Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الاستئماني لأمراض النساء والتوليد في هونغ كونغ في عام 2018 وصندوق هونغ كونغ للصحة والبحوث الطبية (06170186، 07180226).

وقد وافقت على الدراسة الجامعة الصينية المشتركة بين هونغ كونغ والأقاليم الجديدة لجنة أخلاقيات البحوث السريرية للمجموعة الشرقية. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المشاركين قبل جمع خزعات بطانة الرحم. راجع قسم المقدمة لمعايير تضمين مجموعات التحكم و RM.
1. إعداد العينة
<ol><li>تأكد ...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+uterine+natural+killer+(uNK)+cell+measurements+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+reproductive+failure.">Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure.</a> Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXA-10+and+E-cadherin+expression+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+implantation+failure+and+recurrent+miscarriage.">HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+the+measurement+of+uterine+natural+killer+cells+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+miscarriage.">Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).</li><li>Jasper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+LIF+and+IL1B+regulate+alpha(1,2)fucosyltransferase+2+(Fut2)+expression+in+mouse+uterine+epithelial+cells+during+early+pregnancy.">Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy.</a> Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).</li><li>Kopcow, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

الخطوات الهامة داخل البروتوكول من المهم ملاحظة أن تلطيخ متعددة يتطلب التحسين الدؤوب. يتطلب استرجاع المستضد ، باستخدام تقنية التخزين المؤقت والميكروويف ، التحسين لضمان تجريد الأجسام المضادة الكاملة والحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما الكواشف TSA ربط بشكل متناقض إلى المواقع المحيطة...

