Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund i 2018 og Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

Undersøgelsen blev godkendt af Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Informeret samtykke blev indhentet fra deltagerne, før de indsamlede endometriebiopsier. Se introduktionsafsnittet for integrationskriterier for kontrol- og RM-grupperne.
1. Prøveforberedelse
<ol><li>Sørg for, at alle kvinder i denne undersøgelse gennemgår en daglig urin dipstick test fra dag 9 af menstruationscyklus og fremefter for at identificere lute...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+uterine+natural+killer+(uNK)+cell+measurements+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+reproductive+failure.">Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure.</a> Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXA-10+and+E-cadherin+expression+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+implantation+failure+and+recurrent+miscarriage.">HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+the+measurement+of+uterine+natural+killer+cells+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+miscarriage.">Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).</li><li>Jasper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+LIF+and+IL1B+regulate+alpha(1,2)fucosyltransferase+2+(Fut2)+expression+in+mouse+uterine+epithelial+cells+during+early+pregnancy.">Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy.</a> Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).</li><li>Kopcow, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen Det er vigtigt at bemærke, at multiplex farvning kræver omhyggelig optimering. Antigen hentning, ved hjælp af citrat buffer og mikrobølge teknologi, kræver optimering for at sikre fuldstændig antistof stripning og opretholde væv levedygtighed. Da TSA-reagenser kovalent binder sig til steder omkring antigen, kan de potentielt hæmme bindingen af et efterfølgende primært antistof gennem sterisk hindring (også kendt som "paraplyeffekten"). Dette har tendens til at fo...

Tilbagevendende abort (RM) kan defineres som tab af to eller flere graviditeter før 24 ugers svangerskab1. Denne hyppige reproduktive tilstand påvirker op til 1% af par på verdensplan2,3. Patofysiologien er multifaktoriel og kan opdeles i embryologisk drevne årsager (primært på grund af en unormal embryonal karyotype) og maternally drevne årsager, der påvirker endometrium og / eller placental udvikling. Denne manifestation kan skyldes forældrenes genetiske abnormiteter, livmoderanomalier, prothrombotiske tilstande, endokrinologiske faktorer og immunologiske lidelser4.
I de senere år har immuneffektorcelledysfunktion været impliceret i patogenesen af tidlig graviditetstab5. Dette har inspireret mange undersøgelser af belyse de specifikke populationer af immunceller i endometriet under menstruationscyklus, implantation, og tidlig graviditet, med specifikke roller i den tidlige graviditet. Blandt disse immunceller spiller livmoder naturlige dræber (uNK) celler en afgørende rolle under embryoimplantation og graviditet, især i processerne for trofoblastic invasion og angiogenese6. Undersøgelser har vist en øget uNK-celletæthed i endometriet hos kvinder med RM7,8, selv om dette fund ikke var forbundet med en øget risiko for abort9. Dette stimulerede imidlertid forskning, der evaluerede tætheden af andre immuncelletyper (såsom makrofager, livmoderdendritiske celler) i endometriet hos kvinder med RM10,11. Ikke desto mindre er det fortsat usikkert, om der er en signifikant ændring i immuncelletætheden i peri-implantation endometrium hos kvinder med RM.
En mulig forklaring på usikkerheden er, at det kan være vanskeligt at vurdere den endometriske immuncelletæthed på grund af de hurtige ændringer i endometriet under implantationsvinduet. I løbet af 24 timers tidsrammen ændrer signifikante ændringer i endometrium immuncelletætheden og cytokinsekretionen, hvilket introducerer en kilde til variation i disse resultater12. Derudover er de fleste rapporter hovedsageligt afhængige af brugen af enkeltcellet farvning (f.eks. traditionelle IHC-metoder), der ikke kunne undersøge flere markører på samme vævssektion. Selvom flowcytometri kan bruges til at detektere flere cellepopulationer i en enkelt prøve, forhindrer de store mængder celler, der kræves, og den tidskrævende optimering populariteten og effektiviteten af denne metode. Derfor kan den seneste udvikling i multiplex IHC farvning løse dette problem ved at immunstaine flere markører på samme dias til at evaluere flere parametre, herunder celle afstamning og histologisk lokalisering af individuelle immun subpopulationer. Desuden kan denne teknologi maksimere de oplysninger, der opnås i tilfælde af begrænset væv tilgængelighed. I sidste ende kan denne teknik hjælpe med at belyse forskellene i immuncelleinteraktioner i endometriet mellem frugtbare kvinder og kvinder med RM.
To grupper af kvinder blev rekrutteret fra Prince of Wales Hospital, herunder frugtbare kontrol kvinder (FC) og kvinder med uforklarlige tilbagevendende abort (RM). Frugtbar kontrol blev defineret som kvinder, der havde mindst én levende fødsel uden nogen historie af spontan abort, og RM kvinder blev defineret som dem, der havde en historie af ≥2 på hinanden følgende aborter før 20 uger svangerskab. Forsøgspersonerne fra de to grupper opfyldte følgende inklusionskriterier: a) alder mellem 20 og 42 år, b) ikke-ryger, c) regelmæssig menstruationscyklus (25-35 dage) og normal livmoderstruktur, d) ingen brug af hormonelt regime i mindst 3 måneder før endometriebiopsi, (e) ingen hydrosalpinx ved hystero-salpingogram. Derudover havde alle de rekrutterede forsøgspersoner normal karyotyping, normal 3-dimensionel ultrasonografihysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerende hormon < 10 IE/L, mellem luteal progesteron > 30 nmol/L, normal skjoldbruskkirtelfunktion og testet negativ for lupus antikkoagulant og antikardiolipin IgG- og IgM-antistoffer.
For bedre at forstå rm's immunologiske grundlag ville det være mest ønskeligt samtidig at kvantificere og lokalisere de store immuncelletyper, der findes i endometriet på implantationstidspunktet. Dette papir beskriver hele protokollen fra prøveforberedelse, multiplexoptimering med markører for immuncelleundertyper og scanning af diasene efterfulgt af dataanalyse med specifik henvisning til detektering af endometrieimmunceller. Desuden beskriver dette papir, hvordan man bestemmer tætheden og klyngedannelsen af immuncelletyperne samtidigt i endometriet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

