Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

पेंसिल्वेनिया एकेडमी ऑफ साइंस, और पेंसिल्वेनिया जीवविज्ञानियों के राष्ट्रमंडल, और पेंसिल्वेनिया जीवविज्ञानियों के राष्ट्रमंडल, और पेंसिल्वेनिया के इंडियाना विश्वविद्यालय (स्कूल ऑफ ग्रेजुएट स्टडीज एंड रिसर्च, जीव विज्ञान विभाग, और उत्कृष्टता के लिए सिंथिया सुशाक अंडरग्रेजुएट बायोलॉजी फंड) द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था। Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन डॉ नील हकरीडे (पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई थी।

ज़ेब्राफ़िश लार्वा और किशोरों के उपयोग को IUP IACUC (प्रोटोकॉल # 02-1920, # 08-1920) द्वारा अनुमोदित किया गया है। समाधान सामग्री का विवरण सामग्री तालिका में सूचीबद्ध है।
1. लार्वा बढ़ाने
नोट: ल...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. 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C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. 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A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

यहां वर्णित इन सीटू संकरण विधि का उद्देश्य मेसोनेफ्रॉस विकास का अध्ययन करना है। हालांकि, इसे कायापलट के दौरान अन्य ऊतकों और अंगों के विकास का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि आंत, तंत?...

