Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
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O financiamento foi fornecido pela Academia de Ciências da Pensilvânia, e pela Comunidade de Biólogos da Pensilvânia, e pela Universidade de Indiana da Pensilvânia (Escola de Pós-Graduação e Pesquisa, Departamento de Biologia e Pelo Fundo de Biologia de Graduação Cynthia Sushak para Excelência). A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) foi fornecida pelo Dr. Neil Hukriede (Universidade de Pittsburgh).

O uso de larvas de zebrafish e juvenis é aprovado pelo IUP IACUC (protocolo nº 02-1920, #08-1920). Os detalhes do conteúdo da solução estão listados na Tabela de Materiais.
1. Criar larvas
NOTA: Levará até 21 dias ou mais para elevar larvas e juvenis ao estágio de interesse.
<ol><li>Configure zebrafish adulto para acasalar adicionando 1 peixe macho e 1 fêmea em um tanque de acasalamento no final da tarde após sua última refeição. ...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. 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A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

O método de hibridização in situ descrito aqui visa estudar o desenvolvimento de mesonepros. No entanto, pode ser aplicado para estudar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos durante a metamorfose, como intestino, sistema nervoso, escamas e pigmentação14. Sondas podem ser geradas para genes endógenos ou marcadores fluorescentes em linhas transgênicas.
É fundamental que as larvas permaneçam intactas para observar os órgãos e tecidos em seu con...

O embrião de zebrafish é um modelo importante para estudar o desenvolvimento de tecidos devido ao seu pequeno tamanho, transparência, ferramentas disponíveis e sobrevivência sem se alimentar por até cinco dias1,2. Contribuiu muito para a compreensão do desenvolvimento renal e da conservação entre zebrafish e mamíferos3,4,5. O rim desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase fluida, filtrando o sangue e excretando resíduos6. O nefron, a unidade funcional do rim, compreende um filtro sanguíneo conectado a um túbulo longo. Em zebrafish, duas estruturas renais se formam ao longo de sua vida. Os pronephros (o rim embrionário temporário) formam-se primeiro durante o desenvolvimento precoce. Consiste em dois nefrões correndo ao longo do eixo anterior-posterior e torna-se funcional em cerca de 2 dias após a fertilização (dpf). A utilidade dos tubérculos está em sua simplicidade, tendo apenas dois nefrões que são em sua maioria lineares e fáceis de visualizar (embora o túbulo proximal convolutado comece a enrolar em três dpf)3. Isso facilitou não apenas estudos de seu desenvolvimento precoce a partir do mesoderm intermediário, mas também do padrão de segmentação e reparo de túbulos7,8.
A utilidade do zebrafish torna-se limitada após cinco dpf, quando a gema é diminuída e as larvas dependem da alimentação no sistema aquático9. Com cerca de 2 semanas de idade, as larvas passam por metamorfose em juvenis, onde novos tecidos se formam e tecidos antigos são perdidos e/ou reorganizados9. É também quando os mesonephros (o rim adulto permanente) formam 10,11,12. O primeiro nefron adulto forma-se perto do sexto somite, e funde-se com o túbulo distal precoce dos tubérculos. Nephrons adicionais são adicionados posteriormente a esta posição inicialmente, mas também para o anterior mais tarde. Os néfirons primários nesta primeira onda se fundem aos túbulos dos tubérculos e compartilham um lúmen comum para depositar seus resíduos. Nefrões secundários formam-se na próxima onda e fundem-se aos nefrões primários. Este processo reiterativo cria um mesonepros que é ramificado, um pouco semelhante ao rim mamífero. Presumivelmente, os tubérculos eventualmente perdem sua identidade túbula e se tornam dois grandes dutos coletores onde todos os nefrões drenam seus resíduos13.
Antes da formação do primeiro nefron adulto, células progenitoras únicas começam a aparecer em larvas de ~4 mm (comprimento total) (~10 dpf). Essas células, que estão marcadas na linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP), aderem aosphros propensos e parecem migrar para futuros locais de nefrogenese. As células únicas se fundem em aglomerados, que se diferenciam em novos nefrões12. Não está claro onde essas células residem ou quais genes elas expressam antes do início da mesonofrogenese.
Compreender o desenvolvimento de mesonephros fornece insights sobre o rim mamífero de maneiras que os pronephros não podem. Estes incluem a formação de agregados nefrogenicos a partir de células progenitoras únicas, integração funcional de novos nefrões com os existentes, e morfogênese ramificada. No entanto, há limitações para estudar o desenvolvimento pós-cisônico. As larvas são menos transparentes devido ao seu tamanho maior e ter pigmentação. O cronograma de desenvolvimento não é síncronto entre os animais individuais e é altamente dependente de fatores ambientais, como alimentação e aglomeração de 9,14. Embora os reagentes de knockdown existam, eles são menos eficazes em larvas em comparação com embriões15. Neste protocolo, é descrito um método de hibridização in situ para determinar a expressão genética durante o desenvolvimento de mesonepros de zebrafish. Várias etapas são otimizadas para aumentar a visualização dos mesonephros e penetração e lavagem da sonda e anticorpo. A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) é usada juntamente com uma sonda para EGFP para rotular células progenitoras únicas, agregados nefrogenicos e os túbulos distais de nefrrons nascentes. Este método fornecerá uma compreensão mais profunda do desenvolvimento de mesonepros e uma visão sobre terapias regenerativas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

