Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

המימון ניתן על ידי האקדמיה למדע של פנסילבניה, וחבר העמים של פנסילבניה ביולוגים, ואוניברסיטת אינדיאנה של פנסילבניה (בית הספר ללימודים מתקדמים ומחקר, המחלקה לביולוגיה, ואת סינתיה Sushak לתואר ראשון ביולוגיה הקרן למצוינות). הקו הטרנסגני Tg (lhx1a-EGFP) סופק על ידי ד"ר ניל הוקריגה (אוניברסיטת פיטסבורג).

השימוש בזחלי דגי זברה וצעירים מאושר על ידי IUP IACUC (פרוטוקול #02-1920, #08-1920). פרטי תוכן הפתרון מפורטים ברשימת החומרים.
1. גידול זחלים
הערה: זה ייקח עד 21 ימים או יותר כדי להעלות זחלים וצעירים לשלב של עניין.
<ol><li>הקימו דגי זברה בוגרים להזדווג על ידי הוספת דג זכר...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

שיטת ההכלאה במקום המתוארת כאן נועדה ללמוד פיתוח מסונפרוס. עם זאת, ניתן ליישם אותו כדי לחקור את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים במהלך מטמורפוזה, כגון המעיים, מערכת העצבים, קשקשים, פיגמנטציה14. בדיקות ניתן ליצור עבור גנים אנדוגניים או סמנים פלואורסצנטיים בקווים מהונדסים.
...

עובר דג הזברה הוא מודל חשוב לחקר התפתחות הרקמות בשל גודלו הקטן, השקיפות, הכלים הזמינים וההישרדות שלו ללא הזנה עד חמישה ימים1,2. היא תרמה רבות להבנת התפתחות הכליות ולשימור בין דגי זברה ליונקים3,4,5. הכליה ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס נוזלי, סינון הדם והפרשת פסולת6. הנפרון, היחידה התפקודית של הכליה, כולל מסנן דם המחובר לצינור ארוך. בדגי זברה נוצרים שני מבני כליות לאורך כל חייו. הנוטה (הכליה העוברית הזמנית) נוצרת תחילה במהלך ההתפתחות המוקדמת. הוא מורכב משני נפרונים רצים לאורך הציר הקדמי-אחורי והופך לפונקציונלי בסביבות 2 ימים לאחר ההפריה (dpf). התועלת של הנוטה טמונה בפשטות שלה, שיש רק שני נפרונים כי הם בעיקר ליניארי וקל לדמיין (אם כי הצינור המפותל הפרוקסימלי מתחיל סליל בשלושה dpf)3. זה הקל לא רק על מחקרים על התפתחותה המוקדמת מן mesoderm הביניים, אלא גם את דפוס פילוח ותיקון צינורית7,8.
התועלת של דגי זברה מוגבלת לאחר חמישה dpf, כאשר החלמון פוחת והזחלים מסתמכים על האכלה במערכת הימית9. בסביבות 2 שבועות, הזחלים עוברים מטמורפוזה לקטינים, שם נוצרות רקמות חדשות ורקמות ישנות אובדות ו/או מאורגנות מחדש9. זה גם כאשר mesonephros (הכליה הבוגרת הקבועה) יוצר10,11,12. הנפרון הבוגר הראשון נוצר ליד הסומיט השישי, ומתמזג עם הצינורית המוקדמת הדיסטלית של הנוגים. נפרונים נוספים מתווספים אחוריים לעמדה זו בתחילה, אך גם לכיוון הקדמי בהמשך. הנפרונים העיקריים בגל הראשון מתמזגים לצינורות של הנוטים וחולקים לומן משותף להפקיד את הפסולת שלהם. נפרונים משניים נוצרים בגל הבא ומתמזגים לנפרונים ראשיים. תהליך חוזר זה יוצר מסונפרוס המסתעף, דומה במקצת לכליות היונקים. ככל הנראה, הנוטה בסופו של דבר מאבדת את זהות הצינור שלה והופכת לשני צינורות איסוף עיקריים שבהם כל הנפרונים מרוקנים את הפסולת שלהם13.
