Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
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Cette étude a été soutenue par le Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund en 2018 et le Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche clinique du cluster Co chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster. Le consentement éclairé des participants a été obtenu avant de prélever les biopsies de l’endomètre. Reportez-vous à la section d’introduction pour connaître les critères d’inclusion des groupes témoin et RM.
1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Assurez-vous que toutes les femmes de cette étude subissent un test...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. 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Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Étapes critiques du protocole Il est important de noter que la coloration multiplex nécessite une optimisation diligente. La récupération d’antigènes, à l’aide de la technologie du tampon de citrate et des micro-ondes, nécessite une optimisation pour assurer un décapage complet des anticorps et maintenir la viabilité des tissus. Comme les réactifs de la TSA se lient de manière covalente aux sites entourant l’antigène, ils peuvent potentiellement inhiber la liaison d’un anticorps pr...

Une fausse couche récurrente (RM) peut être définie comme la perte de deux grossesses ou plus avant 24 semaines de gestation1. Cette condition de reproduction fréquente affecte jusqu’à 1% des couples dans le monde2,3. La physiopathologie est multifactorielle et peut être divisée en causes embryologiques (principalement dues à un caryotype embryonnaire anormal) et causes maternelles qui affectent l’endomètre et / ou le développement placentaire. Cette manifestation peut résulter d’anomalies génétiques parentales, d’anomalies utérines, de conditions prothrombotiques, de facteurs endocrinologiques et de troubles immunologiques4.
Ces dernières années, un dysfonctionnement des cellules effectrices immunitaires a été impliqué dans la pathogenèse de la perte de grossesse précoce5. Cela a inspiré de nombreuses recherches pour élucider les populations spécifiques de cellules immunitaires dans l’endomètre pendant le cycle menstruel, l’implantation et le début de la grossesse, avec des rôles spécifiques en début de grossesse. Parmi ces cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles utérines (uNK) jouent un rôle essentiel lors de l’implantation embryonnaire et de la grossesse, en particulier dans les processus d’invasion trophoblastique et d’angiogenèse6. Des études ont montré une augmentation de la densité cellulaire uNK dans l’endomètre des femmes atteintes de RM7,8, bien que cette découverte n’ait pas été associée à un risque accru de fausse couche9. Cependant, cela a stimulé la recherche évaluant la densité d’autres types de cellules immunitaires (telles que les macrophages, les cellules dendritiques utérines) dans l’endomètre chez les femmes atteintes de RM10,11. Néanmoins, il n’est pas certain qu’il y ait une altération significative de la densité des cellules immunitaires dans l’endomètre péri-implantatoire chez les femmes atteintes de RM.
Une explication possible de l’incertitude est que l’évaluation de la densité des cellules immunitaires de l’endomètre pourrait être difficile en raison des changements rapides dans l’endomètre pendant la fenêtre d’implantation. Au cours de la période de 24 heures, des changements importants dans l’endomètre modifient la densité des cellules immunitaires et la sécrétion de cytokines, introduisant une source de variation dans ces résultats12. De plus, la plupart des rapports reposent principalement sur l’utilisation de la coloration unicellulaire (p. ex., les méthodes traditionnelles de LSI) qui ne pouvaient pas examiner plusieurs marqueurs sur la même section de tissu. Bien que la cytométrie en flux puisse être utilisée pour détecter plusieurs populations cellulaires dans un seul échantillon, les grandes quantités de cellules nécessaires et l’optimisation fastidieuse entravent la popularité et l’efficacité de cette méthode. Par conséquent, les progrès récents dans la coloration multiplexE de l’IHC pourraient résoudre ce problème en immunocolorant plusieurs marqueurs sur la même diapositive pour évaluer plusieurs paramètres, y compris la lignée cellulaire et la localisation histologique de sous-populations immunitaires individuelles. De plus, cette technologie peut maximiser les informations obtenues en cas de disponibilité limitée des tissus. En fin de compte, cette technique peut aider à élucider les différences dans les interactions des cellules immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes atteintes de RM.
Deux groupes de femmes ont été recrutés à l’Hôpital Prince of Wales, y compris les femmes témoins fertiles (FC) et les femmes ayant une fausse couche récurrente inexpliquée (RM). Le contrôle fertile a été défini comme les femmes qui avaient au moins une naissance vivante sans antécédents de fausse couche spontanée, et les femmes RM ont été définies comme celles qui avaient des antécédents de ≥2 fausses couches consécutives avant 20 semaines de gestation. Les sujets des deux groupes répondaient aux critères d’inclusion suivants : (a) âge entre 20 et 42 ans, (b) non-fumeur, (c) cycle menstruel régulier (25-35 jours) et structure utérine normale, (d) pas d’utilisation d’un régime hormonal pendant au moins 3 mois avant la biopsie de l’endomètre, (e) pas d’hydrosalpinx par hystéro-salpingogramme. En outre, tous les sujets recrutés avaient un caryotypage normal, une échographie 3 dimensions normale, un hystérosalpingographie en 3 dimensions, une hormone folliculo-stimulante du jour 2 < 10 UI / L, une progestérone mi-lutéale > 30 nmol / L, une fonction thyroïdienne normale et des anticorps anticoagulants lupiques et anticorps IgG et IgM anticardiolipine.
Pour mieux comprendre la base immunologique de la RM, il serait plus souhaitable de quantifier et de localiser simultanément les principaux types de cellules immunitaires présentes dans l’endomètre au moment de l’implantation. Cet article décrit l’ensemble du protocole, de la préparation des échantillons à l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et au balayage des lames, suivi de l’analyse des données avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre. De plus, cet article décrit comment déterminer la densité et le regroupement des types de cellules immunitaires simultanément dans l’endomètre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