ज़ेब्राफ़िश भ्रूण अपने छोटे आकार, पारदर्शिता, उपलब्ध उपकरणों और पांच दिनों तक खिलाए बिना जीवित रहने के कारण ऊतक विकास का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है1,2। इसने गुर्दे के विकास की समझ और ज़ेब्राफ़िश और स्तनधारियों के बीच संरक्षण में बहुत योगदान दिया है3,4,5। गुर्दे द्रव होमोस्टैसिस को बनाए रखने, रक्त को फ़िल्टर करने और अपशिष्ट को उत्सर्जित करने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है6। नेफ्रॉन, गुर्दे की कार्यात्मक इकाई, एक लंबी नलिका से जुड़ा एक रक्त फिल्टर शामिल है। ज़ेब्राफ़िश में, दो गुर्दे की संरचनाएं अपने पूरे जीवन में बनती हैं। प्रोनफ्रॉस (अस्थायी भ्रूण गुर्दे) प्रारंभिक विकास के दौरान पहले बनता है। इसमें पूर्वकाल-पश्च अक्ष के साथ चलने वाले दो नेफ्रॉन होते हैं और निषेचन (डीपीएफ) के बाद लगभग 2 दिनों में कार्यात्मक हो जाता है। प्रोनफ्रॉस की उपयोगिता इसकी सादगी में निहित है, जिसमें केवल दो नेफ्रॉन होते हैं जो ज्यादातर रैखिक होते हैं और कल्पना करने में आसान होते हैं (हालांकि समीपस्थ जटिल नलिका तीन डीपीएफ पर कुंडल करना शुरू कर देती है)3। इसने न केवल मध्यवर्ती मेसोडर्म से इसके शुरुआती विकास के अध्ययन की सुविधा प्रदान की है, बल्कि विभाजन पैटर्न और नलिका की मरम्मत 7,8 भी की सुविधा प्रदान की है।
ज़ेब्राफ़िश की उपयोगिता पांच डीपीएफ के बाद सीमित हो जाती है, जब जर्दी कम हो जाती है और लार्वा जलीय प्रणाली में खिलाने पर भरोसा करते हैं। लगभग 2 सप्ताह की उम्र में, लार्वा किशोरों में कायापलट से गुजरते हैं, जहां नए ऊतक बनते हैं और पुराने ऊतक खो जाते हैं और / या पुनर्गठित होते हैं। यह तब भी होता है जब मेसोनेफ्रॉस (स्थायी वयस्क गुर्दे) 10,11,12 बनाता है। पहला वयस्क नेफ्रॉन छठे सोमाइट के पास बनता है, और प्रोनफ्रॉस के डिस्टल शुरुआती नलिका के साथ फ़्यूज़ करता है। अतिरिक्त नेफ्रॉन को शुरू में इस स्थिति के पीछे जोड़ा जाता है, लेकिन बाद में पूर्वकाल की ओर भी। इस पहली लहर में प्राथमिक नेफ्रॉन प्रोनफ्रोस की नलिकाओं को फ्यूज करते हैं और अपने अपशिष्ट को जमा करने के लिए एक आम लुमेन साझा करते हैं। माध्यमिक नेफ्रॉन अगली लहर में बनते हैं और प्राथमिक नेफ्रॉन के लिए फ्यूज होते हैं। यह पुनरावृत्ति प्रक्रिया एक मेसोनेफ्रोस बनाती है जो शाखित होती है, कुछ हद तक स्तनधारी गुर्दे के समान होती है। संभवतः, प्रोनफ्रॉस अंततः अपनी नलिका पहचान खो देता है और दो प्रमुख संग्रह नलिकाएं बन जाता है जहां सभी नेफ्रॉन अपने अपशिष्ट को निकालते हैं।
पहले वयस्क नेफ्रॉन के गठन से पहले, एकल पूर्वज कोशिकाएं ~ 4 मिमी (कुल लंबाई) लार्वा (~ 10 डीपीएफ) में दिखाई देने लगती हैं। ये कोशिकाएं, जिन्हें Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन में चिह्नित किया गया है, प्रोनफ्रॉस का पालन करती हैं और नेफ्रोजेनेसिस की भविष्य की साइटों पर माइग्रेट करने लगती हैं। एकल कोशिकाएं समूहों में मिलती हैं, जो नए नेफ्रॉन 12 में अंतर करती हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि ये कोशिकाएं कहां रहती हैं या मेसोनेफ्रोजेनेसिस की शुरुआत से पहले वे कौन से जीन व्यक्त करते हैं।
मेसोनेफ्रॉस के विकास को समझना स्तनधारी गुर्दे में उन तरीकों से अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो प्रोनफ्रॉस नहीं कर सकते हैं। इनमें एकल पूर्वज कोशिकाओं से नेफ्रोजेनिक समुच्चय का गठन, मौजूदा लोगों के साथ नए नेफ्रॉन का कार्यात्मक एकीकरण, और मॉर्फोजेनेसिस की शाखाओं में शामिल हैं। हालांकि, पोस्टमब्रायोनिक विकास का अध्ययन करने की सीमाएं हैं। लार्वा अपने बड़े आकार और रंजकता होने के कारण कम पारदर्शी होते हैं। विकास की समयरेखा व्यक्तिगत जानवरों के बीच तुल्यकालिक नहीं है और पर्यावरणीय कारकों पर अत्यधिक निर्भर है, जैसे कि खिलाना और भीड़ 9,14। हालांकि नॉकडाउन अभिकर्मक मौजूद हैं, वे भ्रूण 15 की तुलना में लार्वा में कम प्रभावी हैं। इस प्रोटोकॉल में, ज़ेब्राफ़िश मेसोनेफ्रॉस विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए एक इन सीटू संकरण विधि का वर्णन किया गया है। कई चरणों mesonephros और प्रवेश और जांच और एंटीबॉडी की धुलाई के दृश्य को बढ़ाने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग ईजीएफपी के लिए एकल पूर्वज कोशिकाओं, नेफ्रोजेनिक समुच्चय और नवजात नेफ्रॉन के डिस्टल नलिकाओं को लेबल करने के लिए ईजीएफपी के लिए एक जांच के साथ किया जाता है। यह विधि मेसोनेफ्रॉस के विकास की गहरी समझ और पुनर्योजी उपचारों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