לפני היווצרותו של הנפרון הבוגר הראשון, תאי אבות יחידים מתחילים להופיע בזחלים ~4 מ"מ (אורך כולל) (~ 10 dpf). תאים אלה, המסומנים בקו מהונדס Tg(lhx1a-EGFP), לדבוק נוטה ונדמה להעביר לאתרים עתידיים של נפרוגנזה. התאים הבודדים מתמזגים לאשכולות, המבדילים לנפרונים חדשים12. לא ברור היכן תאים אלה שוכנים או אילו גנים הם מבטאים לפני תחילתו של mesonephrogenesis.
הבנת התפתחות מסונפרוס מספקת תובנות על כליות היונקים בדרכים שהנואפרוסים אינם יכולים. אלה כוללים היווצרות של אגרגטים נפרוגניים מתאי אבות יחידים, שילוב פונקציונלי של נפרונים חדשים עם קיימים, ומורפוגנזה מסתעפת. עם זאת, ישנן מגבלות לחקר התפתחות פוסט-מבריונית. הזחלים פחות שקופים בשל גודלם הגדול יותר ויש להם פיגמנטציה. ציר הזמן ההתפתחותי אינו סינכרוני בין בעלי חיים בודדים ותלוי מאוד בגורמים סביבתיים, כגון האכלה וצפיפות 9,14. למרות ריאגנטים נוקאאוט קיימים, הם פחות יעילים בזחלים לעומת עוברים15. בפרוטוקול זה, מתוארת שיטת הכלאה במקום לקביעת ביטוי גנים במהלך התפתחות mesonephros של דגי זברה. מספר שלבים מותאמים להגברת ההדמיה של mesonephros וחדירה ושטיפה של הבדיקה ואת הנוגדן. הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP) משמש יחד עם בדיקה עבור EGFP כדי לתייג תאים יחידים של אבות, אגרגטים נפרוגניים, ואת צינורות דיסטליים של נפרונים המתהווה. שיטה זו תספק הבנה עמוקה יותר של התפתחות mesonephros ותובנה על טיפולים רגנרטיביים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

דג הזברה יוצר שני מבני כליות בחייו. הנוטה (כליה עוברית) נוצרת במהלך התפתחות עוברית ומתחילה לתפקד ביומיים לאחר ההפריה. המורכב משני נפרונים בלבד, הנוטה משמשת ככליה היחידה במהלך חיי הזחל עד שנדרשת תפקוד כליות נוסף בשל מסת הגוף ההולכת וגדלה. כדי להתמודד עם דרישה גבוהה זו, mesonephros (כליה בוגרת) מתחיל להיווצר במהלך מטמורפוזה. הנפרונים הראשיים החדשים מתמזגים לנוודים ויוצרים לומן מחובר. לאחר מכן, נפרונים משניים מתמזגים לראשונים (וכן הלאה) כדי ליצור רשת הסתעפות במסונפרוס. הרוב המכריע של המחקר מתמקד נוטה בשל הקלות של שימוש בעוברים. לכן, יש צורך לפתח טכניקות ללמוד זחלים מבוגרים וגדולים יותר ודגים צעירים כדי להבין טוב יותר את התפתחות mesonephros. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום לניתוח ביטוי גנים מותאם לחדירת בדיקה, שטיפת בדיקות ונוגדנים, והלבנת פיגמנטים כדי לדמיין טוב יותר את mesonephros. הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP) משמש לתיוג תאי אבות ואת הצינורות הדיסטליים של נפרונים המתהווים. פרוטוקול זה ממלא פער במחקר mesonephros. זהו מודל חיוני להבנת האופן שבו רקמות כליות חדשות נוצרות ומשתלבות עם נפרונים קיימים ומספקות תובנות על טיפולים רגנרטיביים.

