Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
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La financiación fue proporcionada por la Academia de Ciencias de Pensilvania, y los Biólogos de la Mancomunidad de Pensilvania, y la Universidad de Indiana de Pensilvania (Escuela de Estudios de Posgrado e Investigación, Departamento de Biología y el Fondo de Biología de Pregrado Cynthia Sushak para la Excelencia). La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) fue proporcionada por el Dr. Neil Hukriede (Universidad de Pittsburgh).

El uso de larvas y juveniles de pez cebra está aprobado por el IUP IACUC (protocolo #02-1920, #08-1920). Los detalles del contenido de la solución se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Cría de larvas
NOTA: Tomará hasta 21 días o más para elevar larvas y juveniles a la etapa de interés.
<ol><li>Configure el pez cebra adulto para que se aparee agregando 1 pez macho y 1 hembra en un tanque de apareamiento al final de la tarde después de s...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

El método de hibridación in situ descrito aquí está dirigido a estudiar el desarrollo de mesonephros. Sin embargo, se puede aplicar para estudiar el desarrollo de otros tejidos y órganos durante la metamorfosis, como el intestino, el sistema nervioso, las escamas y la pigmentación14. Se pueden generar sondas para genes endógenos o marcadores fluorescentes en líneas transgénicas.
Es fundamental que las larvas permanezcan intactas para observar los órga...

El embrión de pez cebra es un modelo importante para estudiar el desarrollo tisular debido a su pequeño tamaño, transparencia, herramientas disponibles y supervivencia sin alimentación hasta por cinco días1,2. Ha contribuido en gran medida a la comprensión del desarrollo renal y la conservación entre el pez cebra y los mamíferos3,4,5. El riñón juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis de líquidos, filtrando la sangre y excretando desechos6. La nefrona, la unidad funcional del riñón, comprende un filtro de sangre conectado a un túbulo largo. En el pez cebra, se forman dos estructuras renales a lo largo de su vida. El pronephros (el riñón embrionario temporal) se forma primero durante el desarrollo temprano. Consiste en dos nefronas que corren a lo largo del eje anterior-posterior y se vuelve funcional alrededor de los 2 días posteriores a la fertilización (dpf). La utilidad del pronephros radica en su simplicidad, teniendo solo dos nefronas que son en su mayoría lineales y fáciles de visualizar (aunque el túbulo contorneado proximal comienza a enrollarse a tres dpf)3. Esto ha facilitado no solo los estudios de su desarrollo temprano a partir del mesodermo intermedio, sino también el patrón de segmentación y reparación de túbulos7,8.
La utilidad del pez cebra se limita después de cinco dpf, cuando la yema disminuye y las larvas dependen de la alimentación en el sistema acuático9. Alrededor de las 2 semanas de edad, las larvas sufren metamorfosis en juveniles, donde se forman nuevos tejidos y se pierden y/o reorganizan tejidos viejos9. Esto es también cuando se forma el mesonephros (el riñón adulto permanente)10,11,12. La primera nefrona adulta se forma cerca del sexto somita, y se fusiona con el túbulo temprano distal del pronephros. Las nefronas adicionales se agregan después de esta posición inicialmente, pero también hacia la anterior más adelante. Las nefronas primarias en esta primera ola se fusionan con los túbulos de los pronefros y comparten un lumen común para depositar sus desechos. Las nefronas secundarias se forman en la siguiente ola y se fusionan con las nefronas primarias. Este proceso reiterativo crea un mesonephros que está ramificado, algo similar al riñón de los mamíferos. Presumiblemente, el pronephros eventualmente pierde su identidad de túbulo y se convierte en dos conductos colectores principales donde todas las nefronas drenan sus desechos13.
Antes de la formación de la primera nefrona adulta, las células progenitoras individuales comienzan a aparecer en larvas de ~ 4 mm (longitud total) (~ 10 dpf). Estas células, que están marcadas en la línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP), se adhieren a los pronephros y parecen migrar a futuros sitios de nefrogénesis. Las células individuales se unen en grupos, que se diferencian en nuevas nefronas12. No está claro dónde residen estas células o qué genes expresan antes del inicio de la mesonefrogénesis.
Comprender el desarrollo de los mesonephros proporciona información sobre el riñón de los mamíferos de maneras que los pronephros no pueden. Estos incluyen la formación de agregados nefrogénicos a partir de células progenitoras individuales, la integración funcional de nuevas nefronas con las existentes y la morfogénesis ramificada. Sin embargo, existen limitaciones para estudiar el desarrollo postembrionario. Las larvas son menos transparentes debido a su mayor tamaño y a que tienen pigmentación. La línea de tiempo del desarrollo no es sincrónica entre los animales individuales y depende en gran medida de factores ambientales, como la alimentación y el hacinamiento9,14. Aunque existen reactivos de derribo, son menos efectivos en larvas en comparación con embriones15. En este protocolo, se describe un método de hibridación in situ para determinar la expresión génica durante el desarrollo del pez cebra mesonephros. Se optimizan varios pasos para aumentar la visualización de los mesonefros y la penetración y el lavado de la sonda y el anticuerpo. La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) se utiliza junto con una sonda para EGFP para etiquetar células progenitoras individuales, agregados nefrogénicos y los túbulos distales de las nefronas nacientes. Este método proporcionará una comprensión más profunda del desarrollo de mesonephros y una visión de las terapias regenerativas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

