Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

Finansieringen ble gitt av Pennsylvania Academy of Science, og Commonwealth of Pennsylvania Biologists, og Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, og Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) ble levert av Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).

Bruken av sebrafisk larver og juveniler er godkjent av IUP IACUC (protokoll #02-1920, #08-1920). Detaljer om løsningsinnholdet er oppført i materialfortegnelser.
1. Heve larver
MERK: Det vil ta opptil 21 dager eller mer å heve larver og ungdommer til interessestadiet.
<ol><li>Sett opp voksen sebrafisk for å mate ved å legge til 1 mannlig og 1 kvinnelig fisk i en parringstank sent på ettermiddagen etter deres siste måltid. MERK: Ikke alle...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

In situ hybridiseringsmetoden beskrevet her er rettet mot å studere mesonephros utvikling. Det kan imidlertid brukes til å studere utviklingen av andre vev og organer under metamorfose, som tarm, nervesystem, skalaer og pigmentering14. Sonder kan genereres for endogene gener eller fluorescerende markører i transgene linjer.
Det er viktig for larvene å forbli intakte for å observere organer og vev i sin opprinnelige sammenheng. For å beholde vevsintegritet...

Sebrafiskembryoet er en viktig modell for å studere vevsutvikling på grunn av sin lille størrelse, gjennomsiktighet, tilgjengelige verktøy og overlevelse uten fôring i opptil fem dager1,2. Det har i stor grad bidratt til forståelsen av nyreutvikling og bevaring mellom sebrafisk og pattedyr3,4,5. Nyrene spiller en viktig rolle i å opprettholde væske homeostase, filtrere blodet og skille ut avfall6. Nephron, den funksjonelle enheten av nyrene, består av et blodfilter koblet til en lang tubule. I sebrafisk dannes to nyrestrukturer gjennom hele livet. Pronephros (den midlertidige embryonale nyren) dannes først under tidlig utvikling. Den består av to nephrons som løper langs den fremre bakre aksen og blir funksjonell på rundt 2 dager etter befruktning (dpf). Nytten av pronephros ligger i sin enkelhet, og har bare to nephrons som for det meste er lineære og enkle å visualisere (selv om den proksimale konvoluterte tubule begynner å spole på tre dpf)3. Dette har lagt til rette for ikke bare studier av den tidlige utviklingen fra mellomliggende mesoderm, men også segmenteringsmønsteret og tubule reparasjon7,8.
Nytten av sebrafisk blir begrenset etter fem dpf, når eggeplommen er redusert og larvene er avhengige av fôring i vannsystemet9. Rundt 2 uker gammel gjennomgår larvene metamorfose til ungdommer, hvor nye vev dannes og gamle vev går tapt og / eller omorganiseres9. Dette er også når mesonephros (den permanente voksne nyre) danner10,11,12. Den første voksne nephron dannes nær den sjette somite, og smelter sammen med den distale tidlige tubule av pronephros. Ytterligere nephrons legges til bakre til denne posisjonen i utgangspunktet, men også mot fremre senere. De primære nephrons i denne første bølgesikringen til tubuliene til pronephros og deler en felles lumen for å deponere avfallet. Sekundære nephrons dannes i neste bølge og smelter til primære nephrons. Denne gjentakende prosessen skaper en mesonephros som er forgrenet, noe som ligner pattedyrets nyre. Antagelig mister de utsattephros til slutt sin tubule identitet og blir to store samlekanaler der alle nephrons drenerer avfallet13.
Før dannelsen av den første voksne nephron begynner enkle stamceller å vises i ~ 4 mm (total lengde) larver (~ 10 dpf). Disse cellene, som er merket i Tg (lhx1a-EGFP) transgene linjen, holder seg til pronephros og ser ut til å migrere til fremtidige steder av nefogenese. Enkeltcellene samles i klynger, som skiller seg ut i nye nephrons12. Det er uklart hvor disse cellene ligger eller hvilke gener de uttrykker før mesonephrogenesis.
Å forstå mesonephros utvikling gir innsikt i pattedyr nyre på måter som pronephros ikke kan. Disse inkluderer dannelsen av nephrogenic aggregater fra enkelt forfedre celler, funksjonell integrasjon av nye nephrons med eksisterende, og forgrening morphogenesis. Det er imidlertid begrensninger for å studere postembryonisk utvikling. Larvene er mindre gjennomsiktige på grunn av deres større størrelse og har pigmentering. Utviklingstidslinjen er ikke synkron blant enkeltdyr og er svært avhengig av miljøfaktorer som fôring og trengsel9,14. Selv om knockdown reagenser eksisterer, er de mindre effektive i larver sammenlignet med embryoer15. I denne protokollen beskrives en in situ hybridiseringsmetode for å bestemme genuttrykk under sebrafisk mesonephros utvikling. Flere trinn er optimalisert for å øke visualiseringen av mesonephros og penetrasjon og vasking av sonden og antistoffet. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes sammen med en sonde for EGFP for å merke enkle stamceller, nefrogene aggregater og de distale tubuliene av nascent nephrons. Denne metoden vil gi en dypere forståelse av mesonephros utvikling og innsikt i regenerative terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

