Name: in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

Pensilvanya Bilim Akademisi ve Pennsylvania Biyologlar Topluluğu ve Indiana University of Pennsylvania (Lisansüstü Çalışmalar ve Araştırma Okulu, Biyoloji Bölümü ve Cynthia Sushak Lisans BiyolojiSi Mükemmellik Fonu) tarafından finanse edildi. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı Dr. Neil Hukriede (Pittsburgh Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır.

Zebra balığı larvalarının ve yavrularının kullanımı IUP IACUC (protokol #02-1920, #08-1920) tarafından onaylanmıştır. Çözüm içeriğinin ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Larvaların yükseltilmesi
NOT: Larvaları ve gençleri ilgi alanına yükseltmek 21 gün veya daha fazla sürecektir.
<ol><li>Son yemeklerinden sonra öğleden sonra bir çiftleşme tankına 1 erkek ve 1 dişi balık ekleyerek çiftleşmek iç...

<ol>
	<li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+zebrafish+research:+a+global+outlook.">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li><li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate.">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+development:+basic+science+to+translational+research.">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li><li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration.">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).</li><li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration.">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li><li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages.">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+mesonephros.">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).</li><li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li><li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Homeobox+4+(lhx4)+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish.">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).</li><li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish.">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).</li><li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish.">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li><li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs.">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li><li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney.">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).</li></ol>

Burada açıklanan in situ hibridizasyon yöntemi mezonephros gelişimini incelemeye yöneliktir. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında bağırsak, sinir sistemi, ölçekler ve pigmentasyon gibi diğer doku ve organların gelişimini incelemek için uygulanabilir14. Endojen genler veya transgenik çizgilerdeki floresan belirteçler için problar oluşturulabilir.
Larvaların, organları ve dokuları kendi bağlamlarında gözlemlemek için bozulmadan kalmala...