L’immunohistochimie est la méthode la plus couramment utilisée pour l’identification et la visualisation des antigènes tissulaires dans la recherche biologique et le diagnostic clinique. Il peut être utilisé pour caractériser divers processus biologiques ou pathologies, tels que la cicatrisation des plaies, la réponse immunitaire, le rejet tissulaire et les interactions tissu-biomatériau. Cependant, la visualisation et la quantification de plusieurs antigènes (en particulier pour les cellules immunitaires) dans une seule section de tissu à l’aide d’une coloration immunohistochimique conventionnelle (IHC) restent insatisfaisantes. Par conséquent, des technologies multiplexées ont été introduites ces dernières années pour identifier plusieurs marqueurs biologiques dans un seul échantillon de tissu ou un ensemble d’échantillons de tissus différents. 
Ces technologies peuvent être particulièrement utiles pour différencier les changements dans les interactions cellules-à-cellule immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes ayant des fausses couches récurrentes pendant l’implantation. Cet article décrit un protocole détaillé pour la coloration IHC par fluorescence multiplexée afin d’étudier la densité et le regroupement simultanément de quatre principaux types de cellules immunitaires dans des échantillons d’endomètre chronométrés avec précision lors de l’implantation d’embryons. La méthode comprend la préparation des échantillons, l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et le balayage des lames, suivi de l’analyse des données, avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre. 
En utilisant cette méthode, la densité et le regroupement de quatre principaux types de cellules immunitaires dans l’endomètre peuvent être analysés simultanément dans une seule section de tissu. En outre, cet article traitera des facteurs critiques et du dépannage pour surmonter les interférences possibles de fluorophores entre les sondes fluorescentes appliquées. Il est important de noter que les résultats de cette technique de coloration multiplex peuvent aider à fournir une compréhension approfondie de l’interaction immunologique et de la régulation lors de l’implantation embryonnaire.

Le processus schématique global d’exécution d’un test multiplex à 4 couleurs pour la détection de 4 types de cellules immunitaires de l’endomètre est illustré à la figure 1. En bref, le protocole pour cette coloration par immunofluorescence multiplex nécessitait 8 étapes clés: 1. Préparation des lames, 2. Récupération de l’épitope, 3. Blocage, 4. Application d’anticorps primaires, 5. Application d’anticorps secondaires, 6. Amplification du signal, 7. Retrait de l’...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Malgré les progrès de l’immunohistochimie multiplexe et de l’imagerie multispectrale, caractériser la densité et le regroupement simultané des principales cellules immunitaires dans l’endomètre reste un défi. Cet article décrit un protocole de coloration multiplex détaillé et une imagerie pour la localisation simultanée de quatre types de cellules immunitaires dans l’endomètre.

