves que chez les embryons15. Dans ce protocole, une méthode d’hybridation in situ pour déterminer l’expression des gènes au cours du développement du mésonephros du poisson-zèbre est décrite. Plusieurs étapes sont optimisées pour augmenter la visualisation des mésonéphros et la pénétration et le lavage de la sonde et de l’anticorps. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée avec une sonde pour l’EGFP pour marquer les cellules progénitrices uniques, les agrégats néphrogéniques et les tubules distaux des néphrons naissants. Cette méthode fournira une compréhension plus approfondie du développement des mésonéphros et un aperçu des thérapies régénératives.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

Le poisson-zèbre forme deux structures rénales au cours de sa vie. Le pronephros (rein embryonnaire) se forme au cours du développement embryonnaire et commence à fonctionner 2 jours après la fécondation. Composé de seulement deux néphrons, le pronephros sert de seul rein pendant la vie larvaire jusqu’à ce que plus de fonction rénale soit nécessaire en raison de l’augmentation de la masse corporelle. Pour faire face à cette demande plus élevée, le mésonéphros (rein adulte) commence à se former pendant la métamorphose. Les nouveaux néphrons primaires fusionnent avec les pronéphros et forment des lumens connectés. Ensuite, les néphrons secondaires fusionnent avec les néphrons primaires (et ainsi de suite) pour créer un réseau de branchement dans les mésonéphros. La grande majorité de la recherche est axée sur les pronéphros en raison de la facilité d’utilisation des embryons. Ainsi, il est nécessaire de développer des techniques pour étudier les larves et les poissons juvéniles plus âgés et plus gros afin de mieux comprendre le développement des mésonéphros. Ici, un protocole d’hybridation in situ pour l’analyse de l’expression génique est optimisé pour la pénétration de la sonde, le lavage des sondes et des anticorps, et le blanchiment des pigments pour mieux visualiser le mésonéphros. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée pour marquer les cellules progénitrices et les tubules distaux des néphrons naissants. Ce protocole comble une lacune dans la recherche sur les mésonéphros. Il s’agit d’un modèle crucial pour comprendre comment les nouveaux tissus rénaux se forment et s’intègrent aux néphrons existants et fournir des informations sur les thérapies régénératives.

En utilisant la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), il a été démontré que ce protocole d’hybridation in situ est efficace pour marquer les cellules progénitrices rénales et diverses structures néphroniques au cours du développement du mésonéphros. Comme prévu, le système nerveux central est également étiqueté dans cette lignée transgénique (non montré). Le néphron mésonéphrique initial se forme à environ 5,2 mm, dorsal au pronéphros (figure 2A), e...

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In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.

