Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
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Il finanziamento è stato fornito dalla Pennsylvania Academy of Science, dal Commonwealth of Pennsylvania Biologists e dall'Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology e Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) è stata fornita dal Dr. Neil Hukriede (Università di Pittsburgh).

L'uso di larve e novellame di zebrafish è approvato dalla IUP IACUC (protocollo #02-1920, #08-1920). I dettagli del contenuto della soluzione sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Allevamento di larve
NOTA: Ci vorranno fino a 21 giorni o più per allevare larve e giovani allo stadio di interesse.
<ol><li>Prepara il pesce zebra adulto ad accoppiarsi aggiungendo 1 pesce maschio e 1 femmina in una vasca di accoppiamento nel tardo pomeriggio ...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. 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C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. 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A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

Il metodo di ibridazione in situ qui descritto ha lo scopo di studiare lo sviluppo del mesonefro. Tuttavia, può essere applicato per studiare lo sviluppo di altri tessuti e organi durante la metamorfosi, come l'intestino, il sistema nervoso, le squame e la pigmentazione14. Le sonde possono essere generate per geni endogeni o marcatori fluorescenti in linee transgeniche.
È fondamentale che le larve rimangano intatte per osservare gli organi e i tessuti nel lor...

L'embrione di zebrafish è un modello importante per lo studio dello sviluppo dei tessuti grazie alle sue piccole dimensioni, alla trasparenza, agli strumenti disponibili e alla sopravvivenza senza nutrirsi fino a cinque giorni1,2. Ha notevolmente contribuito alla comprensione dello sviluppo renale e alla conservazione tra zebrafish e mammiferi3,4,5. Il rene svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi fluida, nel filtraggio del sangue e nell'escrezione dei rifiuti6. Il nefrone, l'unità funzionale del rene, comprende un filtro del sangue collegato a un lungo tubulo. Nel pesce zebra, due strutture renali si formano per tutta la sua vita. Il pronephros (il rene embrionale temporaneo) si forma prima durante lo sviluppo precoce. È costituito da due nefroni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore e diventa funzionale a circa 2 giorni dopo la fecondazione (dpf). L'utilità del pronephros sta nella sua semplicità, avendo solo due nefroni che sono per lo più lineari e facili da visualizzare (anche se il tubulo contorto prossimale inizia a ruotare a tre dpf)3. Ciò ha facilitato non solo gli studi sul suo sviluppo precoce dal mesoderma intermedio, ma anche il modello di segmentazione e la riparazione dei tubuli7,8.
L'utilità del pesce zebra diventa limitata dopo cinque dpf, quando il tuorlo è diminuito e le larve si affidano all'alimentazione nel sistema acquatico9. A circa 2 settimane di età, le larve subiscono metamorfosi in giovani, dove si formano nuovi tessuti e i vecchi tessuti vengono persi e/ o riorganizzati9. Questo è anche quando il mesonephros (il rene adulto permanente) forma10,11,12. Il primo nefrone adulto si forma vicino al sesto somite e si fonde con il tubulo distale precoce del pronephros. Ulteriori nefroni vengono aggiunti posteriormente a questa posizione inizialmente, ma anche verso l'anteriore in seguito. I nefroni primari in questa prima ondata si fondono con i tubuli del pronephros e condividono un lume comune per depositare i loro rifiuti. I nefroni secondari si formano nell'onda successiva e si fondono con i nefroni primari. Questo processo ripetitivo crea un mesonephros che è ramificato, in qualche modo simile al rene dei mammiferi. Presumibilmente, il pronephros alla fine perde la sua identità tubulare e diventa due importanti condotti di raccolta in cui tutti i nefroni drenano i loro rifiuti13.
Prima della formazione del primo nefrone adulto, le singole cellule progenitrici iniziano ad apparire in larve di ~ 4 mm (lunghezza totale) (~ 10 dpf). Queste cellule, che sono marcate nella linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP ), aderiscono al pronephros e sembrano migrare verso futuri siti di nefrogenesi. Le singole cellule si fondono in cluster, che si differenziano in nuovi nefroni12. Non è chiaro dove risiedano queste cellule o quali geni esprimano prima dell'inizio della mesonefrogenesi.
Comprendere lo sviluppo del mesonefro fornisce informazioni sul rene dei mammiferi in modi che il pronephros non può. Questi includono la formazione di aggregati nefrogenici da singole cellule progenitrici, l'integrazione funzionale di nuovi nefroni con quelli esistenti e la morfogenesi ramificata. Tuttavia, ci sono limitazioni allo studio dello sviluppo postembrionale. Le larve sono meno trasparenti a causa delle loro dimensioni maggiori e della pigmentazione. La linea temporale dello sviluppo non è sincrona tra i singoli animali ed è fortemente dipendente da fattori ambientali, come l'alimentazione e l'affollamento9,14. Sebbene esistano reagenti knockdown, sono meno efficaci nelle larve rispetto agli embrioni15. In questo protocollo, viene descritto un metodo di ibridazione in situ per determinare l'espressione genica durante lo sviluppo del mesonephros zebrafish. Diversi passaggi sono ottimizzati per aumentare la visualizzazione del mesonefro e la penetrazione e il lavaggio della sonda e dell'anticorpo. La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) viene utilizzata insieme a una sonda per EGFP per etichettare singole cellule progenitrici, aggregati nefrogenici e tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo metodo fornirà una comprensione più profonda dello sviluppo del mesonefro e una visione approfondita delle terapie rigenerative.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