Zebra balığı embriyosu, küçük boyutu, şeffaflığı, mevcut araçları ve beş güne kadar beslenmeden hayatta kalması nedeniyle doku gelişimini incelemek için önemli bir modeldir1,2. Böbrek gelişiminin anlaşılmasına ve zebra balıkları ile memeliler arasındaki korumanın korunmasına büyük katkıda bulunmuştur3,4,5. Böbrek, sıvı homeostazını korumada, kanı filtrelemede ve atıkların atılmasında önemli bir rol oynar6. Böbreğin fonksiyonel birimi olan nefron, uzun bir tübüle bağlı bir kan filtresinden oluşur. Zebra balıklarında, yaşamı boyunca iki böbrek yapısı oluşur. Pronephros (geçici embriyonik böbrek) ilk olarak erken gelişim sırasında oluşur. Ön-arka eksen boyunca çalışan iki nefrondan oluşur ve döllenmeden (dpf) yaklaşık 2 gün sonra işlevsel hale gelir. Pronephros'un faydası basitliğinde yatmaktadır, çoğunlukla doğrusal ve görselleştirilmesi kolay sadece iki nefrona sahiptir (proksimal dolambaçlı tübül üç dpf'de sarmal yapmaya başlasa da)3. Bu sadece ara mezodermden erken gelişiminin çalışmalarını değil, aynı zamanda segmentasyon deseni ve tübül onarımını da kolaylaştırmıştır7,8.
Zebra balıklarının kullanışlılığı, yumurta sarısı azaldığında ve larvalar su sisteminde beslenmeye dayandığında beş dpf'den sonra sınırlı hale gelir9. Yaklaşık 2 haftalıkken larvalar, yeni dokuların oluştuğu ve eski dokuların kaybolduğu ve / veya yeniden düzenlendiği gençlere metamorfoz geçirir9. Bu aynı zamanda mezonephros (kalıcı yetişkin böbreği) 10,11,12 oluşturur. İlk yetişkin nefron altıncı somit yakınında oluşur ve pronephros distal erken tübül ile kaynaşır. Ek nefronlar başlangıçta bu konuma arka olarak eklenir, ancak daha sonra ön konuma da eklenir. Bu ilk dalgadaki birincil nefronlar pronephros tübüllerine kaynaşır ve atıklarını biriktirmek için ortak bir lümeni paylaşırlar. İkincil nefronlar bir sonraki dalgada oluşur ve birincil nefronlara kaynaşır. Bu tekrarlayıcı süreç, memeli böbreği gibi dallı bir mezonephros oluşturur. Muhtemelen, pronephros sonunda tübüle kimliğini kaybeder ve tüm nefronların atıklarını boşalttığı iki büyük toplama kanalı haline gelir13.
İlk yetişkin nefron oluşumundan önce, tek ata hücreleri ~4 mm (toplam uzunluk) larvalarda (~10 dpf) görünmeye başlar. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik çizgisinde işaretlenen bu hücreler, proneforolara yapışır ve gelecekteki nefrogenez bölgelerine göç eder gibi görünmektedir. Tek hücreler kümeler halinde birleşir ve bu da yeni nefronlara dönüşür12. Bu hücrelerin nerede yaşadığı veya mezonephrogenez başlangıcından önce hangi genleri ifade ettikleri belirsizdir.
Mezoneforos gelişimini anlamak, memeli böbreği hakkında pronephros'un yapamayacağı şekilde içgörüler sağlar. Bunlar arasında tek progenitör hücrelerden nefrojenik agregaların oluşumu, yeni nefronların mevcutlarla fonksiyonel entegrasyonu ve dallanma morfogenezi saydır. Bununla birlikte, postembriyonik gelişimi incelemek için sınırlamalar vardır. Larvalar daha büyük boyutları ve pigmentasyonları nedeniyle daha az şeffaftır. Gelişimsel zaman çizelgesi bireysel hayvanlar arasında senkronize değildir ve beslenme ve kalabalık oluşturma9,14 gibi çevresel faktörlere oldukça bağlıdır. Nakavt reaktifleri mevcut olmasına rağmen, larvalarda embriyolara kıyasla daha az etkilidirler15. Bu protokolde zebra balığı mezoteforos gelişimi sırasında gen ekspresyonunu belirlemek için yerinde melezleme yöntemi tanımlanmıştır. Mezomreforoların görselleştirilmesini ve prob ve antikorun penetrasyonunu ve yıkanmasını artırmak için çeşitli adımlar optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, EGFP'nin tek progenitör hücreleri, nefrojenik agregaları ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemesi için bir prob ile birlikte kullanılır. Bu yöntem, mezometroların gelişiminin daha derin anlaşılmasını ve rejeneratif tedaviler hakkında fikir verilmesini sağlayacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescein antibody</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11426338910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>Use for blocking solution, prepare according to manufacture&#39;s instruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-363-549</td>
			<td>100 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash manipulator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1083208</td>
			<td>Use to manipulate larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65&#176;C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein probe synthesis</td>
			<td>Roche/Sigma-Aldrich</td>
			<td>11685619910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hatchfry encapsulation</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb- solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyb+ solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAB (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MABT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X MAB, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.2% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5568</td>
			<td>Use to permeabilize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20&#160; &#956;g/mL, 1% DMSO final concentration in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirulina microfine powder</td>
			<td>Argent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC (20X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (0.2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSCT (2X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#956;g/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 &#956;g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula (yeast) RNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>2%, pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ hybridization in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development

Zebra balığı ömrü boyunca iki böbrek yapısı oluşturur. Pronephros (embriyonik böbrek) embriyonik gelişim sırasında oluşur ve döllenmeden 2 gün sonra çalışmaya başlar. Sadece iki nefrondan oluşan pronephros, artan vücut kütlesi nedeniyle daha fazla böbrek fonksiyonu gerekli olana kadar larva yaşamı boyunca tek böbrek görevi görür. Bu yüksek taleple başa çıkmak için, metamorfoz sırasında mezonephros (yetişkin böbrek) oluşmaya başlar. Yeni birincil nefronlar pronephros'a kaynaşır ve bağlı lümenler oluşturur. Daha sonra, ikincil nefronlar, mezonephros'ta bir dallanma ağı oluşturmak için birincil olanlara (vb.) kaynaşır. Araştırmaların büyük çoğunluğu embriyo kullanma kolaylığı nedeniyle pronephros üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu nedenle, mezonephros gelişimini daha iyi anlamak için daha yaşlı ve daha büyük larvaları ve yavru balıkları incelemek için teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, gen ekspresyon analizi için bir in situ hibridizasyon protokolü, prob penetrasyonu, probların ve antikorların yıkanması ve mezomünleri daha iyi görselleştirmek için pigmentlerin ağartılması için optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, progenitör hücreleri ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemek için kullanılır. Bu protokol mesonephros araştırmalarındaki boşluğu dolduruyor. Yeni böbrek dokularının mevcut nefronlarla nasıl oluştuğunu ve bütünleşip yenileyici tedaviler hakkında fikir verdiğini anlamak için çok önemli bir modeldir.

Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı kullanılarak, bu in situ hibridizasyon protokolünün mezonephros gelişimi sırasında böbrek progenitör hücrelerinin ve çeşitli nefron yapıların etiketlenmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Beklendiği gibi, merkezi sinir sistemi de bu transgenik çizgide etiketlenmiştir (gösterilmez). İlk mezofrerik nefron yaklaşık 5,2 mm'de oluşur, pronephros'a dorsal (Şekil 2A) ve bu nefron distal tübül EGFP10,12 ile etiketlenmişt...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development at JoVE.com

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.

In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Bu protokol önemlidir, çünkü metamorfoz sırasında yaşlı zebra balığı larvalarında ve yavrularında gen ekspresyonunun belirlenmesine izin verir. Bu tekniğin avantajı, prob penetrasyonu ve böbreğin görselleştirilmesi için birkaç adımın optimize edilmiş olmasıdır. Başlamak için, son yemeklerinden sonra öğleden sonra geç saatlerde bir çiftleşme tankına bir erkek ve bir dişi balık ekleyerek çiftleşmek için yetişkin zebra balığı kurun.Ertesi gün, embriyoları E3 ortamı içeren Petri plakalarında toplayın. Döllenmeden beş gün sonra, 2.8 litrelik bir tanka 400 mikrometrelik bir ekran yerleştirin ve 2 santimetre sistem suyu ile doldurun. Sonra larvaları bir Petri tabağından ekleyin.Larvayı düzeltmek için, istenen zaman noktasında bir larva tankını çıkarın, ardından bir ağ kullanarak ve ucu kesilmiş pipet aktarın, larvayı Petri plakasına aktarın. Daha sonra, larvayı hareketsiz hale getirmek için iki mililitre% 2 trikain ekleyin. Hareketsiz hale getirdikten sonra, trikaini 20 mililitre sabitleme çözeltisi ile değiştirin.30 dakika sonra larvaları 25 mililitre taze sabitleme çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, kapağın sıkı olduğundan emin olarak, tüpü iki gün boyunca dört santigrat derecede yavaşça sallar. Üçüncü gün, sabitleme çözeltisini 20 mililitre PBST ile değiştirin, ardından larvayı bir Petri plakasına aktarın.Larvayı ölçmek için, Petri plakasını bir diseksiyon mikroskobu altında düz bir cetvelin üzerine yerleştirin, ardından bir kirpik manipülatörü kullanarak, toplam uzunluğunu ölçmek için her larvayı cetvelin üzerine taşıyın. Tüm larvaları ölçtükten sonra, benzer uzunluklardaki birkaç larvayı PBST ile bir 5,5 mililitrelik cam şişede birleştirin. Dehidrasyon için, PBST'yi cam şişedeki% 100 metanol dört mililitre ile değiştirin, ardından şişeyi iki gün boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın.Rehidrasyon için% 100 metanolünü% 75 metanol ve% 25 PBST çözeltisinin dört mililitresi ile değiştirin ve şişeyi beş dakika sallayın. Ardından, metanol ve PBST çözeltisini dört mililitre taze PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika boyunca tekrar sallayın. Proteinaz K sindirimi için PBST'yi iki mililitre proteinaz K çözeltisi ile değiştirin ve şişeyi oda sıcaklığında 30 dakika sallayın.Daha sonra, ağartma için larvayı altı kuyulu bir tabağa aktarın ve PBST'yi üç mililitre taze ağartma çözeltisi ile değiştirin. Mezonephros boyunca pigmentasyonun tamamen kaybolmasından sonra, larvayı bir cam şişeye geri aktarın, ağartma çözeltisini dört mililitre PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika sallayın. Ön hibridizasyon için sabitleme solüsyonunu dört mililitre PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika sallayın, ardından PBST'yi dört mililitre Hyb