Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

Finansiering tillhandahölls av Pennsylvania Academy of Science och Commonwealth of Pennsylvania Biologists och Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology och Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) tillhandahölls av Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).

Användningen av zebrafisklarver och ungfisk är godkänd av IUP IACUC (protokoll #02-1920, #08-1920). Information om lösningsinnehållet visas i tabellen över material.
1. Höja larver
OBS: Det tar upp till 21 dagar eller mer att höja larver och ungdomar till intressestadiet.
<ol><li>Ställ upp vuxna zebrafiskar för att kompisera genom att lägga till 1 manlig och 1 kvinnlig fisk i en parningstank sent på eftermiddagen efter deras sista mål...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

In situ hybridiseringsmetoden som beskrivs här syftar till att studera mesonephros utveckling. Det kan dock tillämpas för att studera utvecklingen av andra vävnader och organ under metamorfos, såsom tarm, nervsystem, vågar och pigmentering14. Sonder kan genereras för endogena gener eller fluorescerande markörer i transgena linjer.
Det är viktigt att larverna förblir intakta för att observera organen och vävnaderna i sitt ursprungliga sammanhang. Fö...

Zebrafiskembryon är en viktig modell för att studera vävnadsutveckling på grund av dess lilla storlek, transparens, tillgängliga verktyg och överlevnad utan utfodring i upp till fem dagar1,2. Det har i hög grad bidragit till förståelsen av njurutveckling och bevarandet mellan zebrafisk och däggdjur3,4,5. Njuren spelar en viktig roll för att upprätthålla flytande homeostas, filtrera blodet och utsöndra avfall6. Nefron, njurens funktionella enhet, består av ett blodfilter anslutet till en lång tubule. I zebrafisk bildas två njurstrukturer under hela sitt liv. Pronephros (den tillfälliga embryonala njuren) bildas först under tidig utveckling. Den består av två nefrorier som löper längs den främre bakre axeln och blir funktionell vid cirka 2 dagar efter befruktning (dpf). Nyttan av pronephros ligger i dess enkelhet, med bara två nefror som mestadels är linjära och lätta att visualisera (även om den proximala invecklade tubule börjar spola vid tre dpf)3. Detta har underlättat inte bara studier av dess tidiga utveckling från den mellanliggande mesodermen, men också segmenteringsmönstret och tubulereparation7,8.
Nyttan av zebrafisk blir begränsad efter fem dpf, när äggulan minskar och larverna förlitar sig på utfodring i vattensystemet9. Vid cirka 2 veckors ålder genomgår larverna metamorfos till ungdomar, där nya vävnader bildas och gamla vävnader går förlorade och/ eller omorganiseras9. Detta är också när mesonephros (den permanenta vuxna njuren) bildar10,11,12. Den första vuxna nefron bildas nära den sjätte somiten och smälter samman med den distala tidiga tubuleen hos pronephros. Ytterligare nephrons läggs till bakre till denna position inledningsvis, men också mot den främre senare. De primära nefronerna i denna första våg smälter till tubules av pronephros och delar en gemensam lumen för att deponera sitt avfall. Sekundära nefrostrar bildas i nästa våg och smälter till primära nefroner. Denna reiterativa process skapar en mesonephros som är förgrenad, något lik däggdjurs njuren. Förmodligen förlorar pronephros så småningom sin tubule identitet och blir två stora samla kanaler där alla nefroner dränerar sitt avfall13.
Före bildandet av den första vuxna nefroronen börjar enstaka stamceller dyka upp i ~4 mm (total längd) larver (~ 10 dpf). Dessa celler, som är markerade i Tg (lhx1a-EGFP) transgena linjen, följer pronephros och verkar migrera till framtida platser för nefrogenes. De enstaka cellerna förenas till kluster, som skiljer sig åt i nya nefros12. det är oklart var dessa celler bor eller vilka gener de uttrycker före uppkomsten av mesonephrogenesis.
Att förstå mesonephros utveckling ger insikter om däggdjurs njuren på sätt som benägnaphros inte kan. Dessa inkluderar bildandet av nefrogena aggregat från enstaka stamceller, funktionell integration av nya nefros med befintliga och förgrening av morfogenes. Det finns dock begränsningar för att studera postembryonic utveckling. Larverna är mindre transparenta på grund av sin större storlek och med pigmentering. Den utvecklingsmässiga tidslinjen är inte synkron bland enskilda djur och är i hög grad beroende av miljöfaktorer, såsom utfodring och trängsel9,14. Även om knockdown reagenser finns, är de mindre effektiva i larver jämfört med embryon15. I detta protokoll beskrivs en in situ hybridisering metod för att bestämma gen uttryck under zebrafish mesonephros utveckling beskrivs. Flera steg är optimerade för att öka visualiseringen av mesonephros och penetration och tvättning av sonden och antikroppen. Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) används tillsammans med en sond för EGFP för att märka enstaka stamceller, nefrogena aggregat och distala tubuler av gryende nefrorer. Denna metod kommer att ge en djupare förståelse för mesonephros utveckling och insikt i regenerativa terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