O zebrafish forma duas estruturas renais em sua vida. Os pronephros (rim embrionário) formam-se durante o desenvolvimento embrionário e começam a funcionar a 2 dias após a fertilização. Composto por apenas dois nefrões, os glifos servem como rim único durante a vida larval até que mais função renal seja necessária devido ao aumento da massa corporal. Para lidar com essa maior demanda, os mesonepros (rim adulto) começam a se formar durante a metamorfose. Os novos nefrons primários se fundem aos glifos e formam lúmens conectados. Em seguida, nefrões secundários se fundem aos primários (e assim por diante) para criar uma rede de ramificação nos mesonephros. A grande maioria das pesquisas está focada nos dispositivos proviros devido à facilidade de uso de embriões. Assim, é necessário desenvolver técnicas para estudar larvas mais antigas e maiores e peixes juvenis para entender melhor o desenvolvimento de mesonepros. Aqui, um protocolo de hibridização in situ para análise de expressão genética é otimizado para penetração de sondas, lavagem de sondas e anticorpos, e branqueamento de pigmentos para melhor visualizar os mesonephros. A linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP) é usada para rotular células progenitoras e os túbulos distais de nefrrons nascentes. Este protocolo preenche uma lacuna na pesquisa de mesonepros. É um modelo crucial para entender como os novos tecidos renais se formam e se integram com os nefrões existentes e fornecem insights sobre terapias regenerativas.

Utilizando a linha transgênica Tg(lhx1a-EGFP), foi demonstrado que este protocolo de hibridização in situ é eficaz na rotulagem de células progenitoras renais e várias estruturas de nefrão durante o desenvolvimento de mesonephros. Como esperado, o sistema nervoso central também é rotulado nesta linha transgênica (não mostrada). O nefron mesoneférico inicial se forma em aproximadamente 5,2 mm, dorsal aos tenebrosos (Figura 2A), e o túbulo distal deste nefron é ...

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In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

O zebrafish é um modelo importante para entender o desenvolvimento renal. Aqui, um protocolo de hibridização in situ é otimizado para detectar expressão genética em larvas de zebrafish e juvenis durante o desenvolvimento de mesonepros.