ज़ेब्राफ़िश अपने जीवनकाल में दो गुर्दे की संरचनाएं बनाता है। प्रोनफ्रॉस (भ्रूण गुर्दे) भ्रूण के विकास के दौरान बनता है और निषेचन के बाद 2 दिनों में कार्य करना शुरू कर देता है। केवल दो नेफ्रॉन से मिलकर, प्रोनफ्रॉस लार्वा जीवन के दौरान एकमात्र गुर्दे के रूप में कार्य करता है जब तक कि शरीर के बढ़ते द्रव्यमान के कारण अधिक गुर्दे के कार्य की आवश्यकता न हो। इस उच्च मांग का सामना करने के लिए, मेसोनेफ्रोस (वयस्क गुर्दे) कायापलट के दौरान बनना शुरू हो जाता है। नए प्राथमिक नेफ्रॉन प्रोनफ्रॉस के लिए फ्यूज होते हैं और जुड़े हुए लुमेन बनाते हैं। फिर, माध्यमिक नेफ्रॉन मेसोनेफ्रोस में एक ब्रांचिंग नेटवर्क बनाने के लिए प्राथमिक लोगों (और इसी तरह) को फ्यूज करते हैं। अनुसंधान का विशाल बहुमत भ्रूण का उपयोग करने में आसानी के कारण प्रोनफ्रॉस पर केंद्रित है। इस प्रकार, मेसोनेफ्रॉस विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए पुराने और बड़े लार्वा और किशोर मछली का अध्ययन करने के लिए तकनीकों को विकसित करने की आवश्यकता है। यहां, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल को जांच प्रवेश, जांच और एंटीबॉडी की धुलाई, और मेसोनेफ्रॉस की बेहतर कल्पना करने के लिए पिगमेंट के विरंजन के लिए अनुकूलित किया गया है। Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग पूर्वज कोशिकाओं और नवजात नेफ्रॉन के डिस्टल नलिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल मेसोनेफ्रोस अनुसंधान में एक अंतर को भरता है। यह समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है कि नए गुर्दे के ऊतक कैसे बनते हैं और मौजूदा नेफ्रॉन के साथ एकीकृत होते हैं और पुनर्योजी उपचारों में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करते हुए, यह प्रदर्शित किया गया था कि यह इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल मेसोनेफ्रोस विकास के दौरान गुर्दे के पूर्वज कोशिकाओं और विभिन्न नेफ्रॉन संरचनाओं को लेबल करने म...

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In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

जेब्राफ़िश गुर्दे के विकास को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। यहां, मेसोनेफ्रॉस विकास के दौरान ज़ेब्राफ़िश लार्वा और किशोरों में जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है।