El pez cebra forma dos estructuras renales en su vida. El pronephros (riñón embrionario) se forma durante el desarrollo embrionario y comienza a funcionar a los 2 días después de la fertilización. Compuesto por solo dos nefronas, el pronephros sirve como el único riñón durante la vida larvaria hasta que se requiere más función renal debido al aumento de la masa corporal. Para hacer frente a esta mayor demanda, el mesonephros (riñón adulto) comienza a formarse durante la metamorfosis. Las nuevas nefronas primarias se fusionan con los pronefros y forman lúmenes conectados. Luego, las nefronas secundarias se fusionan con las primarias (y así sucesivamente) para crear una red de ramificación en los mesonephros. La gran mayoría de la investigación se centra en los pronephros debido a la facilidad de uso de embriones. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar técnicas para estudiar larvas y peces juveniles más viejos y más grandes para comprender mejor el desarrollo de los mesonephros. Aquí, un protocolo de hibridación in situ para el análisis de expresión génica está optimizado para la penetración de la sonda, el lavado de sondas y anticuerpos, y el blanqueo de pigmentos para visualizar mejor los mesonephros. La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) se utiliza para etiquetar las células progenitoras y los túbulos distales de las nefronas nacientes. Este protocolo llena un vacío en la investigación de mesonephros. Es un modelo crucial para comprender cómo se forman e integran los nuevos tejidos renales con las nefronas existentes y proporcionar información sobre las terapias regenerativas.

Utilizando la línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP), se demostró que este protocolo de hibridación in situ es efectivo en el etiquetado de células progenitoras renales y diversas estructuras de nefrona durante el desarrollo de mesonephros. Como era de esperar, el sistema nervioso central también está etiquetado en esta línea transgénica (no se muestra). La nefrona mesonéfrica inicial se forma a aproximadamente 5,2 mm, dorsal al pronephros (Figura 2A), y el túbulo dist...

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In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

El pez cebra es un modelo importante para comprender el desarrollo renal. Aquí, se optimiza un protocolo de hibridación in situ para detectar la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de mesonephros.

