Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

Финансирование было предоставлено Академией наук Пенсильвании и Содружеством биологов Пенсильвании, а также Университетом Индианы в Пенсильвании (Школа аспирантуры и исследований, Департамент биологии и Фонд биологии синтии Сушак для передового опыта). Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) была предоставлена доктором Нилом Хукриде (Университет Питтсбурга).

Использование личинок рыбок данио и молоди одобрено IUP IACUC (протокол No02-1920, No08-1920). Сведения о содержимом решения приведены в Таблице материалов.
1. Разведение личинок
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поднятия личинок и молоди до стадии интереса потребуется до 21 дня и ...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

Описанный здесь метод гибридизации in situ направлен на изучение развития мезонефроса. Однако его можно применять для изучения развития других тканей и органов во время метаморфоз, таких как кишечник, нервная система, чешуя и пигментация14. Зонды могут быть сгенерированы...

Эмбрион рыбки данио является важной моделью для изучения развития тканей из-за его небольшого размера, прозрачности, доступных инструментов и выживаемости без кормления в течение пяти дней1,2. Это в значительной степени способствовало пониманию развития почек и сохранения между рыбками данио и млекопитающими3,4,5. Почки играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, фильтрации крови и выведении отходов6. Нефрон, функциональная единица почки, содержит фильтр крови, соединенный с длинным канальцем. У рыбок данио две почечные структуры формируются на протяжении всей ее жизни. Пронефрос (временная эмбриональная почка) образуется сначала во время раннего развития. Он состоит из двух нефронов, проходящих вдоль передне-задней оси и становится функциональным примерно через 2 дня после оплодотворения (dpf). Полезность пронефроса заключается в его простоте, имея всего два нефрона, которые в основном линейны и легко визуализируются (хотя проксимальный извитый каналец начинает сворачиваться при трех dpf)3. Это облегчило не только изучение его раннего развития из промежуточной мезодермы, но и структуру сегментации и ремонт канальцев7,8.
Полезность рыбок данио становится ограниченной после пяти dpf, когда желток уменьшается и личинки полагаются на питание в водной системе9. Примерно в возрасте 2 недель личинки претерпевают метаморфозы в молодых особей, где образуются новые ткани, а старые ткани теряются и/или реорганизуются9. Это также когда образуется мезонефрос (постоянная взрослая почка) 10,11,12. Первый взрослый нефрон образуется около шестого сомита и сливается с дистальным ранним канальцем пронефроса. Дополнительные нефроны добавляются сзади к этому положению изначально, но также и к передней части позже. Первичные нефроны в этой первой волне сливаются с канальцами пронефроса и имеют общий просвет для осаждения своих отходов. Вторичные нефроны образуются в следующей волне и сливаются с первичными нефронами. Этот повторяющийся процесс создает мезонефрос, который разветвлен, несколько сродни почке млекопитающих. Предположительно, пронефрос в конечном итоге теряет свою трубчатую идентичность и становится двумя основными собирательными протоками, где все нефроны сливают свои отходы13.
До образования первого взрослого нефрона одиночные клетки-предшественники начинают появляться в ~4 мм (общая длина) личинок (~10 dpf). Эти клетки, которые отмечены в трансгенной линии Tg(lhx1a-EGFP), прилипают к пронефросу и, по-видимому, мигрируют в будущие места нефрогенеза. Отдельные клетки объединяются в кластеры, которые дифференцируются в новые нефроны12. Неясно, где находятся эти клетки или какие гены они экспрессируют до начала мезонефрогенеза.
Понимание развития мезонефроса дает представление о почках млекопитающих так, как пронефрос не может. К ним относятся образование нефрогенных агрегатов из одиночных клеток-предшественников, функциональная интеграция новых нефронов с существующими и ветвящийся морфогенез. Тем не менее, существуют ограничения для изучения постэмбрионального развития. Личинки менее прозрачны из-за их большего размера и пигментации. Временная шкала развития не является синхронной среди отдельных животных и сильно зависит от факторов окружающей среды, таких как кормление и скученность9,14. Хотя нокдаун-реагенты существуют, они менее эффективны в личинках по сравнению с эмбрионами15. В этом протоколе описан метод гибридизации in situ для определения экспрессии генов во время развития мезонефроса рыбок данио. Несколько шагов оптимизированы для увеличения визуализации мезонефроса и проникновения и промывки зонда и антитела. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется вместе с зондом для EGFP для маркировки одиночных клеток-предшественников, нефрогенных агрегатов и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот метод обеспечит более глубокое понимание развития мезонефроса и понимание регенеративной терапии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