सीटू में Mesonephros विकास के दौरान Zebrafish लार्वा और किशोरों में संकरण

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह कायापलट के दौरान पुराने ज़ेब्राफ़िश लार्वा और किशोरों में जीन अभिव्यक्ति के निर्धारण की अनुमति देता है। इस तकनीक का लाभ यह है कि जांच प्रवेश और गुर्दे के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए कई चरणों को अनुकूलित किया गया है। शुरू करने के लिए, अपने अंतिम भोजन के बाद देर से दोपहर में एक संभोग टैंक में एक नर और एक मादा मछली जोड़कर संभोग करने के लिए वयस्क ज़ेब्राफ़िश स्थापित करें।अगले दिन, E3 माध्यम युक्त पेट्री प्लेटों में भ्रूण इकट्ठा करें। निषेचन के पांच दिनों के बाद, 2.8-लीटर टैंक में 400-माइक्रोमीटर स्क्रीन रखें और इसे 2 सेंटीमीटर सिस्टम पानी से भरें। फिर एक पेट्री प्लेट से लार्वा जोड़ें।लार्वा को ठीक करने के लिए, वांछित समय बिंदु पर लार्वा के एक टैंक को हटा दें, फिर, एक नेट का उपयोग करके और इसकी नोक के साथ पिपेट को स्थानांतरित करें, लार्वा को पेट्री प्लेट में स्थानांतरित करें। इसके बाद, लार्वा को स्थिर करने के लिए 2% ट्राइकेन के दो मिलीलीटर जोड़ें। immobilization के बाद, फिक्सिंग समाधान के 20 milliliters के साथ tricaine की जगह.30 मिनट के बाद, लार्वा को 50-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 25 मिलीलीटर ताजा फिक्सिंग समाधान होता है। फिर, यह सुनिश्चित करना कि टोपी तंग है, धीरे-धीरे दो दिनों के लिए ट्यूब को चार डिग्री सेल्सियस पर रॉक करें। तीसरे दिन, पीबीएसटी के 20 मिलीलीटर के साथ फिक्सिंग समाधान को बदलें, फिर लार्वा को पेट्री प्लेट में स्थानांतरित करें।लार्वा को मापने के लिए, पेट्री प्लेट को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक फ्लैट शासक के शीर्ष पर रखें, फिर, एक बरौनी मैनिपुलेटर का उपयोग करके, प्रत्येक लार्वा को अपनी कुल लंबाई को मापने के लिए शासक पर ले जाएं। सभी लार्वा को मापने के बाद, पीबीएसटी के साथ एक 5.5-मिलीलीटर ग्लास शीशी पर समान लंबाई के कई लार्वा को संयोजित करें। निर्जलीकरण के लिए, कांच की शीशी में पीबीएसटी को 100% मेथनॉल के चार मिलीलीटर के साथ बदलें, फिर शीशी को दो दिनों के लिए माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।पुनर्जलीकरण के लिए, 100% मेथनॉल को 75% मेथनॉल और 25% पीबीएसटी समाधान के चार मिलीलीटर के साथ बदलें और पांच मिनट के लिए शीशी को रॉक करें। फिर, मेथनॉल और पीबीएसटी समाधान को चार मिलीलीटर ताजा पीबीएसटी के साथ बदलें और 10 मिनट के लिए शीशी को फिर से रॉक करें। Proteinase K पाचन के लिए, PBST को Proteinase K समाधान के दो मिलीलीटर के साथ बदलें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शीशी को रॉक करें।इसके बाद, ब्लीचिंग के लिए, लार्वा को छह-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और पीबीएसटी को ताजा ब्लीचिंग समाधान के तीन मिलीलीटर के साथ बदलें। मेसोनेफ्रॉस के साथ रंजकता के पूरी तरह से गायब होने के बाद, लार्वा को कांच की शीशी में वापस स्थानांतरित करें, ब्लीचिंग समाधान को पीबीएसटी के चार मिलीलीटर के साथ बदलें, और 10 मिनट के लिए शीशी को रॉक करें। पूर्व-संकरण के लिए, पीबीएसटी के चार मिलीलीटर के साथ फिक्सिंग समाधान को बदलें और 10 मिनट के लिए शीशी को रॉक करें, फिर, पीबीएसटी को चार मिलीलीटर हाइब-समाधान और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें।Hyb-समाधान में दो अतिरिक्त ऊष्मायन के बाद, Hyb + समाधान के चार milliliters के साथ समाधान को प्रतिस्थापित करें। साथ ही संकरण प्लस समाधान के 500 माइक्रोलीटर में ईजीएफपी फ्लोरोसीन जांच को एक से 100 तक पतला करें, और शीशी को इनक्यूबेट करें और रात भर 70 डिग्री सेल्सियस पर जांच करें। अगले दिन, जांच को हाइब्रिड करने के लिए, शीशी में हाइब + समाधान को पहले से गर्म जांच के साथ बदलें और रात भर 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।अगले दिन, एक 50-मिलीलीटर ट्यूब में 0.2 गुना पहले से गर्म 0.2 बार एसएससीटी के 50 मिलीलीटर जोड़ें। फिर, ट्यूब के शीर्ष में एक 100-माइक्रोमीटर सेल छलनी डालें, कांच की शीशी से लार्वा को सेल छलनी में स्थानांतरित करें, और यह सुनिश्चित करें कि लार्वा बफर में डूबा हुआ है, दो घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर शीशी को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, सेल स्ट्रेनर को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 0.2 गुना एसएससीटी पहले से गर्म किया गया हो, और दो घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर फिर से इनक्यूबेट करें।