Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund in 2018 en het Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

De studie werd goedgekeurd door de Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de deelnemers voordat de endometriumbiopten werden verzameld. Raadpleeg het introductiegedeelte voor de inclusiecriteria van de controle- en RM-groepen.
1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Zorg ervoor dat alle vrouwen in deze studie een dagelijkse urinepeilstoktest ondergaan vanaf dag 9 van de menstruatiecyclus om ...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+uterine+natural+killer+(uNK)+cell+measurements+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+reproductive+failure.">Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure.</a> Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXA-10+and+E-cadherin+expression+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+implantation+failure+and+recurrent+miscarriage.">HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+the+measurement+of+uterine+natural+killer+cells+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+miscarriage.">Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).</li><li>Jasper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+LIF+and+IL1B+regulate+alpha(1,2)fucosyltransferase+2+(Fut2)+expression+in+mouse+uterine+epithelial+cells+during+early+pregnancy.">Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy.</a> Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).</li><li>Kopcow, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Kritieke stappen binnen het protocol Het is belangrijk op te merken dat multiplexkleuring ijverige optimalisatie vereist. Antigeenherstel, met behulp van citraatbuffer- en microgolftechnologie, vereist optimalisatie om volledige antilichaamstripping te garanderen en de levensvatbaarheid van weefsel te behouden. Omdat TSA-reagentia covalent binden aan plaatsen rond het antigeen, kunnen ze mogelijk de binding van een volgend primair antilichaam remmen door sterische belemmering (ook bekend als het "para...

Terugkerende miskraam (RM) kan worden gedefinieerd als het verlies van twee of meer zwangerschappen vóór 24 weken zwangerschap1. Deze frequente reproductieve aandoening treft tot 1% van de paren wereldwijd2,3. De pathofysiologie is multifactorieel en kan worden onderverdeeld in embryologisch gedreven oorzaken (voornamelijk als gevolg van een abnormaal embryonaal karyotype) en maternale oorzaken die het endometrium en / of placenta-ontwikkeling beïnvloeden. Deze manifestatie kan het gevolg zijn van ouderlijke genetische afwijkingen, baarmoederafwijkingen, protrombotische aandoeningen, endocrinologische factoren en immunologische aandoeningen4.
In de afgelopen jaren is immuuneffectorceldisfunctie betrokken geweest bij de pathogenese van vroeg zwangerschapsverlies5. Dit heeft veel onderzoeken geïnspireerd naar het ophelderen van de specifieke populaties van immuuncellen in het baarmoederslijmvlies tijdens de menstruatiecyclus, implantatie en vroege zwangerschap, met specifieke rollen in de vroege zwangerschap. Onder deze immuuncellen spelen baarmoeder natural killer (uNK) cellen een cruciale rol tijdens embryo-implantatie en zwangerschap, met name in de processen van trofoblastische invasie en angiogenese6. Studies hebben een verhoogde uNK-celdichtheid aangetoond in het endometrium van vrouwen met RM7,8, hoewel deze bevinding niet geassocieerd was met een verhoogd risico op een miskraam9. Dit stimuleerde echter onderzoek naar de dichtheid van andere immuunceltypen (zoals macrofagen, baarmoederdendritische cellen) in het endometrium bij vrouwen met RM10,11. Niettemin blijft het onzeker of er een significante verandering is in de immuunceldichtheid in het peri-implantatie endometrium bij vrouwen met RM.
Een mogelijke verklaring voor de onzekerheid is dat evaluatie van de endometrium immuunceldichtheid moeilijk kan zijn vanwege de snelle veranderingen in het endometrium tijdens het venster van implantatie. Gedurende het tijdsbestek van 24 uur veranderen significante veranderingen in het endometrium de immuunceldichtheid en cytokinecretie, waardoor een bron van variatie in deze resultaten wordt geïntroduceerd12. Bovendien vertrouwen de meeste rapporten voornamelijk op het gebruik van eencellige kleuring (bijv. Traditionele IHC-methoden) die niet meerdere markers op hetzelfde weefselgedeelte konden onderzoeken. Hoewel flowcytometrie kan worden gebruikt voor het detecteren van meerdere celpopulaties in een enkel monster, belemmeren de grote hoeveelheden cellen die nodig zijn en de tijdrovende optimalisatie de populariteit en efficiëntie van deze methode. Vandaar dat de recente vooruitgang in multiplex IHC-kleuring dit probleem zou kunnen oplossen door meerdere markers op dezelfde dia te immunostainen om meerdere parameters te evalueren, waaronder cellijn en histologische lokalisatie van individuele immuunsubpopulaties. Verder kan deze technologie de verkregen informatie maximaliseren in geval van beperkte beschikbaarheid van weefsel. Uiteindelijk kan deze techniek helpen bij het ophelderen van de verschillen in immuuncelinteracties in het baarmoederslijmvlies tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met RM.
Twee groepen vrouwen werden gerekruteerd uit het Prince of Wales Hospital, waaronder vruchtbare controlevrouwen (FC) en vrouwen met onverklaarbare terugkerende miskraam (RM). Vruchtbare controle werd gedefinieerd als vrouwen die ten minste één levende geboorte hadden zonder enige geschiedenis van spontane miskraam, en RM-vrouwen werden gedefinieerd als degenen die een voorgeschiedenis hadden van ≥2 opeenvolgende miskramen vóór 20 weken zwangerschap. De proefpersonen uit de twee groepen voldeden aan de volgende inclusiecriteria: (a) leeftijd tussen 20 en 42 jaar oud, (b) niet-roker, (c) regelmatige menstruatiecyclus (25-35 dagen) en normale baarmoederstructuur, (d) geen gebruik van een hormonaal regime gedurende ten minste 3 maanden vóór de endometriumbiopsie, (e) geen hydrosalpinx door hystero-salpingogram. Bovendien hadden alle gerekruteerde proefpersonen normale karyotypering, normaal 3-dimensionaal echografie hysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerend hormoon < 10 IE / L, mid-luteale progesteron > 30 nmol / L, normale schildklierfunctie en negatief getest op lupus anticoagulantia en anticardiolipine IgG- en IgM-antilichamen.
Om de immunologische basis van RM beter te begrijpen, zou het het meest wenselijk zijn om tegelijkertijd de belangrijkste immuunceltypen die aanwezig zijn in het endometrium op het moment van implantatie te kwantificeren en te lokaliseren. Dit artikel beschrijft het volledige protocol van monstervoorbereiding, de multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia's, gevolgd door gegevensanalyse met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen. Bovendien beschrijft dit artikel hoe de dichtheid en clustering van de immuunceltypen tegelijkertijd in het endometrium kunnen worden bepaald.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