In situ Hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Ce protocole est important car il permet de déterminer l’expression génique chez les larves et les juvéniles de poissons zèbres plus âgés lors de la métamorphose. L’avantage de cette technique est que plusieurs étapes ont été optimisées pour la pénétration de la sonde et la visualisation du rein. Pour commencer, mettez en place des poissons-zèbres adultes pour qu’ils s’accouplent en ajoutant un poisson mâle et un poisson femelle dans un aquarium d’accouplement en fin d’après-midi après leur dernier repas.Le lendemain, recueillir les embryons dans des plaques de Petri contenant du milieu E3. Cinq jours après la fertilisation, placez un écran de 400 micromètres dans un réservoir de 2,8 litres et remplissez-le de 2 centimètres d’eau système. Ajoutez ensuite la larve d’une plaque de Pétri.Pour fixer la larve, retirez un réservoir de larve au moment souhaité, puis, à l’aide d’un filet et d’une pipette de transfert avec son extrémité coupée, transférez la larve sur la plaque de Pétri. Ensuite, ajoutez deux millilitres de 2% de tricaïne pour immobiliser la larve. Après immobilisation, remplacer la tricaïne par 20 millilitres de solution de fixation.Après 30 minutes, transférer la larve dans un tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de solution fixatrice fraîche. Ensuite, en vous assurant que le bouchon est serré, secouez lentement le tube à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Le troisième jour, remplacez la solution de fixation par 20 millilitres de PBST, puis transférez la larve dans une plaque de Pétri.Pour mesurer la larve, placez la plaque de Petri au-dessus d’une règle plate sous un microscope à dissection, puis, à l’aide d’un manipulateur de cils, déplacez chaque larve sur la règle pour mesurer sa longueur totale. Après avoir mesuré toutes les larves, combinez plusieurs larves de longueurs similaires sur un flacon en verre de 5,5 millilitres avec du PBST. Pour la déshydratation, remplacez le PBST dans le flacon en verre par quatre millilitres de 100% de méthanol, puis conservez le flacon à moins 20 degrés Celsius pendant deux jours.Pour la réhydratation, remplacez le 100 % de méthanol par quatre millilitres d’une solution à 75 % de méthanol et à 25 % de PBST et faites basculer le flacon pendant cinq minutes. Ensuite, remplacez la solution de méthanol et de PBST par quatre millilitres de PBST frais et faites basculer à nouveau le flacon pendant 10 minutes. Pour la digestion de la protéinase K, remplacez le PBST par deux millilitres d’une solution de protéinase K et faites basculer le flacon à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, pour le blanchiment, transférer la larve dans une plaque de six puits et remplacer le PBST par trois millilitres de solution de blanchiment fraîche. Après la disparition complète de la pigmentation le long du mésonéphros, transférez la larve dans un flacon en verre, remplacez la solution de blanchiment par quatre millilitres de PBST et bercez le flacon pendant 10 minutes. Pour la pré-hybridation, remplacez la solution de fixation par quatre millilitres de PBST et faites basculer le flacon pendant 10 minutes, puis remplacez le PBST par quatre millilitres de solution Hyb et de roche pendant 10 minutes.Après deux incubations supplémentaires dans la solution Hyb, remplacez la solution par quatre millilitres de la solution Hyb+. Diluer simultanément la sonde de fluorescéine EGFP de un à 100 dans 500 microlitres de solution d’hybridation plus, et incuber le flacon et la sonde à 70 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, pour hybrider la sonde, remplacer la solution Hyb+ dans le flacon par la sonde préchauffée et incuber à 70 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, ajoutez 50 millilitres de SSCT préchauffé 0,2 fois dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, insérez une passoire cellulaire de 100 micromètres dans le haut du tube, transférez la larve du flacon en verre dans la passoire cellulaire et, en veillant à ce que les larves soient immergées dans le tampon, incubez le flacon à 70 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, transférer la passoire cellulaire dans un nouveau tube contenant 0,2 fois SSCT préchauffé et incuber à nouveau à 70 degrés Celsius pendant deux heures.Ensuite, pour le blocage, transférez la larve dans un nouveau flacon en verre et laissez-la refroidir à la température ambiante. Ensuite, remplacez la solution SSCT 0,2 fois par quatre millilitres d’une solution SSCT 67% 0,2 fois et 33% MABT et bercez le flacon à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, remplacez la solution SSCTT MABT par quatre millilitres de MABT frais et incubez le flacon sur un culbuteur pendant 10 minutes.Ensuite, remplacez le MABT par quatre millilitres de solution bloquante et incubez quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez la solution bloquante par une solution d’anticorps et incubez à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Pour le lavage des anticorps, transférez la larve dans un tube de 50 millilitres, puis ajoutez 40 millilitres de PBST2 et posez le tube posé sur le côté pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius.Le jour 12, après avoir transféré la lave dans une plaque de six puits, remplacez le PBST2 par trois millilitres de tampon de coloration. Après une incubation de cinq minutes sur une bascule, remplacez le tampon de coloration par trois millilitres de la solution de coloration. Lorsque l’intensité de coloration souhaitée est atteinte, remplacez la solution de coloration par trois millilitres de la solution d’arrêt et de la roche pendant 30 minutes.Ensuite, transférez la larve dans un nouveau flacon en verre, remplacez la solution d’arrêt par quatre millilitres de solution de fixation fraîche et incubez pendant une heure à température ambiante. Pour l’imagerie, remplacez la solution de fixation par quatre millilitres de PBST frais. Après une incubation de 10 minutes sur une bascule, transférez la larve dans une plaque de six puits, puis remplacez le PBST par quatre millilitres de PBST frais et secouez à nouveau la plaque pendant 10 minutes.Ensuite, ajoutez trois millilitres de glycérol à 50% dans le PBST et la roche pendant 10 minutes, puis, à l’aide d’un microscope à dissection, imagez la larve directement dans la plaque à six puits. Ce protocole d’hybridation in situ marque efficacement les cellules progénitrices rénales et diverses structures de néphrons en utilisant le développement de mésonéphros. Le néphron mésonéphrique initial se forme à environ 5,2 millimètres dorsal au pronephros.Des grappes de cellules progénitrices sont présentes pendant le développement du mésonéphros en plus des cellules progénitrices uniques. Chez les juvéniles plus grands, une coloration de fond peut se produire dans les somites. Dans l’ensemble, cette méthode peut être utilisée pour étudier d’autres tissus qui se forment pendant la métamorphose, en plus des organes adultes disséqués.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Comprendre organogenèse précoce aide d&#39;un simplifié<em&gt; In Situ</em&gt; Protocole hybridation in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Recherche

Biologie du développement

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induction de l&#39;hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Génotypage et quantification de l'hybridation in situ Taining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...