Immunohistochemistry er den mest anvendte metode til identifikation og visualisering af vævsantigener i biologisk forskning og klinisk diagnostik. Det kan bruges til at karakterisere forskellige biologiske processer eller patologier, såsom sårheling, immunrespons, væv afvisning, og væv-biomateriale interaktioner. Visualiseringen og kvantificeringen af flere antigener (især for immunceller) i en enkelt vævssektion ved hjælp af konventionel immunhistokemisk (IHC) farvning er dog fortsat utilfredsstillende. Derfor blev multiplexed teknologier indført i de seneste år for at identificere flere biologiske markører i en enkelt vævsprøve eller et ensemble af forskellige vævsprøver. 
Disse teknologier kan især være nyttige til at differentiere ændringerne i immuncelle-til-celle interaktioner inden for endometriet mellem frugtbare kvinder og kvinder med tilbagevendende aborter under implantation. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for multiplexed fluorescens IHC farvning til at undersøge tætheden og klyngedannelse af fire store immuncelletyper samtidigt i præcist timede endometrieprøver under embryo implantation. Metoden omfatter prøveforberedelse, multiplexoptimering med markører for immuncelleundertyper og scanning af diasene efterfulgt af dataanalyse med særlig henvisning til detektering af endometrieimmunceller. 
Ved hjælp af denne metode kan tætheden og klyngedannelsen af fire store immuncelletyper i endometriet samtidig analyseres i en enkelt vævssektion. Derudover vil dette papir diskutere de kritiske faktorer og fejlfinding for at overvinde mulig fluorophore interferens mellem de fluorescerende sonder, der anvendes. Vigtigere er det, at resultaterne fra denne multiplex farvningsteknik kan hjælpe med at give en dybdegående forståelse af den immunologiske interaktion og regulering under embryoimplantatering.

Den overordnede skematiske proces med at udføre en 4-farve multiplex assay til påvisning af 4 endometrie immuncelletyper er vist i figur 1. Kort sagt krævede protokollen for denne multiplex immunofluorescence farvning 8 nøgletrin: 1. Slidepræparat, 2. Epitop hentning, 3. Blokering, 4. Primær antistofapplikation, 5. Sekundær antistofapplikation, 6. Signalforstærkning, 7. Fjernelse af antistof og 8. Counterstain og mount. Billedgengivelse og -analyse blev derefter udført ved hjælp af...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

På trods af fremskridt i multiplex immunohistochemistry og multispektral billeddannelse, karakterisere tætheden og klyngedannelse af store immunceller samtidigt i endometriet er fortsat en udfordring. Dette papir beskriver en detaljeret multiplex farvning protokol og billeddannelse for samtidig lokalisering af fire immuncelletyper i endometriet.