अगला, अवरुद्ध करने के लिए, लार्वा को एक नई कांच की शीशी में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें। फिर, 0.2 बार एसएससीटी समाधान को 67% 0.2 बार एसएससीटी और 33% एमएबीटी समाधान के चार मिलीलीटर के साथ बदलें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शीशी को रॉक करें। इसके बाद, SSCTT MABT समाधान को चार मिलीलीटर ताजा MABT के साथ बदलें, और 10 मिनट के लिए एक रॉकर पर शीशी को इनक्यूबेट करें।फिर, एमएबीटी को चार मिलीलीटर ब्लॉकिंग समाधान के साथ बदलें और रात भर चार डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेट करें। अगले दिन, एक एंटीबॉडी समाधान के साथ अवरुद्ध समाधान को बदलें और दो दिनों के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी धोने के लिए, लार्वा को 50-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर PBST2 के 40 मिलीलीटर जोड़ें, और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन के लिए इसकी तरफ रखी गई ट्यूब को बिछाएं।दिन 12 पर, लावा को छह-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करने के बाद, PBST2 को तीन मिलीलीटर स्टेनिंग बफर के साथ बदलें। एक रॉकर पर पांच मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, धुंधला समाधान के तीन मिलीलीटर के साथ धुंधला बफर को बदलें। जब वांछित धुंधला तीव्रता तक पहुंच जाता है, तो 30 मिनट के लिए रोकने वाले समाधान और रॉक के तीन मिलीलीटर के साथ धुंधला समाधान को बदलें।फिर, लार्वा को एक नई कांच की शीशी में स्थानांतरित करें, नए फिक्सिंग समाधान के चार मिलीलीटर के साथ रोकने वाले समाधान को बदलें, और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इमेजिंग के लिए, ताजा PBST के चार milliters के साथ फिक्सिंग समाधान को बदलें। एक रॉकर पर 10 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, लार्वा को छह-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें, फिर पीबीएसटी को चार मिलीलीटर ताजा पीबीएसटी के साथ बदलें और प्लेट को 10 मिनट के लिए फिर से रॉक करें।इसके बाद, पीबीएसटी में 50% ग्लिसरॉल के तीन मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए रॉक करें, फिर, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, लार्वा को सीधे छह-अच्छी तरह से प्लेट में छवि दें। यह इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल प्रभावी रूप से गुर्दे के पूर्वज कोशिकाओं और मेसोनेफ्रोस विकास का उपयोग करके विभिन्न नेफ्रॉन संरचनाओं को लेबल करता है। प्रारंभिक मेसोनेफ्रिक नेफ्रॉन लगभग 5.2 मिलीमीटर पृष्ठीय पर प्रोनफ्रॉस के लिए बनता है।पूर्वज कोशिकाओं के समूह एकल पूर्वज कोशिकाओं के अलावा मेसोनेफ्रॉस विकास के दौरान मौजूद होते हैं। बड़े किशोरों में, सोमाइट्स में पृष्ठभूमि धुंधला हो सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि का उपयोग अन्य ऊतकों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो विच्छेदन वयस्क अंगों के अलावा, कायापलट के दौरान बनते हैं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

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समझना एक सरलीकृत का प्रयोग अर्ली जीवोत्पत्ति<em&gt; बगल में</emमें&gt; संकरण प्रोटोकॉल<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

समय चूक Brightfield Stereomicroscopy साथ zebrafish लार्वा में ऊतकों की मरम्मत पर कब्जा

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

रहने वाले मेंढक और ज़ेबराफिश भ्रूण में हाइपोक्सिया का प्रेरण

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebrafish में Multiciliated कोशिकाओं visualizing सीटू संकरण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट के एक संयुक्त प्रोटोकॉल के माध्यम से

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

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astyanax भ्रूण के लिए स्वस्थानी संकरण में wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

जेब्राफिश में सीटू संकरण धुंधला में जेनोटीपिंग और क्वांटिफिकेशन

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

पूरे माउंट में सीटू संकरण में जेब्राफिश भ्रूण और ट्यूब गठन परख में iPSC-ECs में परख संवहनी विकास में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

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फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग और उसके बाद सिटू संकरण में ज़ेनोपस लेवेइस में न्यूरोनल अग्रदूत लक्षण वर्णन के लिए

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...