Рыбка данио образует две почечные структуры за свою жизнь. Пронефрос (эмбриональная почка) образуется во время эмбрионального развития и начинает функционировать через 2 дня после оплодотворения. Состоящий только из двух нефронов, пронефрос служит единственной почкой во время личиночной жизни, пока не потребуется больше функции почек из-за увеличения массы тела. Чтобы справиться с этой более высокой потребностью, мезонефрос (взрослая почка) начинает формироваться во время метаморфоза. Новые первичные нефроны сливаются с пронефрами и образуют соединенные просветы. Затем вторичные нефроны сливаются с первичными (и так далее), чтобы создать разветвленную сеть в мезонефросе. Подавляющее большинство исследований сосредоточено на пронефросах из-за простоты использования эмбрионов. Таким образом, необходимо разработать методы изучения более старых и крупных личинок и молоди рыб, чтобы лучше понять развитие мезонефроса. Здесь протокол гибридизации in situ для анализа экспрессии генов оптимизирован для проникновения зонда, промывки зондов и антител, а также отбеливания пигментов для лучшей визуализации мезонефроса. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется для маркировки клеток-предшественников и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот протокол заполняет пробел в исследованиях мезонефроса. Это важная модель для понимания того, как новые ткани почек формируются и интегрируются с существующими нефронами и дают представление о регенеративной терапии.

Используя трансгенную линию Tg(lhx1a-EGFP), было продемонстрировано, что этот протокол гибридизации in situ эффективен при маркировке клеток-предшественников почек и различных нефроновых структур во время развития мезонефроса. Как и ожидалось, центральная нервная система также поме?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Рыбка данио является важной моделью для понимания развития почек. Здесь протокол гибридизации in situ оптимизирован для обнаружения экспрессии генов у личинок рыбок данио и молоди во время развития мезонефроса.

На месте Гибридизация у личинок и молоди рыбок данио во время развития мезонефроса