Sebrafisken danner to nyrestrukturer i sin levetid. Pronephros (embryonal nyre) dannes under embryonal utvikling og begynner å fungere ved 2 dager etter befruktning. Bestående av bare to nephrons, fungerer pronephros som den eneste nyre under larvallivet til mer nyrefunksjon er nødvendig på grunn av den økende kroppsmassen. For å takle denne høyere etterspørselen begynner mesonephros (voksen nyre) å danne seg under metamorfose. Den nye primære nephrons sikringen til pronephros og danner tilkoblede lumen. Deretter smelter sekundære nephrons til primære (og så videre) for å skape et forgreningsnettverk i mesonephros. Det store flertallet av forskningen er fokusert på pronephros på grunn av den enkle å bruke embryoer. Dermed er det behov for å utvikle teknikker for å studere eldre og større larver og juvenil fisk for bedre å forstå mesonephros utvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll for genuttrykksanalyse optimalisert for sondeinntrengning, vasking av sonder og antistoffer, og bleking av pigmenter for bedre å visualisere mesonephros. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes til å merke stamceller og distale tubuli av nascent nephrons. Denne protokollen fyller et gap i mesonephros forskning. Det er en avgjørende modell for å forstå hvordan nye nyrevev dannes og integreres med eksisterende nefroner og gir innsikt i regenerative terapier.

Ved hjelp av den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) ble det demonstrert at denne in situ hybridiseringsprotokollen er effektiv i merking av nyreforfederceller og ulike nephronstrukturer under mesonephros utvikling. Som forventet er sentralnervesystemet også merket i denne transgene linjen (ikke vist). Den første mesonephric nephron dannes på ca 5,2 mm, dorsal til pronephros (figur 2A), og distal tubule av denne nephron er merket av EGFP10,12</su...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Sebrafisken er en viktig modell for å forstå nyreutvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll optimalisert for å oppdage genuttrykk i sebrafisk larver og ungdommer under mesonephros utvikling.

In situ Hybridisering i sebrafisk larver og ungdommer under Mesonephros Utvikling