Immunohistochemie is de meest gebruikte methode voor de identificatie en visualisatie van weefselantigenen in biologisch onderzoek en klinische diagnostiek. Het kan worden gebruikt om verschillende biologische processen of pathologieën te karakteriseren, zoals wondgenezing, immuunrespons, weefselafstoting en weefsel-biomateriaalinteracties. De visualisatie en kwantificering van meerdere antigenen (vooral voor immuuncellen) in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele immunohistochemische (IHC) kleuring blijft echter onbevredigend. Vandaar dat de afgelopen jaren multiplextechnologieën zijn geïntroduceerd om meerdere biologische markers te identificeren in een enkel weefselmonster of een ensemble van verschillende weefselmonsters. 
Deze technologieën kunnen vooral nuttig zijn bij het differentiëren van de veranderingen in immuuncel-cel-naar-cel interacties binnen het endometrium tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met terugkerende miskramen tijdens implantatie. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor multiplexed fluorescentie IHC-kleuring om de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen tegelijkertijd te onderzoeken in nauwkeurig getimede endometriummonsters tijdens embryo-implantatie. De methode omvat monstervoorbereiding, multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia's, gevolgd door gegevensanalyse, met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen. 
Met behulp van deze methode kunnen de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen in het endometrium tegelijkertijd worden geanalyseerd in een enkele weefselsectie. Daarnaast zal dit artikel de kritieke factoren en probleemoplossing bespreken om mogelijke fluorofoorinterferentie tussen de fluorescerende sondes die worden toegepast te overwinnen. Belangrijk is dat de resultaten van deze multiplexkleuringstechniek kunnen helpen een diepgaand inzicht te krijgen in de immunologische interactie en regulatie tijdens embryo-implantatie.

Het algemene schematische proces van het uitvoeren van een 4-kleuren multiplextest voor de detectie van 4 endometriumimmuunceltypen is weergegeven in figuur 1. Kortom, het protocol voor deze multiplex immunofluorescentiekleuring vereiste 8 belangrijke stappen: 1. Diavoorbereiding, 2. Epitoop ophalen, 3. Blokkeren, 4. Primaire antilichaamtoepassing, 5. Secundaire antilichaamtoepassing, 6. Signaalversterking, 7. Verwijdering van antilichamen en 8. Counterstain en mount. Beeldweergave en -analy...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Ondanks de vooruitgang in multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming, blijft het karakteriseren van de dichtheid en clustering van belangrijke immuuncellen tegelijkertijd in het endometrium een uitdaging. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd multiplexkleuringsprotocol en beeldvorming voor de gelijktijdige lokalisatie van vier immuunceltypen in het endometrium.

Gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring van vier endometriumimmuunceltypen bij terugkerende miskraam

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

De huidige technologie maakt het gebruik van antilichamen in dezelfde soort mogelijk voor het detecteren van maximaal zeven markers. De procedure wordt gedemonstreerd door Loucia Chan, een technicus van het laboratorium. Begin met het voorbereiden van de formaline-gefixeerde paraffine ingebedde glazen dia's gemonteerd met het weefselmonster, door de dia's plat in een oven te plaatsen, om te bakken op 60 graden Celsius met het weefsel naar boven gericht.Na een uur ontwas en rehydrateer de dia's per 10 minuten elk met de reeks chemicaliën, zoals beschreven in het manuscript. Dompel de dia's onder in tris-gebufferde zoutoplossing en vervolgens in een plastic diadoos gevuld met een mengsel van formaldehyde verdund in methanol, om de monsters te fixeren. Was vervolgens de glaasjes twee keer in gedeïoniseerd water gedurende twee minuten.Ga verder met het ophalen van epitoop door het rek met dia's in een hittebestendige doos gevuld met citroenzuurbuffer bij pH 6,0 te plaatsen. En dan de doos in de magnetron plaatsen, om de dia's eerst 50 seconden op 100% vermogen te verwarmen, gevolgd door 20 minuten op 20% vermogen, om dezelfde temperatuur te behouden. Na het spoelen van de glaasjes in gedestilleerd water en het wassen met TBST, dompel je de glaasjes gedurende 10 minuten onder in een pot met een peroxidatieblokkerende oplossing.Spoel na de incubatie de glaasjes in gedestilleerd water en was met TBST en gebruik vervolgens een hydrofobe barrièrepen om een grens rond het weefselgedeelte op de dia te markeren. Spoel vervolgens de dia af in TBST, bedek de weefselsecties met de blokkerende buffer en incubeer de dia's gedurende 15 minuten in een bevochtigde kamer. Om de blokkerende reagentia te verwijderen, incubeert u eerst de dia's met het primaire antilichaam van belang en verwijdert u vervolgens het primaire antilichaam door de dia's driemaal te wassen met TBST, vóór incubatie met het polymeer mierikswortelperoxidase gelabeld, secundair antilichaam.Was na de incubatie de dia's voordat u de opaalflora voor TSA-werkoplossing aanbrengt en spoel de dia vervolgens af met de antigeenophaalbuffer. Voer de op microgolven gebaseerde stripping uit door de dia's in antigeenherstelbuffer in een magnetron te verwarmen op 100% vermogen, gedurende 50 seconden, gevolgd door 20% stroom gedurende 20 minuten in de magnetronveilige containers. Na het afkoelen van de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, spoel de glaasjes in gedestilleerd water en TBST en incubeer later gedurende vijf minuten met dappy oplossing.Droog vervolgens de schuif aan de lucht voordat u deze monteert met het juiste montagemedium. Voordat u de dia's afbeeldt, worden de juiste filters in het werkstation ingesteld. Leg minimaal 10 velden vast voor analyse onder 200 keer vergroting.Als u de cellen wilt tellen, klikt u op de knop Objecten tellen in de stappenbalk om het deelvenster instellingen voor het tellen van objecten weer te geven. Als het weefsel is gesegmenteerd, selecteert u de weefselcategorie waarin de objecten zich bevinden. Selecteer vervolgens de gewenste signaalschaling uit auto-scale of fixed scale.Voor objectsegmentatie selecteert u de primaire component in de vervolgkeuzelijst. Als u wilt detecteren dat objecten andere objecten aanraken als afzonderlijke en niet-gecombineerde objecten, vinkt u het selectievakje Maximale grootte en pixels aan en kiest u vervolgens voor de verfijnde splitsing. Tel vervolgens alle stromale cellen in de immuuncellen afzonderlijk, om de gegevens uit te drukken als de percentages van de immuuncellen ten opzichte van het totale aantal stromale cellen voor elk vastgelegd beeld.Rapporteer later het uiteindelijke celgetal als een gemiddelde van alle velden. Bekijk met behulp van de weergave-editor de resulterende gegevenstabellen nabewerking en exporteer vervolgens de tabel met telgegevens. In de representatieve analyse, vier immuunceltypen in het endometriummonster, zijn we gedifferentieerd.De bewerkte afbeelding toont weefselsegmentatie als epitheliale en stromale compartimenten. De multiplex immunostaining werd uitgevoerd op de endometriumbiopten van een vruchtbare controlevrouw en een vrouw met onverklaarbare terugkerende miskraam, enkele vloer voor ons die CD3, CD56, CD68 en CD20 vertegenwoordigde, werden onthuld in de immunostaining. Zodra het immuungeluid is geïdentificeerd, kan verdere kleuring onder het cytokine helpen om hun interactie en mechanisme voor implantatiesucces aan te pakken.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Scheiding van spermatogene Cell typen met behulp van STA-PUT Velocity Sedimentatie

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering van zinktransporters bij zoogdieren met behulp van een in-vitro-zinktransporttest

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...