يمكن تعريف الإجهاض المتكرر (RM) بأنه فقدان حملين أو أكثر قبل 24 أسبوعا من الحمل1. هذه الحالة الإنجابية المتكررة تؤثر على ما يصل إلى 1٪ من الأزواج في جميع أنحاء العالم2،3. الفيزيولوجيا المرضية متعددة العوامل ويمكن تقسيمها إلى أسباب مدفوعة جنينيا (ويرجع ذلك أساسا إلى النمط الكاريوتيبي الجنيني غير طبيعي) والأسباب المدفوعة الأمهات التي تؤثر على بطانة الرحم و / أو نمو المشيمة. يمكن أن ينتج هذا المظهر عن التشوهات الوراثية الأبوية ، شذوذ الرحم ، الظروف البروتيمبوتيكية ، عوامل الغدد الصماء ، والاضطرابات المناعية4.
في السنوات الأخيرة، وقد تورط ضعف الخلايا المناعية التأثير في الإمراض من فقدان الحمل المبكر5. وقد ألهم هذا العديد من التحقيقات في توضيح مجموعات محددة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم خلال الدورة الشهرية، والزرع، والحمل المبكر، مع أدوار محددة في الحمل المبكر. من بين هذه الخلايا المناعية، تلعب خلايا القاتل الطبيعي الرحمي (uNK) دورا حاسما أثناء زرع الجنين والحمل، لا سيما في عمليات الغزو الأرومي الترموغي وتولد الأوعية6. وقد أظهرت الدراسات زيادة كثافة خلايا UNK في بطانة الرحم للنساء مع RM 7,8, علىالرغممن أن هذه النتيجة لم تكن مرتبطة بزيادة خطر الإجهاض9. ومع ذلك، حفز هذا البحث تقييم كثافة أنواع الخلايا المناعية الأخرى (مثل الضامة، والخلايا التغصن الرحمي) في بطانة الرحم في النساء مع RM10،11. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير المؤكد ما إذا كان هناك تغيير كبير في كثافة الخلايا المناعية في بطانة الرحم المحيطة بالزرع في النساء المصابات بجمهورية مقدونيا.
أحد التفسيرات المحتملة لعدم اليقين هو أن تقييم كثافة الخلايا المناعية بطانة الرحم قد يكون صعبا بسبب التغيرات السريعة في بطانة الرحم أثناء نافذة الزرع. خلال الإطار الزمني 24 ساعة, تغييرات كبيرة في بطانة الرحم تغيير كثافة الخلايا المناعية وإفراز السيتوكين, إدخال مصدر الاختلاف في هذه النتائج12. وبالإضافة إلى ذلك، تعتمد معظم التقارير أساسا على استخدام تلطيخ خلية واحدة (مثل الطرق التقليدية للHHC) التي لا يمكن فحص علامات متعددة على نفس القسم الأنسجة. على الرغم من أن قياس التدفق الخلوي يمكن استخدامه للكشف عن مجموعات خلايا متعددة في عينة واحدة ، إلا أن الكميات الكبيرة من الخلايا المطلوبة والتحسين الذي يستغرق وقتا طويلا يعيق شعبية وكفاءة هذه الطريقة. وبالتالي ، فإن التقدم الأخير في تلطيخ IHC متعددة يمكن أن يحل هذه المشكلة عن طريق وضع علامات متعددة على نفس الشريحة لتقييم معلمات متعددة ، بما في ذلك نسب الخلايا والتوطين النسيجي للتجمعات الفرعية المناعية الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التكنولوجيا تعظيم المعلومات التي تم الحصول عليها في حالة محدودية توافر الأنسجة. في نهاية المطاف، يمكن أن تساعد هذه التقنية في توضيح الاختلافات في تفاعلات الخلايا المناعية في بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء المصابات بجمهورية مقدونيا.
وتم تعيين مجموعتين من النساء من مستشفى أمير ويلز، بما في ذلك نساء مراقبة الخصوبة ونساء أجهضن بشكل متكرر غير مبرر. وعرفت السيطرة على الخصوبة بأنها النساء اللاتي أنجبن ولادة حية واحدة على الأقل دون أي تاريخ من الإجهاض التلقائي، وعرفت نساء جمهورية مقدونيا بأنهن أولئك اللاتي سبقهن أن أجهضن ≥2 حالة متتالية قبل الأسبوع العشرين من الحمل. واستوفيت المواد من المجموعتين معايير الإدراج التالية: (أ) العمر بين 20 و 42 سنة، (ب) غير المدخن، (ج) الدورة الشهرية العادية (25-35 يوما) وبنية الرحم العادية، (د) عدم استخدام أي نظام هرموني لمدة 3 أشهر على الأقل قبل خزعة بطانة الرحم، (ه) عدم وجود هيدروسالبينك عن طريق الهستيرو-سالبينجوغرام. وبالإضافة إلى ذلك، كان جميع المواضيع المعينة karyotyping العادي، طبيعي 3 الأبعاد السونوغرافيا الفائقة hysterosalpingogram، اليوم 2 هرمون تحفيز الجريب < 10 وحدة دولية / لتر، البروجسترون منتصف luteal > 30 نانومول / لتر، وظيفة الغدة الدرقية العادية، واختبار سلبي للذئبة المضادة للتخثر ومضادات الإيغ ديسيلبين IgG وIgM.
لفهم أفضل لأساس المناعة من RM، سيكون من المرغوب فيه للغاية لتحديد وترجمة أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في بطانة الرحم في وقت الزرع في وقت واحد. تصف هذه الورقة البروتوكول بأكمله من إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، يليه تحليل البيانات مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الورقة كيفية تحديد كثافة وتتجمع أنواع الخلايا المناعية في وقت واحد في بطانة الرحم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