In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Este protocolo é significativo porque permite a determinação da expressão genética em larvas de zebrafish mais antigas e juvenis durante a metamorfose. A vantagem dessa técnica é que várias etapas foram otimizadas para penetração da sonda e visualização do rim. Para começar, configure zebrafish adulto para acasalar adicionando um macho e uma fêmea peixe em um tanque de acasalamento no final da tarde após sua última refeição.No dia seguinte, colete os embriões em placas de Petri contendo meio E3. Cinco dias após a fertilização, coloque uma tela de 400 micrômetros em um tanque de 2,8 litros e encha-a com 2 centímetros de água do sistema. Em seguida, adicione a larva de uma placa de Petri.Para consertar a larva, remova um tanque de larva no ponto de tempo desejado, em seguida, usando uma rede e transfira a pipeta com sua ponta cortada, transfira a larva para a placa de Petri. Em seguida, adicione dois mililitros de 2% de tricaine para imobilizar a larva. Após a imobilização, substitua a tricaine por 20 mililitros de solução de fixação.Após 30 minutos, transfira a larva para um tubo de 50 mililitros contendo 25 mililitros de solução fresca. Em seguida, garantindo que a tampa esteja apertada, balance lentamente o tubo a quatro graus Celsius por dois dias. No terceiro dia, substitua a solução de fixação por 20 mililitros de PBST e transfira a larva para uma placa de Petri.Para medir a larva, coloque a placa de Petri em cima de uma régua plana sob um microscópio dissecando, em seguida, usando um manipulador de cílios, mova cada larva para a régua para medir seu comprimento total. Depois de medir todas as larvas, combine várias larvas de comprimentos semelhantes em um frasco de vidro de 5,5 mililitros com PBST. Para desidratação, substitua o PBST no frasco de vidro por quatro mililitros de 100% de metanol e, em seguida, armazene o frasco a menos 20 graus Celsius por dois dias.Para reidratação, substitua o metanol 100% por quatro mililitros de uma solução de 75% de metanol e 25% PBST e arrase o frasco por cinco minutos. Em seguida, substitua a solução de metanol e PBST por quatro mililitros de PBST fresco e balance o frasco novamente por 10 minutos. Para digestão Proteinase K, substitua o PBST por dois mililitros de uma solução Proteinase K e balance o frasco à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, para branqueamento, transfira a larva para uma placa de seis poços e substitua o PBST por três mililitros de solução de branqueamento fresco. Após o desaparecimento completo da pigmentação ao longo dos mesonephros, transfira a larva de volta para um frasco de vidro, substitua a solução de branqueamento por quatro mililitros de PBST, e balance o frasco por 10 minutos. Para pré-hibridização, substitua a solução de fixação por quatro mililitros de PBST e balance o frasco por 10 minutos, então, substitua o PBST por quatro mililitros de solução Hyb e a rocha por 10 minutos.Após duas incubações adicionais na solução Hyb, substitua a solução por quatro mililitros da solução Hyb+. Diluir simultaneamente a sonda fluoresceína EGFP de um a 100 em 500 microliters de hibridização mais solução, e incubar o frasco e a sonda a 70 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, para hibridizar a sonda, substitua a solução Hyb+no frasco pela sonda pré-aquecido e incubar a 70 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, adicione 50 mililitros de 0,2 vezes SSCT pré-aquecidos em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, insira um coador de células de 100 micrômetros na parte superior do tubo, transfira a larva do frasco de vidro para o coador celular e, garantindo que a larva esteja submersa no tampão, incubar o frasco a 70 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, transfira o coador de células para um novo tubo contendo 0,2 vezes SSCT pré-aquecido, e incuba novamente a 70 graus Celsius por duas horas.Em seguida, para o bloqueio, transfira a larva para um novo frasco de vidro e deixe esfriar à temperatura ambiente. Em seguida, substitua a solução SSCT 0,2 vezes por quatro mililitros de uma solução SSCT de 67%0,2 vezes e 33% MABT e balance o frasco à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, substitua a solução SSCTT MABT por quatro mililitros de MABT fresco, e incuba o frasco em um roqueiro por 10 minutos.Em seguida, substitua o MABT por quatro mililitros de solução de bloqueio e incuba quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua a solução de bloqueio por uma solução de anticorpos e incubar a quatro graus Celsius por dois dias. Para a lavagem de anticorpos, transfira a larva para um tubo de 50 mililitros, depois adicione 40 mililitros de PBST2, e coloque o tubo deitado de lado para a incubação durante a noite a quatro graus Celsius.No dia 12, após transferir a lava para uma placa de seis poços, substitua o PBST2 por três mililitros de tampão de coloração. Após uma incubação de cinco minutos em um roqueiro, substitua o tampão de coloração por três mililitros da solução de coloração. Quando a intensidade de coloração desejada for atingida, substitua a solução de coloração por três mililitros da solução de parada e a rocha por 30 minutos.Em seguida, transfira a larva para um novo frasco de vidro, substitua a solução de parada por quatro mililitros de solução de fixação fresca e incuba por uma hora em temperatura ambiente. Para imagem, substitua a solução de fixação por quatro mililitros de PBST fresco. Após uma incubação de 10 minutos em um roqueiro, transfira a larva para uma placa de seis poços, em seguida, substitua o PBST por quatro mililitros de PBST fresco e balance a placa novamente por 10 minutos.Em seguida, adicione três mililitros de 50% de glicerol no PBST e rocha por 10 minutos, em seguida, usando um microscópio dissecando, imagem a larva diretamente na placa de seis poços. Este protocolo de hibridização in situ efetivamente rotula células progenitoras renais e várias estruturas de nefrão usando o desenvolvimento de mesonepros. O nefron mesoneférico inicial se forma a aproximadamente 5,2 milímetros dorsais aos pronephros.Aglomerados de células progenitoras estão presentes durante o desenvolvimento de mesonepros, além de células progenitoras únicas. Em jovens maiores, a coloração de fundo pode ocorrer nas somitas. No geral, este método pode ser usado para estudar outros tecidos que se formam durante a metamorfose, além de órgãos adultos dissecados.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Biologia do Desenvolvimento

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...