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Этот протокол важен, потому что он позволяет определять экспрессию генов у старых личинок рыбок данио и молоди во время метаморфоза. Преимущество этой методики заключается в том, что было оптимизировано несколько шагов для проникновения зонда и визуализации почки. Для начала настройте взрослых рыбок данио на спаривание, добавив одного самца и одну самку рыбы в брачный резервуар во второй половине дня после их последнего приема пищи.На следующий день соберите эмбрионы в пластины Петри, содержащие среду Е3. Через пять дней после внесения удобрений поместите 400-микрометровый экран в 2,8-литровый бак и заполните его 2 сантиметрами системной воды. Затем добавьте личинку из одной пластинки Петри.Чтобы закрепить личинку, снимите резервуар с личинкой в нужный момент времени, затем, используя сеть и перенесите пипетку с отрезанным кончиком, перенесите личинку на пластину Петри. Затем добавьте два миллилитра 2% трикаина, чтобы обездвижить личинку. После иммобилизации замените трикаин 20 миллилитрами фиксирующего раствора.Через 30 минут переведите личинку в 50-миллилитровую трубку, содержащую 25 миллилитров свежего фиксирующего раствора. Затем, убедившись, что колпачок плотный, медленно раскачивайте трубку при четырех градусах Цельсия в течение двух дней. На третий день замените фиксирующий раствор 20 миллилитрами PBST, а затем перенесите личинку на пластину Петри.Чтобы измерить личинку, поместите пластину Петри поверх плоской линейки под рассекающим микроскопом, затем, используя манипулятор ресниц, переместите каждую личинку на линейку, чтобы измерить ее общую длину. После измерения всех личинок соедините несколько личинок одинаковой длины на одном стеклянном флаконе с PBST объемом 5,5 миллилитра. При обезвоживании замените ПБСТ в стеклянном флаконе четырьмя миллилитрами 100% метанола, затем храните флакон при минус 20 градусах Цельсия в течение двух дней.Для регидратации замените 100% метанол четырьмя миллилитрами 75% метанола и 25% раствора PBST и покачайте флакон в течение пяти минут. Затем замените раствор метанола и ПБСТ четырьмя миллилитрами свежего ПБСТ и снова раскачивайте флакон в течение 10 минут. Для переваривания протеиназы К замените ПБСТ двумя миллилитрами раствора протеиназы К и раскачивайте флакон при комнатной температуре в течение 30 минут.Далее для отбеливания переложите личинку на шестилуночную пластину и замените ПБСТ тремя миллилитрами свежего отбеливающего раствора. После полного исчезновения пигментации вдоль мезонефроса переложите личинку обратно в стеклянный флакон, замените отбеливающий раствор четырьмя миллилитрами ПБСТ и прокачайте флакон в течение 10 минут. Для предварительной гибридизации замените фиксирующий раствор четырьмя миллилитрами PBST и покачайте флакон в течение 10 минут, затем замените PBST четырьмя миллилитрами Hyb-раствора и породы в течение 10 минут.После двух дополнительных инкубаций в Hyb-растворе заменить раствор четырьмя миллилитрами раствора Hyb+. Одновременно разбавьте флуоресцеиновый зонд EGFP от одного до 100 в 500 микролитрах гибридизации плюс раствор и инкубируйте флакон и зонд при 70 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день, чтобы гибридизировать зонд, замените раствор Hyb+ во флаконе предварительно нагретым зондом и инкубируйте при 70 градусах Цельсия в течение ночи.На следующий день добавьте 50 миллилитров предварительно нагретого 0,2 раза SSCT в 50-миллилитровую трубку. Затем вставьте 100-микрометровый клеточный ситечко в верхнюю часть трубки, перенесите личинку из стеклянного флакона в клеточный ситечко и, убедившись, что личинка погружена в буфер, инкубируйте флакон при 70 градусах Цельсия в течение двух часов. После инкубации перенесите клеточный ситечко в новую трубку, содержащую предварительно нагретый 0,2 раза SSCT, и снова инкубируйте при 70 градусах Цельсия в течение двух часов.Далее для блокировки переложите личинку в новый стеклянный флакон и дайте ему остыть до комнатной температуры. Затем замените 0,2-кратный раствор SSCT четырьмя миллилитрами 67%0,2-кратного раствора SSCT и 33%-го раствора MABT и покачайте флакон при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем замените раствор SSCTT MABT четырьмя миллилитрами свежего MABT и инкубируйте флакон на коромысле в течение 10 минут.Затем замените MABT четырьмя миллилитрами блокирующего раствора и высиживайте четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день замените блокирующий раствор раствором антител и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение двух дней. Для промывки антител переложите личинку в 50-миллилитровую трубку, затем добавьте 40 миллилитров PBST2 и положите трубку, лежащую на бок для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.На 12-й день, после переноса лавы на шестилуночную пластину, замените PBST2 тремя миллилитрами буфера окрашивания. После пятиминутной инкубации на коромысле замените буфер окрашивания тремя миллилитрами окрашивающего раствора. Когда желаемая интенсивность окрашивания достигнута, замените окрашивающий раствор тремя миллилитрами стопорного раствора и камня на 30 минут.Затем переложите личинку в новый стеклянный флакон, замените остановочный раствор четырьмя миллилитрами свежего фиксирующего раствора и высиживайте в течение одного часа при комнатной температуре. Для визуализации замените фиксирующий раствор четырьмя миллилитрами свежего ПБСТ. После 10-минутной инкубации на коромысле переложите личинку на шестилуночную пластину, затем замените PBST четырьмя миллилитрами свежего PBST и снова покачайте пластину в течение 10 минут.Далее добавляют три миллилитра 50% глицерина в ПБСТ и породу в течение 10 минут, затем, используя рассекающий микроскоп, визуализируют личинку непосредственно в шестилуночной пластине. Этот протокол гибридизации in situ эффективно маркирует клетки-предшественники почек и различные нефронные структуры, используя развитие мезонефроса. Начальный мезонефрический нефрон образуется примерно на 5,2 миллиметра дорсально к пронефру.Кластеры клеток-предшественников присутствуют во время развития мезонефроса в дополнение к одиночным клеткам-предшественникам. У более крупных молодых особей фоновое окрашивание может происходить в сомитах. В целом, этот метод может быть использован для изучения других тканей, которые образуются во время метаморфоза, помимо рассеченных взрослых органов.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Понимание начале Органогенез, используя упрощенную<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола в<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Захват восстановления тканей в данио рерио Личинки с Интерв светлого стереомикроскопия

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Визуализация Multiciliated клетки в Zebrafish через комбинированные протокола вся гора флуоресцентные в Situ Гибридизация и иммунофлуоресценции

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Генотипирование и количественная оценка в Ситу Гибридизации Окрашивание в зебрафиш

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Целая гора иммуногистохимия в зебрафиш эмбрионов и ларьков

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Флуоресцентные изображения кальция и последующей на месте гибридизации для нейрональной характеристики прекурсоров в Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...