الكيمياء المناعية هي الطريقة الأكثر استخداما لتحديد وتصور مستضدات الأنسجة في البحوث البيولوجية والتشخيص السريري. ويمكن استخدامه لوصف العمليات البيولوجية المختلفة أو الأمراض، مثل التئام الجروح، والاستجابة المناعية، ورفض الأنسجة، والتفاعلات بين الأنسجة والمواد الحيوية. ومع ذلك، فإن تصور وتكميم المستضدات المتعددة (خاصة للخلايا المناعية) في قسم واحد من الأنسجة باستخدام تلطيخ المناعة الكيميائية التقليدية (IHC) لا يزال غير مرض. ومن ثم، تم إدخال تقنيات متعددة العينات في السنوات الأخيرة لتحديد علامات بيولوجية متعددة في عينة نسيج واحدة أو مجموعة من عينات الأنسجة المختلفة. 
يمكن أن تكون هذه التقنيات مفيدة بشكل خاص في التفريق بين التغيرات في التفاعلات بين الخلايا المناعية داخل بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء اللواتي يجهضن المتكررة أثناء الزرع. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتلطيخ IHC الفلوري المتعدد الفلور للتحقيق في كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في وقت واحد في عينات بطانة الرحم في الوقت المحدد بدقة أثناء زرع الجنين. تتضمن الطريقة إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، تليها تحليل البيانات ، مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم. 
باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحليل كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في بطانة الرحم في وقت واحد في قسم واحد من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، ستناقش هذه الورقة العوامل الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتغلب على التداخل المحتمل للفلوروفور بين المسابير الفلورية التي يتم تطبيقها. والأهم من ذلك، يمكن أن تساعد نتائج تقنية تلطيخ متعددة المضاعفات هذه في توفير فهم متعمق للتفاعل المناعي والتنظيم أثناء زرع الجنين.

تظهر العملية التخطيطية الشاملة لإجراء فحص متعدد الألوان من 4 ألوان للكشف عن 4 أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في الشكل 1. باختصار، يتطلب بروتوكول تلطيخ المناعة المتعدد هذا 8 خطوات رئيسية: 1. إعداد الشريحة، 2. استرجاع Epitope، 3. الحجب، 4. تطبيق الأجسام المضادة الأولية، 5. تطبي...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

على الرغم من التقدم في الكيمياء المناعية المتعددة والتصوير متعدد الأطياف ، فإن توصيف كثافة وتتجمع الخلايا المناعية الرئيسية في وقت واحد في بطانة الرحم لا يزال يشكل تحديا. تصف هذه الورقة بروتوكول تلطيخ متعدد المضاعفات مفصل وتصوير للتوطين المتزامن لأربعة أنواع من الخلايا المناعية في بطانة الرحم.

تلطيخ الفلورسنت المناعي متعدد الخلايا المناعية من أربعة أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في الإجهاض المتكرر

