Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

기금은 펜실베니아 과학 아카데미, 펜실베니아 생물학자의 연방, 펜실베니아 인디애나 대학 (대학원 연구 및 연구, 생물학부 및 신시아 수삭 학부 생물학 기금)에 의해 제공되었습니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 박사 닐 Hukriede에 의해 제공되었다 (피츠버그 대학).

제브라피시 애벌레와 청소년의 사용은 IUP IACUC (프로토콜 #02-1920, #08-1920)에 의해 승인됩니다. 솔루션 콘텐츠에 대한 세부 정보는 재료 표에 나열됩니다.
1. 애벌레 를 기르다
참고: 애벌레와 청소년을 관심 있는 단계로 올리는 데는 최대 21일 이상이 소요됩니다.
<ol><li>마지막 식사 후 늦은 오후에 짝짓기 탱크에 남성 1 마리와 암컷 물고기 1 마?...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

여기에 설명 된 시투 혼성화 방법은 메소네프로스 개발을 연구하는 것을 목표로 합니다. 그러나, 그것은 창 자, 신경계, 비늘 및 색소 침착14와 같은 변태 도중 그밖 조직 및 기관의 발달을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 프로브는 형질 전환선에서 내인성 유전자 또는 형광 마커를 위해 생성될 수 있다.
애벌레는 그들의 네이티브 맥락에서 장기?...

Zebrafish 배아는 최대 5 일 1,2에 대한 먹이없이 작은 크기, 투명성, 사용 가능한 도구 및 생존으로 인해 조직 발달을 연구하기위한 중요한 모델입니다. 그것은 크게 신장 발달의 이해와 제브라피시와 포유류 사이의 보존에 기여하고있다3,4,5. 신장은 유체 항상성을 유지하고 혈액을 필터링하고 폐기물을 배설하는 데 필수적인 역할을합니다. 신장의 기능성 단위인 네프론은 긴 튜블러에 연결된 혈액 필터를 포함한다. 제브라피시에서는 두 개의 신장 구조가 평생 동안 형성됩니다. 수경향 (임시 배아 신장) 초기 발달 도중 첫번째 양식. 전방 후방 축을 따라 실행되는 두 개의 네프론으로 구성되어 있으며 약 2일 후에 발효됩니다(dpf). 경향이 있는 소염의 유용성은 단순성에 있으며, 대부분 선형적이고 시각화하기 쉬운 두 개의 네프론을 가지고 있습니다 (근위 복잡한 튜블러는 3 dpf에서 코일되기 시작하지만). 이것은 중간 중음에서 초기 발달의 연구뿐만 아니라 세분화 패턴 및 tubule 수리7,8을 촉진했습니다.
노른자가 감소하고 유충이 수생 계통9에서 먹이에 의존할 때 제브라피시의 유용성은 5dpf 후에 제한됩니다. 약 2 주 에서, 애벌레는 새로운 조직 양식 및 오래된 조직이 분실되고/또는 개편되는 청소년으로 변태를 겪습니다9. 이것은 또한 메소네프로스 (영구 성인 신장)가 10,11,12를 형성 할 때입니다. 첫 번째 성인 nephron 여섯 번째 소밋 근처 형성, 그리고 경향이 있는 phros의 탈경 초기 tubule와 융합. 추가 nephrons는 처음에이 위치에 후방을 추가, 뿐만 아니라 나중에 전방으로. 이 첫 번째 파도의 기본 네프론은 경향이있는 사람의 튜블러에 융합하고 폐기물을 입금하기 위해 일반적인 루멘을 공유합니다. 보조 nephrons다음 파도에서 형성 하 고 기본 nephrons에 융합. 이 반복적인 과정은 포유류 신장에 다소 유사한 분기되는 메손프로스를 만듭니다. 아마도, 경향이 있는 것은 결국 그것의 관 정체성을 잃고 모든 nephrons그들의 낭비를 배수하는 두 개의 중요한 수집 덕트가 됩니다13.
첫 번째 성인 nephron의 형성 전에, 단 하나 전구 세포는 ~4 mm (총 길이) 애벌레 (~10 dpf)에서 나타나기 시작합니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선에 표시된 이 세포는, 경향이 있는 phros를 고착하고 신뢰의 미래 사이트로 이동하는 것처럼 보입니다. 단일 세포는 새로운 nephrons12로 분화하는 클러스터로 결합합니다. 이 세포가 어디에 상주하는지 또는 메소네프로 발생의 발병 전에 어떤 유전자를 표현하는지 불분명합니다.
메손프로스 개발을 이해하면 포유류 신장에 대한 통찰력을 수성세포증이 할 수 없는 방식으로 얻을 수 있습니다. 이들은 단 하나 전구 세포에서 nephrogenic 골체의 형성, 기존 세포와 새로운 nephrons의 기능적인 통합, 및 분진 형태를 포함합니다. 그러나, 태아 발달을 공부하는 한계가 있습니다. 유충은 그들의 더 큰 크기와 색소 침착을 가지고 있기 때문에 덜 투명합니다. 개발 타임 라인은 개별 동물 중 동기가 아니며 먹이 주기 및 혼잡9,14와 같은 환경 요인에 크게 의존합니다. 녹다운 시약이 존재하지만, 배아15에 비해 애벌레에서 덜 효과적입니다. 본 프로토콜에서, 제브라피시 메소네프로스 개발 중 유전자 발현을 결정하는 시투 혼성화 방법이 기재된다. 몇 가지 단계는 메손프로스의 시각화와 프로브 및 항체의 침투 및 세척을 증가시키기 위해 최적화된다. Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선은 EGFP가 단일 전구 세포, 신장 골체 및 초기 신장의 단면 튜블러를 라벨에 부착하기 위한 프로브와 함께 사용됩니다. 이 방법은 메소네프로스 발달에 대한 깊은 이해와 재생 치료에 대한 통찰력을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