Zebrafisken bildar två njurstrukturer under sin livstid. Pronephros (embryonal njure) bildas under embryonal utveckling och börjar fungera vid 2 dagar efter befruktning. Bestående av endast två nefrorer fungerar pronephros som den enda njuren under larvlivet tills mer njurfunktion krävs på grund av den ökande kroppsmassan. För att klara av denna högre efterfrågan börjar mesonephros (vuxen njure) bildas under metamorfos. De nya primära nefronerna smälter till benägna frros och bildar anslutna lumen. Sedan smälter sekundära nefrooner till primära (och så vidare) för att skapa ett förgreningsnätverk i mesonephros. Den stora majoriteten av forskningen är inriktad på benägna att använda embryon. Således finns det ett behov av att utveckla tekniker för att studera äldre och större larver och ungfisk för att bättre förstå mesonephros utveckling. Här är ett in situ hybridiseringsprotokoll för genuttrycksanalys optimerat för sondpenetration, tvättning av sonder och antikroppar och blekning av pigment för att bättre visualisera mesonephros. Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) används för att märka stamceller och distala tubuler av gryende nefroner. Detta protokoll fyller en lucka i mesonephros forskning. Det är en viktig modell för att förstå hur nya njurvävnader bildas och integreras med befintliga nefross och ge insikter om regenerativa terapier.

Med hjälp av Tg(lhx1a-EGFP) transgena linjen, visades det att detta in situ hybridisering protokoll är effektivt vid märkning njure stamceller och olika nephron strukturer under mesonephros utveckling. Som förväntat är centrala nervsystemet också märkt i denna transgena linje (visas inte). Den ursprungliga mesonephric nephron bildas på cirka 5,2 mm, dorsala till pronephros (figur 2A), och den distala tubule av denna nephron är märkt av EGFP10,12...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Zebrafisken är en viktig modell för att förstå njurutveckling. Här är ett in situ hybridiseringsprotokoll optimerat för att upptäcka genuttryck hos zebrafisklarver och ungdomar under mesonephros utveckling.

In situ Hybridisering hos zebrafisk larver och ungdomar under Mesonephros utveckling