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

التكنولوجيا الحالية تسمح باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت في نفس النوع للكشف عن ما يصل إلى سبع علامات. إثبات الإجراء سيكون لوسيا تشان، فني من المختبر. تبدأ بإعداد شرائح زجاجية ثابتة البارافين ثابتة المضمنة التي شنت مع عينة الأنسجة، عن طريق وضع الشرائح شقة في الفرن، لخبز في 60 درجة مئوية مع الأنسجة التي تواجه صعودا.بعد ساعة واحدة، إزالة الشمع وإعادة ترطيب الشرائح في كل 10 دقائق مع سلسلة من المواد الكيميائية، كما هو موضح في المخطوطة. غمر الشرائح في المالحة ثلاثية المخزنة مؤقتا، ومن ثم في مربع الشريحة البلاستيكية مليئة خليط من الفورمالديهايد المخفف في الميثانول، لإصلاح العينات. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين في ماء مأين لمدة دقيقتين.انتقل إلى استرجاع epitope، عن طريق وضع رف الشرائح في مربع مقاومة للحرارة مليئة عازلة حمض الستريك في درجة الحموضة 6.0. ثم وضع الصندوق في الميكروويف، لتسخين الشرائح أولا بقوة 100٪ لمدة 50 ثانية، تليها 20 دقيقة بقوة 20٪، للحفاظ على نفس درجة الحرارة. بعد شطف الشرائح في الماء المقطر، والغسيل مع TBST، تزج الشريحة في جرة تحتوي على محلول حجب البيروكسيد لمدة 10 دقائق.بعد الحضانة، شطف الشرائح في الماء المقطر وغسل مع TBST، ثم استخدام قلم حاجز مسعور لوضع علامة على الحدود حول قسم الأنسجة على الشريحة. ثم شطف الشريحة في TBST، وتغطية أقسام الأنسجة مع العازلة حجب واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 15 دقيقة. لإزالة الكواشف الحجب، أولا احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية ذات الفائدة، ومن ثم إزالة الأجسام المضادة الأولية عن طريق غسل الشرائح ثلاث مرات مع TBST، قبل الحضانة مع البوليمر الفجل peroxidase المسمى، الأجسام المضادة الثانوية.بعد الحضانة ، اغسل الشرائح قبل تطبيق نباتات Opal على حل عمل TSA ، ثم شطف الشريحة بحاجز استرداد المستضد. قم بإجراء التجريد القائم على الميكروويف عن طريق تسخين الشرائح في مخزن استرجاع المستضد في ميكروويف بقوة 100٪، لمدة 50 ثانية، يليه 20٪ طاقة لمدة 20 دقيقة في حاويات الميكروويف الآمنة. بعد تبريد العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، شطف الشرائح في الماء المقطر وTBST واحتضان في وقت لاحق مع محلول دابي لمدة خمس دقائق.ثم الهواء الجاف الشريحة قبل تصاعد مع المتوسطة تركيب المناسبة. قبل تصوير الشرائح مسبقا، يتم ضبط عوامل التصفية المناسبة في محطة العمل. التقاط ما لا يقل عن 10 حقول للتحليل تحت التكبير 200 مرة.لحساب الخلايا، انقر فوق زر عدد الكائنات في شريط الخطوة، لعرض لوحة إعدادات عد الكائنات. إذا تم تقسيم الأنسجة، حدد فئة الأنسجة التي يمكن العثور على الكائنات فيها. ثم حدد الإشارة المطلوبة من مقياس تلقائي أو مقياس ثابت.لتقسيم الكائن، حدد المكون الأساسي من القائمة المنسدلة. للكشف عن الكائنات التي تلمس كائنات أخرى ككائنات فردية وغير مجمعة، تحقق من الحد الأقصى لحجم مربع وبكسل ثم اختر تقسيم المكرر. بعد ذلك، عد جميع الخلايا اللحمية في الخلايا المناعية بشكل منفصل، للتعبير عن البيانات كنسب مئوية من الخلايا المناعية بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا سترومال لكل صورة القبض.في وقت لاحق، تقرير عدد الخلايا النهائي كمتوسط لكافة الحقول. باستخدام محرر طريقة العرض، قم بفحص جداول البيانات الناتجة بعد المعالجة ثم قم بتصدير جدول بيانات العد. في التحليل التمثيلي، أربعة أنواع من الخلايا المناعية في عينة بطانة الرحم نحن متمايزون.تظهر الصورة المعالجة تقسيم الأنسجة كمقصورات ظهارية وسترومية. تم إجراء الإصابة بأمراض مناعة متعددة على خزعات بطانة الرحم من امرأة مراقبة خصبة وامرأة مع إجهاض متكرر غير مبرر ، تم الكشف عن طابق واحد بالنسبة لنا يمثل CD3 و CD56 و CD68 و CD20 في التخميد المناعي. بمجرد تحديد الصوت المناعي ، يمكن أن يساعد المزيد من التلطيخ تحت السيتوكين في معالجة تفاعلهم وآلية نجاح الزرع.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

إعداد 2 - dGuo المعاملة الثقافات الجهاز الغدة الصعترية

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

كله يشن التحليل المناعى للالجنينية الاطراف الأوعية الدموية الجلدية : نظام نموذجي لدراسة الأوعية الدموية المتفرعة التشكل في الأجنة

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

الفصل بين أنواع الخلايا المنوية عن طريق STA-PUT سرعة الترسيب

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...