제브라피쉬는 일생에 두 개의 신장 구조를 형성합니다. 배아 발달 중 경향이 있는 (배아 신장)은 형성되고 2 일 후에 수정 후에 작동하기 시작합니다. 단지 두 개의 신전으로 이루어짐에 따라, 수성 세포는 증가하는 바디 질량 때문에 더 많은 신장 기능이 요구될 때까지 애벌레 생활 도중 유일한 신장 역할을 합니다. 이 높은 수요에 대처하기 위하여는, 메소네프로스 (성인 신장)는 변태 도중 형성하기 시작합니다. 새로운 기본 nephrons 는 경향이 있는 알 로에 융합 하 고 연결 된 lumens 형성. 그런 다음 보조 nephrons는 메소네프로스(mesonephros)에 분기 네트워크를 만들기 위해 기본 nephrons에 융합됩니다. 연구의 대다수는 배아를 사용 의 용이성 때문에 경향이 있는 phros에 집중됩니다. 따라서 메소네프로스의 발달을 더 잘 이해하기 위해 더 오래되고 더 큰 애벌레와 청소년 물고기를 연구하는 기술을 개발할 필요가 있습니다. 여기서, 유전자 발현 분석을 위한 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스를 더 잘 시각화하기 위해 프로브 침투, 프로브 및 항체의 세척 및 표백에 최적화되어 있다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 전구 세포와 초기 신장의 말단 튜블러를 라벨에 사용됩니다. 이 프로토콜은 메손프로스 연구의 격차를 메손프로스(mesonephros) 연구의 격차를 메웁니다. 새로운 신장 조직이 어떻게 형성되고 기존 신장론과 통합되고 재생 치료에 대한 통찰력을 제공하는지 이해하는 중요한 모델입니다.

Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선을 이용하여, 이러한 좌식 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 신장 전구 세포 및 다양한 네프론 구조를 라벨링하는 데 효과적이라는 것을 입증하였다. 예상대로, 중추 신경계는 또한이 형질 전환선에 표시되어 있습니다 (표시되지 않음). 초기 메소네프릭 네프론은 약 5.2mm, 등쪽에서 발생하기 쉬운(그림 2A)을 형성하며, 이 네프론의 ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

제브라피쉬는 신장 발달을 이해하는 중요한 모델입니다. 여기서, 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레및 청소년의 유전자 발현을 검출하도록 최적화된다.

시투에서 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레와 청소년의 혼성화

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

이 프로토콜은 변형 도중 더 오래된 제브라피시 애벌레 및 청소년에 있는 유전자 발현의 결정을 허용하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 장점은 여러 단계가 신장의 프로브 침투 및 시각화에 최적화되었다는 것입니다. 우선, 마지막 식사 후 늦은 오후에 짝짓기 탱크에 남성 1 마리와 암컷 물고기 1 마리를 추가하여 짝짓기 성인 얼룩말 물고기를 설정합니다.다음 날, E3 배지를 포함하는 페트리 플레이트에서 배아를 수집합니다. 5일 후 수정, 2.8리터 탱크에 400 마이크로미터 스크린을 배치하고 2센티미터의 시스템 워터로 채웁니다. 그런 다음 페트리 접시 한 개에서 애벌레를 추가합니다.애벌레를 고치려면 원하는 시점에서 애벌레 탱크를 제거한 다음 팁이 잘린 그물 및 이송 파이펫을 사용하여 애벌레를 페트리 플레이트로 옮습니다. 다음으로, 애벌레를 고정시키기 위해 2%의 트리카인 2밀리리터를 추가합니다. 고정 후 트리카인을 20 밀리리터의 고정 용액으로 교체하십시오.30분 후, 애벌레를 신선한 고정 용액 25밀리리터가 들어있는 50밀리리터 튜브로 옮킨다. 그런 다음 캡이 단단하도록 2 일 동안 섭씨 4도에서 천천히 튜브를 흔들십시오. 셋째 날에는 고정 용액을 PBST20 밀리리터로 교체한 다음 유충을 페트리 플레이트로 옮킨다.애벌레를 측정하려면 페트리 플레이트를 해부 현미경 으로 평평한 눈금자 위에 놓고 속눈썹 조작기를 사용하여 각 애벌레를 통치자에게 이동하여 총 길이를 측정합니다. 모든 애벌레를 측정한 후 비슷한 길이의 여러 애벌레를 5.5 밀리리터 유리 바이알에 PBST와 결합합니다. 탈수의 경우 유리 유리병의 PBST를 100% 메탄올의 4밀리리터로 교체한 다음 2일 동안 영하 20도의 유리병을 보관하십시오.재수화를 위해 100% 메탄올을 75%의 메탄올과 25%PBST 용액의 4밀리리터로 대체하고 5분 동안 바이알을 흔들어 주세요. 그런 다음 메탄올 및 PBST 용액을 4 밀리리터의 신선한 PBST로 대체하고 10 분 동안 다시 유리병을 흔들어보냅니다. Proteinase K 소화의 경우 PBST를 Proteinase K 용액 2밀리리터로 교체하고 실온에서 바이알을 30분 동안 흔들어 보냅니다.다음으로, 표백을 위해 애벌레를 6웰 플레이트로 옮기고 PBST를 3밀리리터의 신선한 표백 용액으로 대체합니다. 메소네프로스를 따라 색소 침착이 완전히 사라진 후, 애벌레를 유리 유리 병으로 다시 옮기고, 표백 용액을 4밀리리터의 PBST로 대체하고, 10분 동안 유리병을 흔들어 넣습니다. 