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Detta protokoll är betydelsefullt eftersom det tillåter bestämning av genuttryck hos äldre zebrafisk larver och ungdomar under metamorfos. Fördelen med denna teknik är att flera steg har optimerats för sondpenetration och visualisering av njuren. Till att börja med, sätt upp vuxna zebrafiskar för att kompisera genom att lägga till en manlig och en kvinnlig fisk i en parningstank sent på eftermiddagen efter deras sista måltid.Nästa dag samlar du embryona i Petri-plattor som innehåller E3-medium. Fem dagar efter befruktning, placera en 400-mikrometerskärm i en 2,8-liters tank och fyll den med 2 centimeter systemvatten. Tillsätt sedan larven från en Petri-tallrik.För att fixa larven, ta bort en larvtank vid önskad tidpunkt, sedan, med hjälp av ett nät och överför pipetten med spetsen avskuren, överför larven till Petri-plattan. Lägg sedan till två milliliter med 2% trikain för att immobilisera larven. Efter immobilisering, byt ut trikain med 20 milliliter fixeringslösning.Efter 30 minuter överför larven till ett 50-milliliter rör som innehåller 25 milliliter färsk fixeringslösning. Se sedan till att locket är tätt, vagga långsamt röret vid fyra grader Celsius i två dagar. På dag tre, byt ut fixeringslösningen med 20 milliliter PBST och överför sedan larven till en Petri-tallrik.För att mäta larven, placera Petri-plattan ovanpå en platt linjal under ett dissekerande mikroskop och flytta sedan varje larva till linjalen med hjälp av en ögonfransmanipulatör för att mäta dess totala längd. Efter att ha mätt alla larver, kombinera flera larver av liknande längder på en 5,5-milliliter glasflaska med PBST. För uttorkning, byt ut PBST i glasflaskan med fyra milliliter 100% metanol och förvara sedan injektionsflaskan vid minus 20 grader Celsius i två dagar.För rehydrering, byt ut 100% metanol med fyra milliliter av en 75% metanol och 25% PBST-lösning och rocka injektionsflaskan i fem minuter. Byt sedan ut metanol- och PBST-lösningen mot fyra milliliter färsk PBST och gunga injektionsflaskan igen i 10 minuter. För Proteinase K-matsmältningen, byt ut PBST med två milliliter proteinas K-lösning och gunga injektionsflaskan i rumstemperatur i 30 minuter.Överför sedan larven för blekning till en sexbrunnplatta och byt ut PBST med tre milliliter färsk blekningslösning. Efter det fullständiga försvinnandet av pigmentering längs mesonephros, överför larven tillbaka till en glasflaska, byt blekningslösningen med fyra milliliter PBST och vagga injektionsflaskan i 10 minuter. För förhybridisering, byt ut fästlösningen med fyra milliliter PBST och vagga injektionsflaskan i 10 minuter och byt sedan ut PBST med fyra milliliter Hyb-lösning och sten i 10 minuter.Efter ytterligare två inkubationer i Hyb-lösningen, byt ut lösningen mot fyra milliliter hyb+-lösningen. Späd samtidigt EGFP fluoresceinsonden en till 100 i 500 mikroliter av hybridisering plus lösning, och inkubera injektionsflaskan och sonden vid 70 grader Celsius över natten. Nästa dag, för att hybridisera sonden, byt ut Hyb +-lösningen i injektionsflaskan med den förvärmda sonden och inkubera vid 70 grader Celsius över natten.Följande dag tillsätt 50 ml förvärmd 0,2 gånger SSCT i ett 50-milliliterrör. Sätt sedan in en 100-mikrometer cellsil i toppen av röret, överför larven från glasflaskan i cellsilen och se till att larven är nedsänkt i bufferten, inkubera injektionsflaskan vid 70 grader Celsius i två timmar. Efter inkubationen överför du cellsilen till ett nytt rör som innehåller förvärmt 0,2 gånger SSCT och inkubera igen vid 70 grader Celsius i två timmar.Därefter, för blockering, överför larven till en ny glasflaska och låt den svalna till rumstemperatur. Byt sedan ut 0,2 gånger SSCT-lösningen med fyra milliliter på 67%0,2 gånger SSCT och 33% MABT-lösning och vagga injektionsflaskan i rumstemperatur i 10 minuter. Byt sedan ut SSCTT MABT-lösningen mot fyra milliliter färsk MABT och inkubera injektionsflaskan på en vipp i 10 minuter.Byt sedan ut MABT med fyra milliliter blockeringslösning och inkuberar fyra grader Celsius över natten. Nästa dag, ersätt blockeringslösningen med en antikroppslösning och inkubera vid fyra grader Celsius i två dagar. För antikroppstvätt, överför larven till ett 50-milliliter rör, tillsätt sedan 40 milliliter PBST2 och lägg röret som ligger på sidan för inkubation över natten vid fyra grader Celsius.På dag 12, efter att ha överfört lavan till en sex-brunnsplatta, byt ut PBST2 med tre milliliter färgbuffert. Efter en fem minuters inkubation på en vipp, byt ut färgbufferten med tre milliliter av färgningslösningen. När önskad färgningsintensitet uppnås, byt ut färgningslösningen med tre milliliter av stopplösningen och stenen i 30 minuter.Överför sedan larven till en ny glasflaska, byt ut stopplösningen med fyra milliliter färsk fixeringslösning och inkubera i en timme vid rumstemperatur. För avbildning, byt ut fästlösningen mot fyra milliliter färsk PBST. Efter en 10 minuters inkubation på en rocker, överför larven till en sex-brunnsplatta, byt sedan ut PBST med fyra milliliter färsk PBST och vagga plattan igen i 10 minuter.Lägg sedan till tre milliliter av 50% glycerol i PBST och sten i 10 minuter, sedan, med hjälp av ett dissekerande mikroskop, avbilda larven direkt i sexbrunnplattan. Detta in situ hybridisering protokoll märker effektivt njure stamceller och olika nephron strukturer med hjälp av mesonephros utveckling. Den första mesonephric nephron bildas på cirka 5,2 millimeter dorsala till pronephros.Kluster av stamceller finns under mesonephros utveckling utöver enstaka stamceller. Hos större ungdomar kan bakgrundsfärgning förekomma i somiterna. Sammantaget kan denna metod användas för att studera andra vävnader som bildas under metamorfos, förutom dissekerade vuxna organ.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Förstå Tidig Organogenesis användning av en förenklad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering protokollet<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fånga Tissue Repair i Zebrafish Larver med Time-lapse Bright stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisera Multiciliated celler i zebrafisk genom en kombinerad protokoll av hela Mount fluorescerande In Situ hybridisering och immunofluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ hybridisering för Astyanax embryon

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotypning och kvantifiering av In Situ Hybridisering Färgning i Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hela mount immunohistokemi i zebrafisk embryon och larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerande kalciumavbildning och efterföljande in situ hybridisering för neuronal prekursor karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...