Coloration immunohistochimique fluorescente multiplexée de quatre types de cellules immunitaires de l’endomètre lors d’une fausse couche récurrente

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

La technologie actuelle permet l’utilisation d’anticorps élevés chez la même espèce pour détecter jusqu’à sept marqueurs. Loucia Chan, une technicienne du laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par préparer les lames de verre en paraffine fixées au formol montées avec l’échantillon de tissu, en plaçant les lames à plat dans un four, pour cuire à 60 degrés Celsius avec le tissu tourné vers le haut.Après une heure, décirez et réhydratez les lames toutes les 10 minutes chacune avec la série de produits chimiques, comme décrit dans le manuscrit. Immergez les lames dans une solution saline tamponnée tris, puis dans une boîte à lames en plastique remplie d’un mélange de formaldéhyde dilué dans du méthanol, pour fixer les échantillons. Ensuite, lavez les lames deux fois dans de l’eau désionisée pendant deux minutes.Procéder à la récupération de l’épitope, en plaçant le rack de lames dans une boîte de résistance à la chaleur remplie de tampon d’acide citrique à pH 6,0. Et puis placer la boîte au micro-ondes, pour chauffer les lames d’abord à 100% de puissance pendant 50 secondes, puis 20 minutes à 20% de puissance, pour maintenir la même température. Après avoir rincé les lames à l’eau distillée et les avoir lavées avec tbST, immergez la lame dans un bocal contenant une solution bloquant la peroxydation pendant 10 minutes.Après l’incubation, rincez les lames à l’eau distillée et lavez-les avec tbST, puis utilisez un stylo barrière hydrophobe pour marquer une limite autour de la section tissulaire sur la lame. Rincez ensuite la lame dans TBST, couvrez les sections de tissu avec le tampon bloquant et incubez les lames dans une chambre humidifiée pendant 15 minutes. Pour éliminer les réactifs bloquants, incuber d’abord les lames avec l’anticorps primaire d’intérêt, puis retirer l’anticorps primaire en lavant les lames trois fois avec tbST, avant l’incubation avec l’anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort polymère.Après l’incubation, lavez les lames avant d’appliquer la flore opale pour la solution de travail TSA, puis rincez la lame avec le tampon de récupération de l’antigène. Effectuez le décapage à base de micro-ondes en chauffant les lames dans un tampon de récupération d’antigène dans un micro-ondes à 100% de puissance, pendant 50 secondes, suivi de 20% de puissance pendant 20 minutes dans les récipients de sécurité au micro-ondes. Après avoir refroidi les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes, rincer les lames à l’eau distillée et au TBST, puis incuber avec une solution de soupe pendant cinq minutes.Ensuite, séchez la glissière à l’air libre avant de la monter avec le support de montage approprié. Avant l’imagerie des diapositives, préréglez les filtres appropriés dans le poste de travail. Capturez un minimum de 10 champs pour une analyse inférieure à un grossissement de 200 fois.Pour compter les cellules, cliquez sur le bouton Compter les objets dans la barre d’étapes, pour afficher le panneau des paramètres de comptage d’objets. Si le tissu a été segmenté, sélectionnez la catégorie de tissu dans laquelle les objets se trouvent. Sélectionnez ensuite la mise à l’échelle de signal souhaitée à partir de l’échelle automatique ou de l’échelle fixe.Pour la segmentation des objets, sélectionnez le composant principal dans la liste déroulante. Pour détecter les objets touchant d’autres objets en tant qu’objets individuels et non combinés, cochez la case taille maximale et pixels, puis optez pour le fractionnement affiné. Ensuite, comptez toutes les cellules stromales dans les cellules immunitaires séparément, pour exprimer les données en pourcentage des cellules immunitaires par rapport au nombre total de cellules stromales pour chaque image capturée.Plus tard, indiquez le nombre final de cellules comme une moyenne de tous les champs. À l’aide de l’éditeur de vues, examinez le post-traitement des tables de données résultantes, puis exportez la table de données de comptage. Dans l’analyse représentative, quatre types de cellules immunitaires dans l’échantillon d’endomètre sont différenciés.L’image traitée montre la segmentation des tissus sous forme de compartiments épithéliaux et stromaux. L’immunocoloration multiplex a été réalisée sur les biopsies de l’endomètre d’une femme témoin fertile et d’une femme présentant une fausse couche récurrente inexpliquée, un seul étage pour nous représentant CD3, CD56, CD68 et CD20 ont été révélés dans l’immunocoloration. Une fois que le son immunitaire a été identifié, une coloration supplémentaire sous la cytokine peut aider à traiter leur interaction et leur mécanisme de réussite de l’implantation.

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