사전 혼성화를 위해 고정 솔루션을 4밀리리터의 PBST로 교체하고 10분 동안 유리병을 흔들어 10분 동안 PBST를 4밀리리터의 Hyb-solution및 rock로 교체하십시오.Hyb 솔루션에서 두 개의 추가 인큐베이션 을 추가한 후 솔루션을 Hyb+솔루션의 4밀리리터로 교체합니다. 동시에 EGFP 형광 프로브를 하이브리드화 플러스 용액 500 마이크로리터에서 1~100마이크로리터를 희석하고, 밤새 70°C에서 바이알과 프로브를 배양한다. 다음 날, 프로브를 혼성화하기 위해 유리병의 Hyb+용액을 예열된 프로브로 대체하고 하룻밤 사이에 섭씨 70도에서 배양합니다.다음 날, 50 밀리리터의 예열된 0.2배 SSCT를 50밀리리터 튜브에 넣습니다. 이어서, 100마이크로미터 세포 스트레이너를 튜브 의 상단에 삽입하고, 유리 유리병에서 유충을 세포 스트레이너로 옮기고, 애벌레가 완충제에 침수되도록 하고, 2시간 동안 70°C에서 바이알을 배양한다. 인큐베이션 후, 세포 스트레이너를 SSCT 0.2배 예열된 새로운 튜브로 옮기고 2시간 동안 섭씨 70도에서 다시 배양합니다.다음으로, 차단을 위해 애벌레를 새로운 유리 유리 병으로 옮기고 실온으로 냉각할 수 있도록 합니다. 그런 다음 0.2배 SSCT 용액을 SSCT 67.2배, MABT 용액 33%의 4밀리리터로 교체하고 실온에서 10분 동안 유리병을 흔들어 보냅니다. 다음으로 SSCTT MABT 솔루션을 4밀리리터의 신선한 MABT로 대체하고 로커에 바이알을 10분 동안 배양합니다.그런 다음 MABT를 블로킹 솔루션 4밀리리터로 교체하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도를 배양합니다. 다음 날, 차단 용액을 항체 용액으로 대체하고 2 일 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오. 항체 세척의 경우 애벌레를 50 밀리리터 튜브로 옮은 다음 PBST2의 40 밀리리터를 추가하고 튜브를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠식할 수 있도록 옆으로 눕힙습니다.12일, 용암을 6웰 플레이트로 옮김한 후 PBST2를 스테인딩 버퍼 3밀리리터로 교체합니다. 로커에서 5분 간 인큐베이션한 후 염색 버퍼를 스테닝 용액의 3밀리리터로 교체합니다. 원하는 염색 강도에 도달하면 염색 용액을 정지 용액의 3밀리리터로 교체하고 30분 동안 바위를 흔들어 보시기 를 기다립니다.그런 다음, 애벌레를 새로운 유리 유리 병으로 옮기고, 정지 용액을 4밀리리터의 신선한 고정 용액으로 대체하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 이미징의 경우 고정 솔루션을 4밀리리터의 신선한 PBST로 대체하십시오. 로커에서 10분 간 인큐베이션을 한 후 애벌레를 6웰 플레이트로 옮은 다음 PBST를 4밀리리터의 신선한 PBST로 교체하고 10분 동안 다시 접시를 흔들어 보입니다.다음으로, PBST에 50%의 글리세롤 3밀리리터를 넣고 10분 동안 바위를 흔들고, 해부 현미경을 사용하여 6웰 플레이트에서 직접 애벌레를 이미지시합니다. 이 시상 혼성화 프로토콜에서 효과적으로 메소네프로스 개발을 사용하여 신장 전구 세포 및 다양한 nephron 구조를 라벨. 초기 메소네프릭 네프론은 약 5.2밀리미터 의 구름소에 형성됩니다.전구 세포의 클러스터는 단일 전구 세포 이외에 메소네프로스 발달 중에 존재한다. 더 큰 청소년에서는, 배경 얼룩은 소미에서 생길 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 해부 성인 장기 뿐만 아니라 변형 중에 형성되는 다른 조직을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

연구

발생학

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...