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Denne protokollen er betydelig fordi den tillater bestemmelse av genuttrykk hos eldre sebrafisk larver og ungdommer under metamorfose. Fordelen med denne teknikken er at flere trinn er optimalisert for sondeinntrengning og visualisering av nyrene. Til å begynne med, sett opp voksen sebrafisk for å mate ved å legge til en mannlig og en kvinnelig fisk i en parringstank sent på ettermiddagen etter deres siste måltid.Neste dag samler du embryoene i Petri-plater som inneholder E3-medium. Fem dager etter befruktning, plasser en 400-mikrometer skjerm i en 2,8-liters tank og fyll den med 2 centimeter systemvann. Tilsett deretter larven fra en Petri-tallerken.For å fikse larven, fjern en larvetank på ønsket tidspunkt, bruk deretter et nett og overfør pipette med spissen avskåret, overfør larven til Petri-platen. Deretter legger du til to milliliter 2% trikain for å immobilisere larven. Etter immobilisering, erstatt trikainen med 20 milliliter festeløsning.Etter 30 minutter, overfør larven til et 50 milliliter rør som inneholder 25 milliliter fersk festeløsning. Deretter må du sørge for at hetten er stram, sakte rocke røret ved fire grader Celsius i to dager. På dag tre erstatter du festeløsningen med 20 milliliter PBST og overfører deretter larven til en Petri-plate.For å måle larven, plasser Petri-platen på toppen av en flat linjal under et dissekerende mikroskop, og bruk deretter en øyenvippemanipulator, flytt hver larve på linjalen for å måle den totale lengden. Etter å ha målt alle larver, kombiner flere larver av lignende lengder på ett 5,5 milliliter hetteglass med PBST. For dehydrering, erstatt PBST i hetteglasset med fire milliliter 100% metanol, og lagre deretter hetteglasset på minus 20 grader Celsius i to dager.For rehydrering, erstatt 100% metanol med fire milliliter av en 75% metanol og 25% PBST-løsning og rock hetteglasset i fem minutter. Bytt deretter ut metanol- og PBST-oppløsningen med fire milliliter fersk PBST og rock hetteglasset igjen i 10 minutter. For Proteinase K-fordøyelsen, erstatt PBST med to milliliter proteinase K-løsning og gyng hetteglasset ved romtemperatur i 30 minutter.Deretter, for bleking, overfør larven til en seksbrønnsplate og erstatt PBST med tre milliliter fersk blekingsløsning. Etter fullstendig forsvinning av pigmentering langs mesonephros, overfør larven tilbake til et hetteglass med glass, erstatt blekingsløsningen med fire milliliter PBST, og rock hetteglasset i 10 minutter. For pre-hybridisering, erstatt festeløsningen med fire milliliter PBST og rock hetteglasset i 10 minutter, og erstatt deretter PBST med fire milliliter Hyb-løsning og stein i 10 minutter.Etter to ekstra inkubasjoner i Hyb-løsningen, erstatt løsningen med fire milliliter hyb +løsning. Fortynn samtidig EGFP fluorescein-sonden en til 100 i 500 mikroliter hybridisering pluss løsning, og inkuber hetteglasset og sonden ved 70 grader Celsius over natten. Neste dag, for å hybridisere sonden, erstatt Hyb + -løsningen i hetteglasset med den forvarmede sonden og inkuber ved 70 grader Celsius over natten.Neste dag legger du til 50 milliliter forvarmet 0,2 ganger SSCT i et 50 milliliterrør. Sett deretter en 100-mikrometer cellesil inn i toppen av røret, overfør larven fra hetteglasset i cellesilen, og sørg for at larven er nedsenket i bufferen, inkuber hetteglasset ved 70 grader Celsius i to timer. Etter inkubasjonen, overfør cellesilen til et nytt rør som inneholder forvarmet 0,2 ganger SSCT, og inkuber igjen ved 70 grader Celsius i to timer.Deretter, for blokkering, overfør larven til et nytt hetteglass og la det avkjøles til romtemperatur. Bytt deretter ut 0,2 ganger SSCT-løsningen med fire milliliter av en 67%0,2 ganger SSCT og 33% MABT-løsning og rock hetteglasset ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter erstatter du SSCTT MABT-oppløsningen med fire milliliter fersk MABT, og inkuberer hetteglasset på en rocker i 10 minutter.Bytt deretter MABT med fire milliliter blokkeringsløsning og inkuber fire grader Celsius over natten. Neste dag erstatter du blokkeringsløsningen med en antistoffløsning og inkuberer ved fire grader Celsius i to dager. For antistoffvask, overfør larven til et 50 milliliter rør, legg deretter til 40 milliliter PBST2, og legg røret som ligger på siden for overnatting inkubasjon ved fire grader Celsius.På dag 12, etter å ha overført lavaen til en seksbrønnsplate, erstatt PBST2 med tre milliliter fargebuffer. Etter en fem minutters inkubasjon på en rocker, erstatt fargingsbufferen med tre milliliter av fargeløsningen. Når ønsket fargingsintensitet er nådd, erstatt fargingsløsningen med tre milliliter stoppløsning og stein i 30 minutter.Overfør deretter larven til et nytt hetteglass av glass, erstatt stoppløsningen med fire milliliter fersk festeløsning, og inkuber i en time ved romtemperatur. For avbildning, erstatt festeløsningen med fire milliliter fersk PBST. Etter en 10 minutters inkubasjon på en rocker, overfør larven til en seksbrønnsplate, erstatt deretter PBST med fire milliliter fersk PBST og rock platen igjen i 10 minutter.Deretter legger du til tre milliliter 50% glyserol i PBST og rocker i 10 minutter, deretter, ved hjelp av et dissekerende mikroskop, bilde larven direkte i seksbrønnplaten. Denne in situ hybridiseringsprotokollen merker effektivt nyreforfederceller og ulike nephronstrukturer ved hjelp av mesonephros utvikling. Den første mesonephric nephron dannes på ca 5,2 millimeter dorsal til pronephros.Klynger av stamceller er til stede under mesonephros utvikling i tillegg til enkelt forfedre celler. I større ungdommer kan bakgrunnsfarging forekomme i somittene. Totalt sett kan denne metoden brukes til å studere andre vev som dannes under metamorfose, i tillegg til dissekerte voksne organer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forstå Tidlig organogenesis hjelp av en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protocol i<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i sebrafisk gjennom kombinert protokollen hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount i Situ hybridisering for Astyanax embryo

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping og kvantifisering av In Situ Hybridisering Farging i Sebrafisk

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Immunohistokjemi i sebrafiskembryoer og larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende kalsiumavbildning og påfølgende in Situ hybridisering for nevronal forløper karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...