באמצעות הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP), הוכח כי זה בפרוטוקול הכלאה במקום יעיל בתיוג תאי צאצא כליות ומבנים שונים של נפרון במהלך פיתוח mesonephros. כצפוי, מערכת העצבים המרכזית מסומנת גם בקו מהונדס זה (לא מוצג). הנפרון המסונפירי הראשוני נוצר במהירות של כ-5.2 מ"מ, גב לנטייה (איור 2A), והצינ...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר קביעת ביטוי גנים בזחלי דגי זברה ישנים וצעירים במהלך מטמורפוזה. היתרון של טכניקה זו הוא כי כמה שלבים כבר אופטימיזציה עבור חדירת בדיקה ויזואליזציה של הכליה. כדי להתחיל, הקם דגי זברה בוגרים להזדווג על ידי הוספת זכר אחד ונקבה אחת במיכל הזדווגות בשעות אחר הצהריים המאוחרות לאחר הארוחה האחרונה שלהם.למחרת, לאסוף את העוברים בצלחות פטרי המכילים E3 בינוני. חמישה ימים לאחר ההפריה, הניחו מסך 400 מיקרומטר במיכל 2.8 ליטר ומלאו אותו ב-2 ס"מ של מי מערכת. לאחר מכן מוסיפים את הזחל מצלחת פטרי אחת.כדי לתקן את הזחל, להסיר מיכל של זחל בנקודת הזמן הרצויה, ולאחר מכן, באמצעות רשת ולהעביר pipette עם קצה שלה מנותק, להעביר את הזחל לצלחת פטרי. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של 2% tricaine כדי לשתק את הזחל. לאחר אימוביליזציה, להחליף את tricaine עם 20 מיליליטר של פתרון תיקון.לאחר 30 דקות, להעביר את הזחל לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של פתרון תיקון טרי. לאחר מכן, להבטיח כי המכסה הוא חזק, לאט לאט לטלטל את הצינור בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים. ביום השלישי, להחליף את פתרון התיקון עם 20 מיליליטר של PBST ולאחר מכן להעביר את הזחל לצלחת פטרי.כדי למדוד את הזחל, מניחים את צלחת הפטרי על גבי סרגל שטוח תחת מיקרוסקופ מנתח, ולאחר מכן, באמצעות מניפולטור ריסים, להזיז כל זחל על הסרגל כדי למדוד את אורכו הכולל. לאחר מדידת כל הזחלים, לשלב כמה זחלים באורכים דומים על בקבוקון זכוכית אחד 5.5 מיליליטר עם PBST. להתייבשות, להחליף את PBST ב בקבוקון זכוכית עם ארבעה מיליליטר של 100%מתנול, ולאחר מכן לאחסן את בקבוקון במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך יומיים.עבור rehydration, להחליף את 100%מתנול עם ארבעה מיליליטר של 75% מתנול ו 25% פתרון PBST ולטלטל את המשחקון במשך חמש דקות. לאחר מכן, להחליף את פתרון מתנול ו PBST עם ארבעה מיליליטר של PBST טרי ולטלטל את המשחקון שוב במשך 10 דקות. לעיכול Proteinase K, החליפו את ה-PBST בשני מיליליטרים של תמיסת פרוטאינאז K ונענעו את הוויאל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר מכן, להלבנה, להעביר את הזחל לצלחת שש טוב ולהחליף את PBST עם שלושה מיליליטר של פתרון להלבנה טרי. לאחר היעלמותו המוחלטת של פיגמנטציה לאורך mesonephros, להעביר את הזחל בחזרה לתוך בקבוקון זכוכית, להחליף את פתרון ההלבנה עם ארבעה מיליליטר של PBST, ולטלטל את בקבוקון במשך 10 דקות. עבור טרום הכלאה, להחליף את פתרון התיקון עם ארבעה מיליליטר של PBST ולטלטל את הבקינה במשך 10 דקות, ולאחר מכן, להחליף את PBST עם ארבעה מיליליטר של Hyb-פתרון וסלע במשך 10 דקות.