Multiplexed fluorescerende immunohistokemisk farvning af fire endometrie immuncelletyper i tilbagevendende abort

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

Den nuværende teknologi gør det muligt at anvende antistof, der er opdrættet i samme art til påvisning af op til syv markører. Demonstrere proceduren vil være Loucia Chan, en tekniker fra laboratoriet. Begynd med at forberede formalin fast paraffin indlejret glas dias monteret med vævsprøven, ved at placere dias fladt i en ovn, at bage ved 60 grader celsius med vævet vender opad.Efter en time, de-voks og rehydrere dias pr 10 minutter hver med serien af kemikalier, som beskrevet i manuskriptet. Dyk dias i tris-buffered saltvand, og derefter i en plastik slide boks fyldt med en blanding af formaldehyd fortyndet i methanol, at fastsætte prøverne. Vask derefter diasene to gange i deioniseret vand i to minutter.Fortsæt til epitop hentning, ved at placere rack af dias i en varmebestandig boks fyldt med citronsyre buffer på pH 6.0. Og derefter placere kassen i mikrobølgeovnen, at opvarme dias først på 100% strøm i 50 sekunder, efterfulgt af 20 minutter ved 20% strøm, for at opretholde den samme temperatur. Efter skylning af diasene i destilleret vand og vask med TBST nedsænkes rutsjebanen i en krukke, der indeholder en peroxidationsblokerende opløsning i 10 minutter.Efter inkubationen skylles diasene i destilleret vand og vaskes med TBST, og brug derefter en hydrofob barrierepen til at markere en grænse omkring vævssektionen på diaset. Skyl derefter diaset i TBST, dæk vævssektionerne med blokeringsbufferen og inkuberes diasene i et befugtet kammer i 15 minutter. For at fjerne de blokerende reagenser skal du først inkubere diasene med det primære antistof af interesse og derefter fjerne det primære antistof ved at vaske dias tre gange med TBST, før inkubation med polymer peberrod peroxidase mærket, sekundært antistof.Efter inkubationen vaskes diasene, før opal floraen påføres TSA-arbejdsopløsningen, og skyl derefter diaset med antigenudtagningsbufferen. Udfør den mikrobølgebaserede stripning ved at opvarme diasene i antigenudtagningsbufferen i en mikrobølgeovn ved 100 % strøm i 50 sekunder efterfulgt af 20 % strøm i 20 minutter i mikrobølgesikre beholdere. Efter afkøling af prøverne ved stuetemperatur i 15 minutter skylles lysbillederne i destilleret vand og TBST, og inkuberes senere med dappyopløsning i fem minutter.Luft derefter diaset, før du monterer med det relevante monteringsmedium. Før du imaging af dias forudindstille de relevante filtre i arbejdsstationen. Fang mindst 10 felter til analyse under 200 gange forstørrelse.Hvis du vil tælle cellerne, skal du klikke på knappen Tælleobjekter på trinlinjen for at få vist panelet indstillinger for objektoptælling. Hvis vævet er segmenteret, skal du vælge den vævskategori, hvor objekterne skal findes. Vælg derefter den ønskede signalskalering fra automatisk skalering eller fast skala.I områdevising af objekter skal du vælge den primære komponent på rullelisten. Hvis du vil registrere objekter, der berører andre objekter som individuelle og ikke kombinerede objekter, skal du markere boksen maksimal størrelse og pixel og derefter vælge den raffinerede opdeling. Derefter tælle alle stromale celler i immuncellerne separat, at udtrykke data som procentdele af immuncellerne i forhold til det samlede antal stromale celler for hvert fanget billede.Senere skal du rapportere det endelige celleantal som et gennemsnit af alle felter. Undersøg de resulterende datatabeller efter behandling ved hjælp af visningseditoren, og eksporter derefter tabellen medoptællingsdata. I den repræsentative analyse, fire immuncelletyper i endometriumprøven, er vi differentierede.Det behandlede billede viser væv segmentering som epitel, og stromal rum. Multipelx immunstaining blev udført på endometriebiopsier fra en frugtbar kontrol kvinde og en kvinde med uforklarlige tilbagevendende abort, enkelt etage for os, der repræsenterer CD3, CD56, CD68, og CD20 blev afsløret i immunstainning. Når immunlyden er blevet identificeret, yderligere farvning under cytokin kan bidrage til at løse deres interaktion og mekanisme for implantation succes.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse af enkeltcelle-gentransskription ved RNA Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Adskillelse af modningshæmning Cell Typer Brug STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerende proteiner for Multipleksede Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantificering af Protein Expression og Co-lokalisering Brug Multiplexed immunhistokemisk farvede og Multispektral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Udvikling af en Insert Co-kultur System af to Cellular typer i fravær af celle-celle-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering og transkriptomanalyse af plantecelletyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering af pattedyrs zinktransportører ved hjælp af et in vitro zinktransportassay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...