In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Este protocolo es significativo porque permite la determinación de la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra más viejos durante la metamorfosis. La ventaja de esta técnica es que se han optimizado varios pasos para la penetración de la sonda y la visualización del riñón. Para comenzar, configure el pez cebra adulto para que se aparee agregando un pez macho y una hembra en un tanque de apareamiento al final de la tarde después de su última comida.Al día siguiente, recoge los embriones en placas de Petri que contengan medio E3. Cinco días después de la fertilización, coloque una pantalla de 400 micrómetros en un tanque de 2.8 litros y llénelo con 2 centímetros de agua del sistema. Luego agregue la larva de una placa de Petri.Para fijar la larva, retire un tanque de larva en el punto de tiempo deseado, luego, usando una red y una pipeta de transferencia con su punta cortada, transfiera la larva a la placa de Petri. A continuación, agregue dos mililitros de 2% de tricaína para inmovilizar la larva. Después de la inmovilización, reemplace la tricaína con 20 mililitros de solución de fijación.Después de 30 minutos, transfiera la larva a un tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de solución de fijación fresca. Luego, asegurándose de que la tapa esté apretada, balancee lentamente el tubo a cuatro grados centígrados durante dos días. En el tercer día, reemplace la solución de fijación con 20 mililitros de PBST y luego transfiera la larva a una placa de Petri.Para medir la larva, coloque la placa de Petri encima de una regla plana bajo un microscopio de disección, luego, usando un manipulador de pestañas, mueva cada larva sobre la regla para medir su longitud total. Después de medir todas las larvas, combine varias larvas de longitudes similares en un vial de vidrio de 5,5 mililitros con PBST. Para la deshidratación, reemplace el PBST en el vial de vidrio con cuatro mililitros de metanol al 100%, luego guarde el vial a menos 20 grados Celsius durante dos días.Para la rehidratación, reemplace el 100% de metanol con cuatro mililitros de una solución de 75% de metanol y 25% de PBST y mueva el vial durante cinco minutos. Luego, reemplace la solución de metanol y PBST con cuatro mililitros de PBST fresco y vuelva a mecer el vial durante 10 minutos. Para la digestión de la proteinasa K, reemplace el PBST con dos mililitros de una solución de proteinasa K y mueva el vial a temperatura ambiente durante 30 minutos.A continuación, para el blanqueamiento, transfiera la larva a una placa de seis pocillos y reemplace el PBST con tres mililitros de solución blanqueadora fresca. Después de la desaparición completa de la pigmentación a lo largo de los mesonephros, transfiera la larva de nuevo a un vial de vidrio, reemplace la solución blanqueadora con cuatro mililitros de PBST y mueva el vial durante 10 minutos. Para la predihridación, reemplace la solución de fijación con cuatro mililitros de PBST y mueva el vial durante 10 minutos, luego, reemplace el PBST con cuatro mililitros de Hyb-solution y roca durante 10 minutos.Después de dos incubaciones adicionales en la solución Hyb, reemplace la solución con cuatro mililitros de la solución Hyb +. Diluya simultáneamente la sonda de fluoresceína EGFP de uno a 100 en 500 microlitros de hibridación más solución, e incube el vial y la sonda a 70 grados Centígrados durante la noche. Al día siguiente, para hibridar la sonda, reemplace la solución Hyb+ en el vial con la sonda precalentada e incube a 70 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, agregue 50 mililitros de SSCT precalentado 0.2 veces en un tubo de 50 mililitros. Luego, inserte un colador celular de 100 micrómetros en la parte superior del tubo, transfiera la larva del vial de vidrio al colador celular y, asegurándose de que la larva esté sumergida en el tampón, incube el vial a 70 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, transfiera el colador celular a un nuevo tubo que contenga 0,2 veces SSCT precalentado e incube de nuevo a 70 grados centígrados durante dos horas.A continuación, para el bloqueo, transfiera la larva a un nuevo vial de vidrio y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Luego, reemplace la solución de SSCT 0.2 veces con cuatro mililitros de una solución de SSCT al 67%0.2 veces y una solución de MABT al 33% y balancee el vial a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, reemplace la solución SSCTT MABT con cuatro mililitros de MABT fresco e incube el vial en un balancín durante 10 minutos.Luego, reemplace el MABT con cuatro mililitros de solución de bloqueo e incube cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, reemplace la solución de bloqueo con una solución de anticuerpos e incube a cuatro grados centígrados durante dos días. Para el lavado de anticuerpos, transfiera la larva a un tubo de 50 mililitros, luego agregue 40 mililitros de PBST2 y coloque el tubo tendido de lado para la incubación nocturna a cuatro grados centígrados.El día 12, después de transferir la lava a una placa de seis pocillos, reemplace el PBST2 con tres mililitros de tampón de tinción. Después de una incubación de cinco minutos en un balancín, reemplace el tampón de tinción con tres mililitros de la solución de tinción. Cuando se alcance la intensidad de tinción deseada, reemplace la solución de tinción con tres mililitros de la solución de parada y roca durante 30 minutos.Luego, transfiera la larva a un nuevo vial de vidrio, reemplace la solución de parada con cuatro mililitros de solución de fijación fresca e incube durante una hora a temperatura ambiente. Para la obtención de imágenes, reemplace la solución de fijación con cuatro mililitros de PBST fresco. Después de una incubación de 10 minutos en un balancín, transfiera la larva a una placa de seis pocillos, luego reemplace el PBST con cuatro mililitros de PBST fresco y vuelva a mecer el plato durante 10 minutos.A continuación, agregue tres mililitros de glicerol al 50% en PBST y roca durante 10 minutos, luego, usando un microscopio de disección, obtenga una imagen de la larva directamente en la placa de seis pocillos. Este protocolo de hibridación in situ etiqueta eficazmente las células progenitoras renales y varias estructuras de nefrona utilizando el desarrollo de mesonephros. La nefrona mesonéfrica inicial se forma a aproximadamente 5,2 milímetros dorsales de los pronefros.Los grupos de células progenitoras están presentes durante el desarrollo de mesonephros, además de las células progenitoras individuales. En los juveniles más grandes, la tinción de fondo puede ocurrir en los somitas. En general, este método se puede utilizar para estudiar otros tejidos que se forman durante la metamorfosis, además de los órganos adultos disecados.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...