çözeltisi ve 10 dakika boyunca kaya ile değiştirin.Hyb çözeltisinde iki ek inkübasyondan sonra, çözeltiyi hyb+çözeltinin dört mililitresi ile değiştirin. Egfp floresan probunu aynı anda 500 mikrolitrede 100 mikrolitre hibridizasyon artı çözelti ile seyreltin ve şişeyi ve probu bir gecede 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, probu melezlemek için şişedeki Hyb+çözeltisini önceden ısıtılmış probla değiştirin ve bir gecede 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, 50 mililitrelik bir tüpe 50 mililitre önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT ekleyin. Daha sonra, tüpün üstüne 100 mikrometre hücre süzgeci yerleştirin, larvaları cam şişeden hücre süzgecine aktarın ve larvaların tampona batırılmasını sağlayın, şişeyi iki saat boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre süzgecini önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT içeren yeni bir tüpe aktarın ve iki saat boyunca 70 santigrat derecede tekrar kuluçkaya yayalım.Daha sonra, blokaj için larvayı yeni bir cam şişeye aktarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ardından, 0,2 kat SSCT çözeltisini dört mililitre 67%0,2 kat SSCT ve %33 MABT çözelti ile değiştirin ve şişeyi oda sıcaklığında 10 dakika sallayın. Ardından, SSCTT MABT çözeltisini dört mililitre taze MABT ile değiştirin ve şişeyi bir rocker üzerinde 10 dakika kuluçkaya bırakın.Ardından, MABT'yi dört mililitrelik blokaj çözeltisi ile değiştirin ve bir gecede dört santigrat derece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, blokaj çözeltisini bir antikor çözeltisi ile değiştirin ve iki gün boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Antikor yıkama için larvayı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından 40 mililitre PBST2 ekleyin ve tüpü dört santigrat derecede gece kuluçka için yan yatırın.12. günde, lavları altı kuyulu bir tabağa aktardıktan sonra, PBST2'yi üç mililitrelik boyama tamponu ile değiştirin. Bir rocker üzerinde beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, boyama tamponunu üç mililitrelik boyama çözeltisi ile değiştirin. İstenilen lekeleme yoğunluğuna ulaşıldığında, boyama çözeltisini üç mililitre durdurma çözeltisi ile değiştirin ve 30 dakika boyunca kayan.Daha sonra larvayı yeni bir cam şişeye aktarın, durdurma çözeltisini dört mililitre taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Görüntüleme için sabitleme çözümünü dört mililitre taze PBST ile değiştirin. Bir rocker üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyonu takiben, larvayı altı kuyulu bir tabağa aktarın, ardından PBST'yi dört mililitre taze PBST ile değiştirin ve plakayı 10 dakika boyunca tekrar sallayın.Daha sonra, PBST'ye üç mililitre% 50 gliserol ekleyin ve 10 dakika boyunca kayan, daha sonra bir diseksiyon mikroskobu kullanarak larvayı doğrudan altı kuyu plakasında görüntüleyin. Bu in situ hibridizasyon protokolü, mezonephros gelişimini kullanarak böbrek progenitör hücrelerini ve çeşitli nefron yapılarını etkili bir şekilde etiketler. İlk mezometerik nefron pronephros için yaklaşık 5.2 milimetre sırtta oluşur.Mezoneforo gelişimi sırasında tek progenitör hücrelere ek olarak progenitör hücre kümeleri de mevcuttur. Daha büyük gençlerde, somitlerde arka plan lekesi oluşabilir. Genel olarak, bu yöntem, parçalanmış yetişkin organlarına ek olarak metamorfoz sırasında oluşan diğer dokuları incelemek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...