Il pesce zebra forma due strutture renali nel corso della sua vita. Il pronephros (rene embrionale) si forma durante lo sviluppo embrionale e inizia a funzionare a 2 giorni dopo la fecondazione. Costituito da soli due nefroni, il pronephros funge da unico rene durante la vita larvale fino a quando non è richiesta una maggiore funzionalità renale a causa dell'aumento della massa corporea. Per far fronte a questa maggiore domanda, il mesonephros (rene adulto) inizia a formarsi durante la metamorfosi. I nuovi nefroni primari si fondono con il pronephros e formano lumen collegati. Quindi, i nefroni secondari si fondono con quelli primari (e così via) per creare una rete ramificata nel mesonefro. La stragrande maggioranza della ricerca si concentra sul pronephros a causa della facilità di utilizzo degli embrioni. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche per studiare larve più vecchie e più grandi e pesci giovani per comprendere meglio lo sviluppo del mesonephros. Qui, un protocollo di ibridazione in situ per l'analisi dell'espressione genica è ottimizzato per la penetrazione della sonda, il lavaggio di sonde e anticorpi e lo sbiancamento dei pigmenti per visualizzare meglio il mesonefro. La linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP) viene utilizzata per etichettare le cellule progenitrici e i tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo protocollo colma una lacuna nella ricerca sul mesonefro. È un modello cruciale per capire come i nuovi tessuti renali si formano e si integrano con i nefroni esistenti e fornire approfondimenti sulle terapie rigenerative.

Utilizzando la linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP), è stato dimostrato che questo protocollo di ibridazione in situ è efficace nell'etichettare le cellule progenitrici renali e varie strutture di nefroni durante lo sviluppo di mesonefro. Come previsto, anche il sistema nervoso centrale è etichettato in questa linea transgenica (non mostrata). Il nefrone mesonefrico iniziale si forma a circa 5,2 mm, dorsale al pronephros (Figura 2A), e il tubulo distale di questo nefrone è...

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In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Il pesce zebra è un modello importante per comprendere lo sviluppo del rene. Qui, un protocollo di ibridazione in situ è ottimizzato per rilevare l'espressione genica nelle larve di zebrafish e nei giovani durante lo sviluppo del mesonephros.

Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Questo protocollo è significativo perché consente la determinazione dell'espressione genica nelle larve di zebrafish più vecchie e nei giovani durante la metamorfosi. Il vantaggio di questa tecnica è che diversi passaggi sono stati ottimizzati per la penetrazione della sonda e la visualizzazione del rene. Per iniziare, prepara il pesce zebra adulto ad accoppiarsi aggiungendo un pesce maschio e una femmina in una vasca di accoppiamento nel tardo pomeriggio dopo il loro ultimo pasto.Il giorno dopo, raccogli gli embrioni in piastre di Petri contenenti E3 medium. Cinque giorni dopo la fecondazione, posizionare uno schermo da 400 micrometri in un serbatoio da 2,8 litri e riempirlo con 2 centimetri di acqua di sistema. Quindi aggiungere la larva da una piastra di Petri.Per fissare la larva, rimuovere un serbatoio di larva nel punto temporale desiderato, quindi, utilizzando una rete e trasferire la pipetta con la punta tagliata, trasferire la larva nella piastra di Petri. Quindi, aggiungere due millilitri di tricaina al 2% per immobilizzare la larva. Dopo l'immobilizzazione, sostituire la tricaina con 20 millilitri di soluzione fissante.Dopo 30 minuti, trasferire la larva in un tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione fissante fresca. Quindi, assicurandosi che il cappuccio sia stretto, scuotere lentamente il tubo a quattro gradi Celsius per due giorni. Il terzo giorno, sostituire la soluzione fissante con 20 millilitri di PBST, quindi trasferire la larva su una piastra di Petri.Per misurare la larva, posiziona la piastra di Petri sopra un righello piatto sotto un microscopio sezionante, quindi, usando un manipolatore di ciglia, sposta ogni larva sul righello per misurarne la lunghezza totale. Dopo aver misurato tutte le larve, combinare diverse larve di lunghezze simili su una fiala di vetro da 5,5 millilitri con PBST. Per la disidratazione, sostituire il PBST nel flaconcino di vetro con quattro millilitri di metanolo al 100%, quindi conservare il flaconcino a meno 20 gradi Celsius per due giorni.Per la reidratazione, sostituire il metanolo al 100% con quattro millilitri di una soluzione al 75% di metanolo e al 25% di PBST e scuotere il flaconcino per cinque minuti. Quindi, sostituire la soluzione di metanolo e PBST con quattro millilitri di PBST fresco e scuotere nuovamente il flaconcino per 10 minuti. Per la digestione della proteinasi K, sostituire il PBST con due millilitri di una soluzione di proteinasi K e scuotere il flaconcino a temperatura ambiente per 30 minuti.Successivamente, per lo sbiancamento, trasferire la larva in una piastra a sei pozzetti e sostituire il PBST con tre millilitri di soluzione sbiancante fresca. Dopo la completa scomparsa della pigmentazione lungo il mesonefro, trasferire nuovamente la larva in una fiala di vetro, sostituire la soluzione sbiancante con quattro millilitri di PBST e scuotere la fiala per 10 minuti. Per la pre-ibridazione, sostituire la soluzione di fissaggio con quattro millilitri di PBST e scuotere la fiala per 10 minuti, quindi sostituire il PBST con quattro millilitri di soluzione Hyb e roccia per 10 minuti.Dopo due ulteriori incubazioni nella soluzione Hyb, sostituire la soluzione con quattro millilitri della soluzione Hyb+. Diluire contemporaneamente la sonda di fluoresceina EGFP da uno a 100 in 500 microlitri di ibridazione più soluzione e incubare la fiala e la sonda a 70 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, per ibridare la sonda, sostituire la soluzione Hyb+nel flaconcino con la sonda preriscaldata e incubare a 70 gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, aggiungere 50 millilitri di SSCT preriscaldato 0,2 volte in un tubo da 50 millilitri. Quindi, inserire un filtro cellulare da 100 micrometri nella parte superiore del tubo, trasferire la larva dalla fiala di vetro nel filtro cellulare e assicurarsi che la larva sia immersa nel tampone, incubare la fiala a 70 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, trasferire il filtro cellulare in un nuovo tubo contenente preriscaldato 0,2 volte SSCT e incubare nuovamente a 70 gradi Celsius per due ore.Successivamente, per il blocco, trasferire la larva in una nuova fiala di vetro e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Quindi, sostituire la soluzione 0,2 volte SSCT con quattro millilitri di una soluzione 67%0,2 volte SSCT e 33% MABT e scuotere il flaconcino a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, sostituire la soluzione SSCTT MABT con quattro millilitri di MABT fresco e incubare il flaconcino su un bilanciere per 10 minuti.Quindi, sostituire il MABT con quattro millilitri di soluzione bloccante e incubare quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, sostituire la soluzione bloccante con una soluzione anticorpale e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni. Per il lavaggio degli anticorpi, trasferire la larva in un tubo da 50 millilitri, quindi aggiungere 40 millilitri di PBST2 e posare il tubo posato su un lato per l'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.Il giorno 12, dopo aver trasferito la lava in una piastra a sei pozzetti, sostituire il PBST2 con tre millilitri di tampone di colorazione. Dopo un'incubazione di cinque minuti su un bilanciere, sostituire il tampone di colorazione con tre millilitri della soluzione di colorazione. Quando viene raggiunta l'intensità di colorazione desiderata, sostituire la soluzione di colorazione con tre millilitri della soluzione di arresto e roccia per 30 minuti.Quindi, trasferire la larva in una nuova fiala di vetro, sostituire la soluzione di arresto con quattro millilitri di soluzione fissante fresca e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Per l'imaging, sostituire la soluzione di fissaggio con quattro millilitri di PBST fresco. Dopo un'incubazione di 10 minuti su un bilanciere, trasferire la larva in una piastra a sei pozzetti, quindi sostituire il PBST con quattro millilitri di PBST fresco e scuotere nuovamente la piastra per 10 minuti.Quindi, aggiungere tre millilitri di glicerolo al 50% in PBST e roccia per 10 minuti, quindi, utilizzando un microscopio di dissezione, visualizzare la larva direttamente nella piastra a sei pozzetti. Questo protocollo di ibridazione in situ etichetta efficacemente le cellule progenitrici renali e varie strutture di nefrone utilizzando lo sviluppo di mesonefro. Il nefrone mesonefrico iniziale si forma a circa 5,2 millimetri dorsale al pronephros.Gruppi di cellule progenitrici sono presenti durante lo sviluppo di mesonefros oltre alle singole cellule progenitrici. Nei giovani più grandi, la colorazione di fondo può verificarsi nei somiti. Nel complesso, questo metodo può essere utilizzato per studiare altri tessuti che si formano durante la metamorfosi, oltre agli organi adulti sezionati.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

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Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

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Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

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Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

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Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

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Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

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Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

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