לאחר שתי דגרות נוספות בתמיסת Hyb, החלף את הפתרון בארבעה מיליליטרים של פתרון Hyb+. בו זמנית לדלל את גשושית פלואורסצ'ין EGFP אחד עד 100 ב 500 microliters של הכלאה בתוספת פתרון, ולדגירה את הנקינה ואת הבדיקה ב 70 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, כדי להכלא את הגשושית, החליפו את תמיסת Hyb+בבקריאלין בגשוש שהתחמם מראש ודגרה ב-70 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.למחרת, להוסיף 50 מיליליטר של 0.2 פעמים SSCT מחומם מראש לתוך צינור 50 מיליליטר. לאחר מכן, הכנס מסננת תא 100 מיקרומטר לחלק העליון של הצינור, להעביר את הזחל מן בקבוקון הזכוכית לתוך מסננת התא, ולהבטיח כי הזחל שקועים במאגר, לדגור על בקבוקון ב 70 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר הדגירה, להעביר את מסננת התא לתוך צינור חדש המכיל מחומם מראש 0.2 פעמים SSCT, ודגרה שוב ב 70 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.לאחר מכן, לחסימה, מעבירים את הזחל ל בקבוקון זכוכית חדש ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את פתרון SSCT 0.2 פעמים עם ארבעה מיליליטר של 67%0.2 פעמים SSCT ו 33%MABT פתרון ולטלטל את המשחקון בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן, להחליף את פתרון SSCTT MABT עם ארבעה מיליליטר של MABT טרי, ולדגירה את המשחקון על רוקר במשך 10 דקות.לאחר מכן, להחליף את MABT עם ארבעה מיליליטר של פתרון חסימה ודגור ארבע מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, להחליף את פתרון החסימה עם פתרון נוגדנים ודגור בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים. לשטיפת נוגדנים, להעביר את הזחל לתוך צינור 50 מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף 40 מיליליטר של PBST2, ולהניח את הצינור שוכב על צדו עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.ביום 12, לאחר העברת הלבה לצלחת שש בארות, להחליף את PBST2 עם שלושה מיליליטר של חוצץ כתמים. לאחר דגירה של חמש דקות על רוקר, החליפו את מאגר הכתמים בשלושה מיליליטרים של תמיסת הכתמים. כאשר עוצמת הכתמים הרצויה מגיעה, החליפו את תמיסת הכתמים בשלושה מיליליטרים של פתרון העצירה והסלע למשך 30 דקות.לאחר מכן, להעביר את הזחל ל בקבוקון זכוכית חדש, להחליף את פתרון עצירה עם ארבעה מיליליטר של פתרון תיקון טרי, ודגורה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. להדמיה, החלף את פתרון התיקון בארבעה מיליליטרים של PBST טרי. לאחר דגירה של 10 דקות על רוקר, להעביר את הזחל לצלחת שש באר, ולאחר מכן להחליף את PBST עם ארבעה מיליליטר של PBST טרי לטלטל את הצלחת שוב במשך 10 דקות.לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של 50%גליצל ב PBST וסלע במשך 10 דקות, ולאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ לנתח, תמונה הזחל ישירות בצלחת שש טוב. פרוטוקול הכלאה זה במקום מתייג ביעילות תאי אבות כליות ומבנים שונים של נפרון באמצעות פיתוח mesonephros. הנפרון המזונפרי הראשוני נוצר בערך 5.2 מילימטרים גב לנטייה.אשכולות של תאי אבות נמצאים במהלך התפתחות mesonephros בנוסף לתאי אבות יחיד. אצל קטינים גדולים יותר, כתמי רקע יכולים להתרחש בסמיטים. בסך הכל, שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד רקמות אחרות שנוצרו במהלך מטמורפוזה, בנוסף לאיברים בוגרים ניתחו.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...